UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA DAS

RELAES PARASITO-HOSPEDEIRO

MARCO VTOR SILVA DE MELO COSTA

ANLISE BIOQUMICA DA NICLOSAMIDA NO

METABOLISMO DE CISTICERCOS DE TAENIA CRASSICEPS

Goinia

2015
II
 MARCO VTOR SILVA DE MELO COSTA

ANLISE BIOQUMICA DA NICLOSAMIDA NO

METABOLISMO DE CISTICERCOS DE TAENIA CRASSICEPS

Dissertao de Mestrado
apresentado ao Programa de Ps-
Graduao em Biologia das Relaes
Parasito-Hospedeiro da Universidade
Federal de Gois para obteno do
Ttulo de Mestre

Orientador: Dr. Marina Clare

Vinaud
Co-orientador: Dr Tatiane Luiza da
Costa

Goinia
2015

III
IV
I

Programa de Ps-Graduao em Biologia das Relaes Parasito-

Hospedeiro da Universidade Federal de Gois

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAO DE MESTRADO

Aluno (a): Marco Vtor Silva de Melo Costa

Orientador (a): Dr Marina Clare Vinaud

Co-orientador (a): Dr Tatiana Luiza da Costa

Membros:
1. Dr. Marina Clare Vinaud

2.Dr. Luciana Damacena Silva

3.Dr. Jos Clecildo Barreto Bezerra

Data: 09/03/2015

V
VI
 DEDICATRIA

Em especial minha esposa, Denise Borella de S. Costa, e aos meus

pais, Marco Antnio de M. Costa e Sinalva S. de M. Costa.

VII
 AGRADECIMENTOS

Quando se pensa na trajetria percorrida at aqui inevitvel no

pensar com apreo e gratido pelas pessoas que contriburam direta ou

indiretamente pela concluso de mais essa etapa em minha vida.

Gostaria de expressar meus sinceros agradecimentos aos meus pais,

Marco Antnio de Melo Costa e Sinalva Silva de Melo Costa, por terem

possibilitado a escolha no caminho do conhecimento. Eu no canso de dizer-

lhes que foi o maior bem que poderiam me oferecer. E a minha irm, Luara

Silva de Melo Costa, por tambm ter auxiliado em muitos momentos

fornecendo a privacidade de sua casa e seus dotes culinrios.

minha esposa, Denise Borella de Sousa Costa, por ter me apoiado,

compreendido e me fornecido todo equilbrio emocional e intelectual para a

concluso desse projeto. Enfim, a ela cabe o lugar de companheira da minha

vida.

minha orientadora, Dr Marina Clare Vinaud, por ter me dado o voto

de confiana em me orientar, mesmo no conhecendo minha vida

acadmica, como me comportaria na relao orientador-orientado e em

relao ao grupo de trabalho. Alm disso, me ensinou a portar-se com

pacincia e serenidade s frustaes transcorridas no desenvolvimento do

mestrado. A ela o meu sincero agradecimento.

Ao pessoal do meu trabalho no Biotrio, em especial a Iraci, Gildenice

e o Raimundo por sempre est disponvel em me substituir para que

cumprisse as minhas obrigaes acadmicas, e a Vnia pelas conversas e

discusses sobre a execuo do projeto.

VIII
 A toda equipe do LAERPH por serem bem receptivos e disponveis

para auxiliar e apoiar com as tarefas a serem realizadas no laboratrio e as

anlises informais sobre o desenvolvimento do mestrado. Em particular a Dr

Carolina Fraga por me auxiliar na prtica e obteno dos dados no HPLC. E

aos Professores Dr. Jos Clecildo Barreto Bezerra e a Dr. Ana Maria de

Castro pelos conselhos e experincias passadas de forma admirvel.

Assim, peo desculpas aos nomes no citados nessa humilde

declarao de reconhecimento pela ajuda e presteza a mim disponibilizadas,

pois por motivos bvios no me vem cabea todos os nomes e nem todas

as contribuies dadas a mim, mas saibam que os meus sentimentos so de

pura gratido a todas essas pessoas.

IX
 SUMRIO

1. TABELAS, FIGURAS E ANEXOS................................................................. XI

1.1. Lista de Figuras ........................................................................................... XI
1.2. Lista de Tabelas........................................................................................... XI
1.3. Lista de Anexos .......................................................................................... XII
2. SMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS .................................................XIII
3. RESUMO.......................................................................................................... XV
4. ABSTRACT ................................................................................................... XVII
5. INTRODUO / REVISO DA LITERATURA .............................................. 1
5.1. Caractersticas de Taenia .............................................................................. 1
5.2. Caracterstica de Taenia crassiceps .............................................................. 4
5.3. Niclosamida (5-chloro-N-(2-chloro-4-nitrophenyl)-2-hydroxybenzamide) 10
5.4. Metabolismo ................................................................................................ 13
6. JUSTIFICATIVA ............................................................................................... 18
7. OBJETIVOS ....................................................................................................... 20
7.1. Objetivo geral .............................................................................................. 20
7.2. Objetivo especficos .................................................................................... 20
8. MTODOS ......................................................................................................... 21
8.1. Manuteno do ciclo biolgico da T. crassiceps ........................................ 21
8.2. Tratamento dos cisticercos com diferentes dosagem de Niclosamida ........ 22
8.3. Anlise bioqumica dos cisticercos ............................................................. 23
8.4. Anlise Estatstica ....................................................................................... 24
9. RESULTADOS e DISCUSSO ........................................................................ 25
10. CONCLUSES .............................................................................................. 33
11. RECOMENDAES ..................................................................................... 34
12. REFERNCIAS.............................................................................................. 35
13. ANEXOS ........................................................................................................ 40
13.1. Anexo 1 Parecer do Comit de tica, TCLE ........................................ 40
13.2. Anexo 2 - Cromatogramas....................................................................... 41

X
1. TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

1.1. Lista de Figuras

Figura 1. Ciclo biolgico de Taenia crassiceps .................................................... 5

Figura 2. Estrutura qumica do praziquantel......................................................... 9

Figura 3. Estrutura qumica do Albendazol ......................................................... 10

Figura 4. Estrutura da Niclosamida ...................................................................... 11

Figura 5. Estrutura qumica do Dinitrofenol ........................................................ 11

Figura 6. Via de degradao da glicose pelo cisticerco de Taenia crassiceps.

................................................................................................................................... 16

Figura 7. Via de degradao da glicose em anaerobiose. ............................... 17

Figura 8. Placa do tratamento do cisticerco de Taenia crassiceps (cepa ORF)

com Niclosamida ..................................................................................................... 22

1.2. Lista de Tabelas

Tabela 1. Concentrao de cidos orgnicos (uM) secretado/excretado (S/E)

no meio de cultura por cisticercos de Taenia crassiceps expostos in vitro a
diferentes concentraes de niclosamida mdia e desvio padro (). ....... 31

Tabela 2. Concentrao mdias (uM) de cidos orgnicos no lquido intra-

vescular extrado dos cisticercos por cisticercos de Taenia crassiceps
presentes no meio de cultura (RPMI) expostos in vitro a diferentes
concentraes de niclosamida.............................................................................. 32

XI
1.3. Lista de Anexos

Cromatograma 1. Deteco in vitro de cidos orgnicos

secretados/excretados por cisticercos em estdio larval do grupo controle 1
(somente RPMI) ...................................................................................................... 41

Cromatograma 2. Deteco in vitro de cidos orgnicos

secretados/excretados por cisticercos em estdio larval do grupo controle 2
(Meio de cultura RPMI e cisticerco) ..................................................................... 41

Cromatograma 3. Deteco in vitro de cidos orgnicos

secretados/excretados por cisticercos em estdio larval do grupo controle 3
(Meio de cultura RPMI, cisticerco e etanol) ........................................................ 42

Cromatograma 4. Deteco in vitro de cidos orgnicos

secretados/excretados por cisticercos em estdio larval do grupo com 3 uM
de Niclosamida (Meio de cultura RPMI, cisticerco e 3 uM de Niclosamida) . 42

Cromatograma 5. Deteco in vitro de cidos orgnicos

secretados/excretados por cisticercos em estdio larval do grupo com 2 uM
de Niclosamida (Meio de cultura RPMI, cisticerco e 2 uM de Niclosamida) . 43

Cromatograma 6. Deteco in vitro de cidos orgnicos

secretados/excretados por cisticercos em estdio larval do grupo com 1 uM
de Niclosamida (Meio de cultura RPMI, cisticerco e 1 uM de Niclosamida) . 43

Cromatograma 7. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por

cisticercos em estdio larval do grupo controle 2 (Cisticerco processado
cultivado anteriormente em meio RPMI). ............................................................ 44

Cromatograma 8. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por

cisticercos em estdio larval do grupo controle 3 (Cisticerco processado
cultivado anteriormente em meio RPMI e etanol) .............................................. 44

Cromatograma 9. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por

cisticercos em estdio larval do grupo com 3 uM de Niclosamida (Cisticerco
processado cultivado anteriormente em meio RPMI e 3 uM de Niclosamida)
................................................................................................................................... 45

Cromatograma 10. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por

cisticercos em estdio larval do grupo com 2 uM de Niclosamida (Cisticerco
processado cultivado anteriormente em meio RPMI e 2 uM de Niclosamida)
................................................................................................................................... 45

Cromatograma 11. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por

cisticercos em estdio larval do grupo com 1 uM de Niclosamida (Cisticerco
processado cultivado anteriormente em meio RPMI e 2 uM de Niclosamida)
................................................................................................................................... 46

XII
 2. SMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

AIDS acquired immunodeficiency syndrome (Sndrome da imudeficincia

adquirida)

ANOVA analise of variance (anlise de varincia)

ATP adenosine tryphosphate (adenosina trifosfato)

CLAE cromatografia lquida de alta eficincia

CoA Coenzima A

CoEp/UFG: Comit de tica em Pesquisa da Universidade Federal de Gois

DNA deoxyribonucleic acid (cido desoxirribonucleico)

DNP dinitrophenol (dinitrofenol)

ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Enzima imuno ensaio)

HCl cido cloridrco

HIV - human immunodeficiency vrus (Vrus da imunodefecincia humana)

HPLC high performance liquid chromatography (cromatografia lquida de

alta eficincia)

H2SO4 cido sulfrico

IPTSP/UFG Instituto de Patologia Tropical e Sade Pblica / Universidade

Federal de Gois

M Molar = mol por litro (mol/L)

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide + 1 prton de Hidrognio (H+)

(Dinucleotideo de nicotinamida e adenina)

ND no detectado

OAA - oxaloacetato

ORF original fox

PEP phosphoenolpyruvate (fosfoenolpiruvato)

PEPCK phosphoenolpyruvate carboxykinase (fosfoenolpiruvato

carboxiquinase)

SARS Severe acute respiratory syndrome (Sndrome respiratria aguda

grave)

XIII
SBCAL Sociedade Brasileira de Cincia em Animais de Laboratrio

SE secreo/ excreo

Th1 T helper1 (Linfcito T auxiliares do tipo1)

RPMI meio de cultura desenvolvido em Roswell Park Memorial Institute

XIV
 3. RESUMO

Os estudos experimentais com o parasito Taenia crassiceps tm

demonstrado alteraes nas vias metablicas (energtica e respiratria)

desse parasito, em resposta ao tratamento com frmacos. A utilizao de

Taenia crassiceps como modelo experimental oferece condies de se

reproduzir a neurocisticercose, uma das formas mais graves da cisticercose

humana. Este estudo tem como objetivo analisar a influncia in vitro do

frmaco anti-helmintico niclosamida, sobre o metabolismo de carboidratos e

cidos graxos de cisticercos de Taenia crassiceps (cepa ORF). Na

realizao deste estudo foram usados cisticercos em estgios larval de T.

crassiceps (cepa ORF) e meio de cultura RPMI suplementado (Gibco).

Foram utilizados 100 cisticercos, que foram alocados em placas de

microcultura contendo seis poos, expostos ou no a niclosamida (1, 2 e 3

uM). Os grupos controle foram compostos por cisticercos no expostos ao

frmaco e ao etanol na concentrao utilizada para diluir o frmaco. Em

seguida as placas foram estufa a 37C por 24 horas. Aps esse perodo,

os cisticercos foram retirados da cultura e ambos, parasito e meio de cultura,

foram congelados em nitrognio lquido. Na sequncia os cisticercos foram

processados para anlise em HPLC. De acordo com o mecanismo de ao

do frmaco, ou seja, interferncia na cadeia transportadora de eltrons, nas

concentraes utilizadas, observou-se uma alterao na secreo/ excreo

do cido orgnico succinato. As outras vias metablicas no foram

influenciadas pela ao deste frmaco. Portanto, conclui-se que a

XV
niclosamida apresenta baixa influencia no metabolismo dos cisticercos nas

concentraes utilizadas.

Palavras chave: cidos orgnicos, Taenia crassiceps, metabolismo,

niclosamida.

XVI
 4. ABSTRACT

Experimental studies with Taenia crassiceps have been used to demonstrate its

metabolic alterations in biochemical pathways (energetic and respiratory) in response

to the presence of drugs. The use of T. crassiceps as an experimental model offers

conditions to reproduce the neurocysticercosis infection one of the most severe form

of human cysticercosis. This study aimed the analysis of the in vitro influence of

niclosamide, an antihelminthic drug, on the metabolism of carbohydrates and fatty

acids of T. crassiceps cysticerci (ORF strain). 20 larval stage cysticerci were cultured

into 5mL of RPMI (Gibco) supplemented culture media, in 6 well culture plates,

exposed or not to niclosamide (1, 2, and 3 uM). The control groups were

performed with cysticerci not exposed to the drug, exposed to ethanol in the

concentration used to dissolve the drug. The cysticerci were cultured at 37C

for 24 hours. After this period the cysticerci were removed from the culture

medium and both were frozen with liquid nitrogen. Afterward, the samples

were processed for the HPLC analysis. Accordingly to the mode of action of

this drug, which is to interfere in the electrons chain transport, the succinate

concentrations were altered in the secretion/excretion of this parasite.

Therefore, it is possible to conclude that in the concentrations used, this drug

caused little alteration in the metabolic pathways of the parasite.

Key words: oganic acids, Taenia crassiceps, metabolism,

niclosamide

XVII
 5. INTRODUO / REVISO DA LITERATURA

5.1. Caractersticas de Taenia

O gnero Taenia (Linnaeus) (Verster 1758) inclui parasitos de mamferos

carnvoros, que usam como hospedeiros definitivos, e herbvoros (ou onvoros),

como hospedeiros intermedirios. Os seres humanos infectam-se por ovos e

formas larvais (de vrias espcies), causando tenases ou cisticercose,

respectivamente. A transmisso do parasito de um hospedeiro a outro segue um

caminho trfico via ingesto. No entanto, as espcies do gnero Taenia so

nicas entre o Cestoda ao exigir dois hospedeiros mamferos obrigatrios para a

transmisso e concluso do ciclo de vida. Assim, o ovo ingerido pelo herbvoro ou

onvoro atravessa a parede do intestino delgado e migra como oncosfera por via

linftica ou hematognica at rgos e cavidades onde se desenvolve em larva

metacestoide que ingerido pelo carnvoro, o cestoide amadurece no carnvoro e

libera ovos embrionados (Hoberg et al. 2000; Hoberg 2006).

Taenia um dos dois gneros na famlia Taeniidae que pertence ordem

Cyclophyllidea, classe Cestoda e filo Platyhelminthes. O outro gnero nessa

famlia Echinococcus, que tambm de importncia como causa de morbidade

em humanos e animais pecurios (Jenkins et al. 2005; Jia et al. 2010; Thompson

2008). As espcies que desenvolvem em parasitos adultos de Taenia em

humanos incluem T. saginata Goeze (1782), T. asiatica Eom & Rim (1993) e T.

solium Linnaeus (1758), com as seguintes espcies zoonticas capazes de

desenvolver suas formas larvais tambm encontrados em seres humanos: T.

1
taenia (Batsch, 1786), T. crassiceps (Zeder, 1800), T. multiceps Leske (1780), e

T. serialis (Gervais, 1847). Vrias espcies de Taenia causam problemas de

sade significativos e prejuzos socioeconmicos considerveis quando infectam

seres humanos e animais (Murrell et al. 2005).

As infeces com Taenia saginata, Taenia saginata asiatica e Taenia

solium so as nicas em que seus ciclos de vida so dependentes de seres

humanos como o nico hospedeiro definitivo. Alm disso, os ciclos de vida so

dependentes da ligao entre os seres humanos e bovinos (T. saginata) e sunos

(T. solium e T. s. asiatica), de modo que qualquer interrupo destas ligaes

pode resultar na eliminao do parasito. Enquanto isso, aparentemente a

preveno e controle das tenases e cisticercose devem ser simples e prtico, a

realidade que elas provaram-se quase intratveis em muitas reas por causa da

disseminao de grande sucesso e caractersticas reprodutivas do parasito e por

fatores culturais bem enraizados dos hospedeiros humanos (Flisser et al. 2005).

A infeco por T. solium uma importante zoonose em muitos pases onde

os cidados se alimentam de carne de porco e geralmente associada ao baixo

desenvolvimento econmico. A prevalncia da infeco por T. solium varia muito

de acordo com o nvel de saneamento, prticas de criao de sunos e hbitos

alimentares de uma regio. muito difcil avaliar a prevalncia de tenases por T.

solium, porque os mtodos utilizados para o levantamento coproscpico so to

ineficientes e, geralmente, no consegue diferenciar entre infeces por T. solium

e T. saginata. Portanto, os dados sobre a prevalncia de infeces por helmintos

adultos so geralmente considerados muito conservadores. Da mesma forma,

dados de prevalncia com base em mtodos sorolgicos podem superestimar as

2
taxas de infeco porque a presena de anticorpos pode ser o resultado de

exposio a ovos e infeco inicial, mas no persistente (Murrell et al. 2005)

A tenase provocada pela presena da forma adulta de T. solium ou T.

saginata no intestino delgado humano. A cisticercose ocasionada pela presena

da forma metacestdea ou cisticerco nos tecidos dos seus hospedeiros

intermedirios (Flisser et al. 2006). Desse modo, alm de ser o hospedeiro

definitivo, o homem pode ser infectado pelos ovos da T. solium desenvolvendo

assim a cisticercose, cuja sintomatologia depender dos locais de instalao e

desenvolvimento dos cisticercos (Vianna et al. 1991; Takayanagui & Odashima

2006). A neurocisticercose (NC) humana a infeco do sistema nervoso central

(SNC) pela forma metacestdea de T. solium, constitui uma das principais causas

de epilepsia e desordens neurolgicas em muitas naes. A NC tem considervel

impacto social em reas endmicas (Hotez et al. 2008; Flisser et al. 2006).

As infeces por T. saginata em casos sintomticos podem manifestar: dor

abdominal, nasea, fraqueza, perda de peso, apetite aumentado, cefaleia,

constipao intestinal, vertigem, diarreia, prurido anal e excitao. Nos casos

mais tpicos, aps um perodo de incubao de dois ou trs meses, surgem

perturbao gastrintestinais, principalmente diarreia e dor epigstrica com carter

de dor de fome. Na infeco por T. solium no ocorre complicaes, como

apendicites ou outras devidas aos helmintos adultos. O quadro clnico, quando

presente semelhante ao da T. saginata. A gravidade desta infeco decorre do

homem poder ser o hospedeiro intermedirio. A doena resultante a cisticercose

humana podendo decorrer dela a neurocisticercose, oftalmocisticercose e a

cisticercose disseminada, sendo as duas primeiras consideradas doenas de

consequncias severas ou de alto risco ao infectado (Rey 2008).

3
5.2. Caracterstica de Taenia crassiceps

O parasito T. crassiceps usado como modelo experimental amplamente

manipulado do gnero Taenia. um parasito cestide de animais selvagens e

domsticos, que acidentalmente pode afetar os seres humanos. A proliferao

assexuada por brotamento um atributo til de cisticercos de T. crassiceps, o que

permite s diferentes cepas serem mantidas indefinidamente na cavidade

peritoneal de camundongos isotipos (Willms & Zurabian 2010).

Um nmero de cepas de T. crassiceps tem sido isolado para expanso em

laboratrio, entre elas esto HYG, KBS, Toi, a cepa mutante ORF e, mais recente

do que as outras citadas, a cepa WFU obtida de uma infeco de roedor

selvagem na Amrica do Norte (Everhart et al. 2004).

Nos ltimos 50 anos, os resultados experimentais usando estdios larvais e

adultos de T. crassiceps renderam muitas informaes sobre a morfologia,

infectividade, dinmica de proliferao, resposta imune do hospedeiro e pesquisa

de vacinas que tm contribudo para o nosso conhecimento da biologia dos

cestoides (Willms & Zurabian 2010).

No ciclo de vida desse parasito (Figura 1), os candeos silvestres e/ou

domsticos abrigam os helmintos adultos no intestino delgado, os ovos

infectantes so liberados nas fezes os quais podem ser ingeridos por roedores

silvestres, as oncosferas ao chegarem ao trato digestrio, atravessam o epitlio

intestinal e liberam o embrio hexacanto que penetra na mucosa e migra por via

hematognica e linftica, at se alojar em um determinado rgo ou cavidade,

normalmente so as regies subcutnea, cavidades pleural e abdominal,

musculatura, sistema nervoso central e globo ocular, onde o embrio desenvolve-

4
se em larva metacestide ou cisticerco que se multiplica por diversos brotamentos

formados a partir de sua membrana externa (Esch & Smyth 1976; Freeman 1962;

Shimalov & Shimalov 2003).

A deteco da forma larval pode ocorrer de 12 dias aps a ingesto dos

ovos. Cerca de 4 semanas aps o aparecimento dos brotamentos, estes se

destacam do cisticerco. A cepa ORF mesmo possuindo o canal do esclex no

possuem o esclex na maioria dos brotamentos impossibilitando a progresso

para o helminto adulto, porm continuam com a capacidade de executar a

reproduo por brotamento. A eficincia na reproduo por brotamento

notavelmente aumentada com o tempo. As larvas metacestides podem ser

ingeridas pelo hospedeiro definitivo, se desenvolvendo no helminto adulto entorno

de 30 a 70 dias aps a infeco. Depois de 5 a 6 semanas de infeco os ovos ou

as proglotes com os ovos podem ser encontradas nas fezes. Esta infeco pode

se manter por at 9 meses no hospedeiro definitivo, evoluindo para a cura

espontnea (Figura 1) (Freeman 1962; Maillard et al. 1998).

Figura 1. Ciclo biolgico de Taenia crassiceps (1) candeos, intermedirios (3) -

roedores, e paratnicos (5) - mamferos como o homem, lmures e animais domsticos
(Adaptado de Vinaud et al. 2007)

5
 Os cisticercos, geralmente encontrados em grande nmero, podem ser

colhidos e injetados na cavidade peritoneal de camundongos isotipos e mantidos

indefinidamente por sries de sub-inoculaes (Esch & Smyth 1976; Freeman

1962; Shimalov & Shimalov 2003),

Em grande interesse para a pesquisa na biologia de parasitos da familia

Taeniidae a capacidade da fase larval de multiplicar-se assexuadamente por

brotamento no hospedeiro intermedirio. Cerca de 11 espcies de um total de 45

pertencentes ao gnero Taenia apresentam reproduo assexuada na fase

metacestide (Hoberg et al. 2000; Hoberg 2006). Tal caracterstica tem sido

extensivamente utilizada desde as primeiras descries por Freeman (1962), que

demostrou que o brotamento exgeno dos estgios larvais promove o

crescimento exponencial do parasito. Em contraste com outros helmintos

amplamente estudados, como T. solium, T. saginata, Hymenolepis nana e

Echinococcus granulosus; T. crassiceps no parasitam os seres humanos

facilmente (Heldwein et al. 2006). Em consequncia tornou-se um modelo

experimental til no laboratrio, resultando em mais de 481 publicaes ao longo

dos ltimos 50 anos (National Center for Biotechnology Information NCBI -

acessado em 12/12/2014).

Alm disso, os antgenos e antgenos recombinantes de T. crassiceps

demonstraram induzir altos nveis de proteo contra cisticercose experimental de

T. crassiceps em murinos, um modelo experimental utilizado com sucesso para

testar antgenos candidatos para uso em vacinas contra cisticercose suna por T.

solium. A reao cruzada entre antgenos de T. solium e T. crassiceps tm sido

claramente demonstrada em outros estudos (Larralde et al. 1990; Espndola et al.

2000).

6
 A vacinao com antgenos de T. solium protegeu camundongos contra

uma infeco com T. crassiceps, demonstrando que camundongos BALB/b

machos imunizados com extrato de antgeno de T. solium ou T. crassiceps foram

completamente protegidos contra a infeco com cisticercos. E enquanto, a

proteo apenas parcial foi alcanada nos camundongos suscetveis da linhagem

BALB/c. A cisticercose suna foi diagnosticada atravs de ELISA indireto, por

meio de um antgeno heterlogo de T. crassiceps, ou seja, que derivam de outras

espcies (Biondi et al. 1996) e vrias preparaes antignicas de T. crassiceps

tm sido utilizadas no diagnstico da neurocisticercose humana (Willms &

Zurabian 2010).

A utilizao de antgenos recombinantes foi descrita, KETc1, KETc12 e

peptdeos sintetizados, obtidos a partir da cepa ORF, para imunizar camundongos

e descobriu-se que a imunizao com a KETc1 induzia de 66,7% a 100% de

proteo contra a cisticercose em murinos, e a imunizao com KETc12 induzia

52,7-88,1% de proteo. A resposta imunolgica obtida indicou que ambos os

peptdeos contm pelo menos um eptopo de clula B e um eptopo de clula T

que estimulou fortemente a proliferao de clulas T ativadas com o antgeno de

peptdeo livre ou total de cisticercos de T. crassiceps. A elevada quantidade de

clulas do bao expressando citocinas inflamatrias sugere o envolvimento de

uma resposta Th1 na resposta imune. A capacidade de proteo dos peptdeos e

sua presena em fases larval e adulta de T. solium indicam que estes dois

eptopos so fortes candidatos para uso em uma vacina sinttica contra

cisticercose por T. solium (Sciutto et al. 2002; Toledo & Fragoso 2001).

H vrias espcies de animais como os ratos, ratazanas, coelhos,

marmotas, lmures, ces e gatos domsticos que podem ser acometidos pelos

7
cisticercos de T. crassiceps (Freeman 1962). O homem pode ser parasitado

servindo como hospedeiro acidental desenvolvendo cisticercose. O aumento da

incidncia de casos em humanos pode ser devido principalmente presena de

animais domsticos infectados com o helminto adulto de T. crassiceps podendo

ocorrer em indivduos imunocomprometidos e imunocopetentes (Arocker-

Mettinger et al. 1992; Heldwein et al. 2006; Ntoukas et al. 2013). Nos casos

relatados de cisticercose humana por T. crassiceps a grande parte dos pacientes

apresentam imunodepresso devido aos tratamentos quimioterpicos ou infeco

por HIV/AIDS. Nesses casos foram receitados como medicamentos o albendazol

e praziquantel, sendo bem-sucedido em eliminar a infeco (Chermette et al.

1995; Franois et al. 1998; Heldwein et al. 2006).

A utilizao de albendazol e prazinquantel o recomendado como

tratamento de escolha para cisticercose causada por larva de T. solium ou

Cysticercus cellulosae, administrados de acordo com uma escolha adequada dos

pacientes e com um diagnstico confivel. O praziquantel pertence ao grupo das

isoquinolinas e derivados, os quais so compostos aromticos policclicos

contendo uma poro isoquinolina, que consiste de um anel de benzeno fundido

com um anel piridina e formando benzo[c]piridina (Figura 2). O praziquantel efetua

a permeabilidade da membrana celular, resultando na contrao de Schistosoma

adultos. A frmaco provoca ainda mais a vacuolizao e desintegrao do

tegumento de Schistosoma sp. . O efeito mais acentuado em helmintos adultos

do que em helmintos em estgios larvais. Um aumento do influxo de clcio pode

desempenhar um papel importante. Os efeitos secundrios so a inibio da

absoro de glicose, reduo dos nveis de glicognio e estimulao da liberao

de lactato. A ao do praziquantel limitada especificamente para Trematdeos e

8
Cestides. Nematides (incluindo filrias) no so afetados. (Doenhoff et al.

2008).

Figura 2. Estrutura qumica do praziquantel. (Frayha et al. 1997)

O albendazol (Figura 3) um anti-helmntico benzimidazol de grande

espectro, estruturalmente relacionado com o mebendazol que eficaz contra

muitas doenas. Os benzimidazois so compostos orgnicos contendo um anel

de benzeno fundido com um anel de imidazol (anel de cinco membros contendo

um tomo de azoto, de 4 tomos de carbono, e duas ligaes duplas). indicado

para o tratamento da neurocisticercose parenquimatosa devido a leses ativas

causadas por formas larvais de T. solium e para o tratamento da hidatidose cstica

do fgado, pulmo e peritnio, causada pela forma larval de E. granulosus. O

modo de ao principal do albendazol pelo seu efeito inibitrio sobre a

polimerizao da tubulina que resulta na perda de microtbulos citoplsmicos.

Este frmaco causa alteraes degenerativas no tegumento e clulas intestinais

do helminto atravs da ligao ao local sensvel colchicina da tubulina, inibindo

assim a sua polimerizao ou montagem em microtbulos. A perda dos

microtbulos citoplasmticos leva a absoro prejudicada de glicose pelos

estgios larvais e adultos dos parasitos suscetveis, e esgota as suas reservas de

glicognio. As alteraes degenerativas no retculo endoplasmtico, as

mitocndrias da camada germinal, e a subsequente liberao de lisossomas

9
resulta na diminuio da produo de trifosfato de adenosina (ATP), que a

energia necessria para a sobrevivncia do helminto. Devido diminuio da

produo de energia, o parasita imobilizado e eventualmente morre. (Haque et

al. 1993; Oxberry et al. 2000; Ramrez et al. 2001).

Figura 3. Estrutura qumica do Albendazol (DrugBanK acessado 30/03/2015 as 21:40h

em http://moldb.wishartlab.com/molecules/DB00518/image.png)

5.3. Niclosamida (5-chloro-N-(2-chloro-4-nitrophenyl)-2-

hydroxybenzamide)

A Niclosamida (Figura 4) um derivado halogenado da salicilamida. um

frmaco com ao anti-helmntica utilizada por cerca de 50 anos para tratar a

maioria das infeces intestinais causadas por T. solium, T. saginata,

Hymenolepis nana, H. diminuta, Dipylidium caninum e Diphyllobothrium latum.

Apesar de no ser eficiente contra cisticercose ou hidatidose. Alm de ser usado

como moluscicida para o tratamento de gua em programas de controle da

esquistossomose (Frayha et al. 1997; Weinbach & Garbus 1969).

10
 Figura 4. Estrutura da Niclosamida (DrugBanK, acessado em 07/02/2015 as 20:30h em
http://moldb.wishartlab.com/molecules/DB06803/image.png)

Existem evidncias considerveis de que a niclosamida interfere com o

metabolismo energtico de helmintos, inibindo a formao dos microtbulos

atravs do bloqueio da captao de glicose, resultando na depleo de glicognio

do parasito. Isso ocorre possivelmente pela inibio da produo de adenosina

trifosfato (ATP), necessrios para a sobrevivncia e reproduo dos parasitos.

Isto pode ser devido inibio do frmaco fosforilao oxidativa ou a

propriedade dela de estimular ATPase. Nota-se que a niclosamida possui uma

semelhana estrutural com o dinitrofenol (DNP), demonstrado na Figura 5, que

lhe permite desacoplar a fosforilao oxidativa na mitocndria do parasito durante

o transporte de eltrons do NADH para flavoprotena (Frayha et al. 1997; Philip

2015).

Figura 5. Estrutura qumica do Dinitrofenol (DrugBank acessado 09/04/2015 as 18:45h

em http://moldb.wishartlab.com/molecules/DB04528/image.png)

11
 A consequncia a paralisia e morte dos helmintos, os quais so

eliminados com as fezes. A niclosamida no interfere no metabolismo da glicose

no homem devido o sistema microtubular das clulas do hospedeiro ser diferente

daquele dos helmintos. A niclosamida apresenta absoro insignificante pelo trato

gastrintestinal, permanecendo por perodo prolongado em contato com os

parasitas intestinais. eliminada pelas fezes na forma inalterada (Philip 2015).

H descoberto que a niclosamida ativa contra as clulas cancergenas,

embora o seu mecanismo de ao antitumoral exato no seja totalmente

compreendido. As evidncias sugerem que a niclosamida possui mltiplas vias de

sinalizao a maioria dos quais esto intimamente envolvidos com a proliferao

de clulas-tronco do cncer (Pan et al. 2012).

H tambm na literatura relatos da ao da niclosamida ser capaz de inibir

a replicao de um coronavirus causador do SARS. Alm de alguns compostos

derivados inibirem a replicao do vrus da gastroenterite transmissvel em sunos

(Krtk & Vinsov 2011). No trabalho de Brett et al. (2003) evidenciaram-se

tambm a interao da niclosamida com DNA sugerindo que sua toxicidade pode

ser causada por essa interao aps ativao redutiva que foi detectada pela

metodologia de DNA-biosensor utilizada por eles. A niclosamida tem sido

apontada para o tratamento de vrios tipos diferentes de cncer como, por

exemplo, de mama, prstata, ovrio, glioblastoma, leucemia, entre outros. Alm

de novas aplicaes para este frmaco, importante ressaltar que seu uso para

tratamentos teciduais est sendo sempre indicado em baixas concentraes,

como 1-5 uM (Fenner 2014; Li et al. 2014;Liu et al. 2014; King et al. 2014).

12
5.4. Metabolismo

Os parasitos so dependentes da disponibilidade de substncias

encontradas no organismo do hospedeiro, como carboidratos, aminocidos,

vitaminas e minerais, alm de purinas, nucleosdeos, cidos graxos, esteris e

porfirinas. Essas demandas nutricionais so adquiridas pelas clulas por meio de

difuso passiva, facilitada e transporte ativo. Os helmintos tambm podem realizar

processos de endocitose de macromolculas, como protenas para utilizao

como fonte de componentes constitucionais, como aminocidos,

monossacardeos, nucleotdeos ou lipdeos (Khler & Voigt 1988).

H grande variao na demanda de oxignio e a capacidade para

utilizao em estgios de desenvolvimento diferentes de helmintos e a situao

em uma espcie pode no ser necessariamente relevante outra espcie (Khler

& Voigt 1988).

Com base nos produtos finais da via glicoltica e seu metabolismo

adicional, helmintos parasitos podem ser classificados em trs tipos: (1) Helmintos

parasitos que usam a via glicoltica completa e exporta o produto final, o piruvato,

na mitocndria para uma maior degradao atravs do ciclo do cido

tricarboxlico. Esta degradao aerbia ocorre principalmente em estgios larvais

de cestides, trematodeos e nematides; (2) Aqueles que usam a via glicoltica

completa, mas convertem no citoplasma o seu produto final, o piruvato, para

produtos finais tais como lactato e etanol. Este processo de fermentao, a

chamada gliclise 'anaerbia', ocorre em Schistosoma spp. adultos, filarias e

outros nematdeos; (3) Aqueles que usam a via glicoltica clssica somente at

fosfoenolpiruvato (PEP). Ento, em vez de converter PEP para piruvato, PEP

13
carboxilado pela PEP carboxiquinase (PEPCK) a oxaloacetato, que

posteriormente reduzido para malato. Esta parte da via ocorre no citosol e est

em equilbrio redox produzindo 2 mols de ATP por 1 mol de glicose degradada.

Em seguida o malato transportado para dentro da mitocndria para o

metabolismo anaerbio. Esta via comum em muitos helmintos parasitos,

especialmente nos helmintos intestinais como Ascaris suum (Tielens 1994;

Komuniecki et al. 2003)

Na fase larval, o cisticerco da T. crassiceps, demonstra um comportamento

aerbio (Figura 6) in vivo dependente de oxignio que se difunde atravs dos

tecidos de seu hospedeiro. O metabolismo energtico de cestoides sofre variao

devido influncia direta da disponibilidade de oxignio no ambiente circundante

do parasito (Khler & Voigt, 1988; Arenal et al. 2001).

O catabolismo da glicose em cisticerco de T. crassiceps produz piruvato

(Figura 6) por meio da piruvato quinase sobre fosfoenolpiruvato. Esse composto

pode passar pela ao da enzima lactato desidrogenase gerando lactato, este

pode ser excretado ou usado na via da gliconeognese. Este lactato pode sofrer

a catlise da transaminase produzindo alanina, que poder ser excretada (Corbin

et al. 1998; Komuniecki et al. 2003; Zenka & Prokopic 1985).

Enfim esse mesmo piruvato pode ser usado no interior da mitocndria. O

piruvato tambm pode ser produzido na mitocndria pela enzima mlica agindo

sobre o malato. O piruvato mitocondrial convertido em Acetil-coA gerando

acetado ou citrato ao reagir com oxalacetato. Os produtos finais do metabolismo

in vitro de carboidratos em Taenia crassiceps so: lactato e alanina; e do

metabolismo respiratrio so: acetato, citrato e succinato (Corbin et al. 1998;

Komuniecki et al. 2003; Vinaud et al. 2007; Zenka & Prokopic 1985).

14
 Outro cido que integra o ciclo do cido ctrico o fumarato produzido pela

catlise da enzima fumarase no malato. A fumarato redutase pode agir sobre o

fumarato desenvolvendo uma reao inversa originando succinato. O succinato

pode doar prtrons para a cadeia respiratria em aerobiose ou pode ser

excretado em anaerobiose (Corbin et al. 1998).

Os representantes da famlia Taeniidae produz em anaerobiose (Figura 7)

o fosfoenolpiruvato podendo originar piruvato e lactato ou originar oxaloacetato

que ser transformando em malato. Este, que tem a funo de manter o equilbrio

redox, transferido mitocndria produzindo os produtos finais excretados:

propionato, acetato ou cidos graxos volteis como metilbutirato ou metilvalerato.

As fases larvais dessa famlia apresentam maiores capacidades de oxidao do

que suas respectivas fases adultas. provvel que ocorra por apresentarem

tamanhos menores em relao aos adultos que facilitaria a difuso de oxignio

pelos tecidos do parasito adicionado ao maior aporte de oxignio fornecido pelo

hospedeiro (Khler & Voigt 1988).

Em cisticercos de T. crassiceps a cadeia transportadora de eltrons

semelhante cadeia encontrada em seus hospedeiros mamferos, demonstrando

presena de citocromos bc1, c e aa3, enquanto este tipo de respirao ausente

em parasitos adultos (Del Arenal et al. 2001). Uma via respiratria alternativa no

metabolismo de cisticercos de T. crassiceps se mostra bastante complexa ao ser

resistente inibio da enzima citocromo oxidase por cianeto (Del Arenal et al.

2005).

A incapacidade de muitos helmintos de sintetizar lipdios torna-os

dependentes da captao dessas substncias do ambiente no hospedeiro

podendo ser utilizados como recurso alternativo glicose. Os cidos graxos

15
absorvidos so armazenados em triacilglicerol e fosfolipdeos situados na

membrana cstica e tegumento de cestodeos (Khler & Voigt, 1988; Vinaud et al.

2009).

Figura 6. Via de degradao da glicose pelo cisticerco de Taenia crassiceps. 1:

piruvato quinase; 2: lactato desidrogenase; 3: alanina transferase; 4: fosfoenol
piruvato carboxiquinase; 5: malato desidrogenase citoslica; 6: fumarase; 7:
fumarato redutase; 8: enzima mlica mitocondrial; 9: enzima mlica citoslica; 10:
complexo piruvato desidrogenase; 11: acetoacetato descarboxilase; 12: malato
desidrogenase mitocondrial; 13: citrato sintase (Adaptado de Corbin et al. 1998).

16
Figura 7. Via de degradao da glicose em anaerobiose. 1: piruvato
quinase; 2: fosfoenol piruvato carboxiquinase; 3: malato
desidrogenase citoplasmtica; 4: enzima mlica; 5: complexo
piruvato desidrogenase (Adaptado de Khler & Voigt 1988).

17
 6. JUSTIFICATIVA

Os frmacos albendazol e praziquantel so utilizados em tratamentos de

cisticercose, sendo que este ltimo tem apresentado melhora significativa no

quadro clnico dos pacientes. Embora, o praziquantel tenha sido muito indicado no

tratamento de neurocisticercose, a eficcia deste frmaco para a cura de

Neurocisticercose (NCC) cerca de 40% 50% na dose recomendada. Alm

disso, s complicaes da doena, o tratamento requer perodos de meses a

anos.

A Niclosamida um frmaco bastante indicado para o tratamento de

tenases. Os estudos experimentais tm demonstrado que a niclosamida inibe a

fosforilao oxidativa ou a propriedade desta em ativar a enzima ATPase.

Estudos experimentais com T. crassiceps tm demonstrado alteraes nas

vias metablicas (energtica e respiratria) desse parasito, em resposta aos

tratamentos com praziquantel.

A grande vantagem da utilizao deste modelo reside no fato de que: a) a

T. crassiceps um parasito similar a T. solium, possuindo antgenos comuns, b) o

modelo experimental oferece condies de se reproduzir a neurocisticercose

humana, c) o acompanhamento, estudo do desenvolvimento e tratamento da

cisticercose murina por T. crassiceps possibilita o estudo de mecanismos de

resistncia e susceptibilidade ao cisticerco, alm de outras vantagens.

A presente pesquisa visa uma anlise exploratria sobre o metabolismo de

carboidratos e de oxidao de cidos graxos de cisticercos de Taenia crassiceps

(cepa ORF) in vitro diante da niclosamida um frmaco anti-helmntico.

H estudos recentes demonstrando a utilizao da niclosamida no

tratamento de vrias doenas teciduais, principalmente cncer. Desse modo, h

18
o interesse em se conhecer melhor o comportamento dos cidos orgnicos frente

niclosamida mesmo em aerobiose realizada pelo cisticerco in vitro. Isso pode

fornecer informaes mais detalhadas sobre as diferenas entre anaerobiose da

tnia adulta em relao aerobiose da fase larvria.

Assim, o estudo bioqumico do metabolismo de parasitos pode

disponibilizar dados ao esclarecimento de como esses organismos conseguem se

adaptar a diferentes ambientes, como o trato intestinal do hospedeiro, que

anaerbio com abundncia de nutrientes, ou aos tecidos do hospedeiro, que

aerbio com menor aporte nutricional.

Alm disso, a anlise bioqumica de endoparasitos podem elucidar vias

metablicas diferentes entre o parasito e o seu hospedeiro mamfero sendo de

interesse o conhecimento de novos alvos para atuao de frmacos. Estas

pesquisas in vitro sobre o metabolismo de cisticercos de T. crassiceps

descreveram vias do metabolismo aerbio como a cadeia transportadora de

eltrons, a via das pentoses fosfato e o ciclo do cido ctrico. E estudos in vitro

como este podem relatar alteraes bioqumicas e metablicas, como a

diminuio de secreo/excreo de lactato, aps a exposio dos cisticercos a

certo frmaco. Enfim, estudos in vitro a respeito da resposta bioqumica e

metablica de parasitos diante da niclosamida so raros, o que aponta para a

relevncia do aprofundamento de pesquisas cientficas neste mbito.

19
 7. OBJETIVOS

7.1. Objetivo geral

Analisar os aspectos bioqumicos de cisticercos de Taenia crassiceps in

vitro sob a ao do frmaco anti-helmntico niclosamida amplamente utilizado no

tratamento de tenases.

7.2. Objetivo especficos

7.1 Detectar e quantificar in vitro cidos orgnicos do metabolismo da via da

gliclise aerbia e anaerbia: piruvato e lactato, respectivamente, na fase larval

do cisticerco de T. crassiceps (ORF) aps o tratamento com dosagens subletais

de niclosamida.

7.2. Detectar e quantificar in vitro cidos orgnicos do metabolismo do ciclo do

cido tricarboxlico: oxaloacetato, citrato, -cetoglutarato, succinato, fumarato e

malato, na fase larval do cisticerco de T. crassiceps (ORF) aps o tratamento com

dosagens subletais de niclosamida.

7.3. Detectar e quantificar in vitro cidos orgnicos da oxidao de cidos graxos:

acetato, acetoacetato, -hidroxibutirato e propianato, na fase larval do cisticerco

de T. crassiceps (ORF) aps o tratamento com dosagens subletais de

niclosamida.

20
 8. MTODOS

8.1. Manuteno do ciclo biolgico da T. crassiceps

Os cisticercos de T. crassiceps so obtidos por meio do ciclo biolgico

(cepa ORF) mantido no biotrio do Instituto de Patologia Tropical e Sade Pblica

da Universidade Federal de Gois (IPTSP/UFG) desde 2002. Foram inoculados

cerca de 10 cisticercos em estdio inicial na cavidade intraperitoneal de

camundongos fmea BALB/c de 8 a 12 semanas de idade, onde se reproduzem

por brotamento. Aps 90 dias de inoculao os animais foram eutanasiados e

necropsiados. Foram retirados os cisticercos da cavidade intraperitoneal e foram

selecionados 10 em estdio inicial (Vinaud et al 2007), que foram inoculados em

outros camundongos no infectados para dar continuidade ao ciclo (Espindola et

al. 2002; Vaz et al. 1997).

Os princpios ticos em experimentao animal preconizados pela

Sociedade Brasileira de Cincia em Animais de Laboratrio (SBCAL) foram

obedecidos e o trabalho foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da

Universidade Federal de Gois (CoEp/UFG) (protocolo nmero 050/13). Os

camundongos receberam cuidados dirios, gua acidificada e rao padro para

a espcie vontade.

21
8.2. Tratamento dos cisticercos com diferentes dosagem de

Niclosamida

Em placas com seis poos, todas contendo meio de cultura RPMI

suplementado (Gibco), foram divididas em trs controles e trs dosagens

diferentes do frmaco (Figura 8). Em cada poo foram usados 20 cisticercos em

estgio larval de T. crassiceps (cepa ORF), exceto para o controle 1 (Somente

contendo meio RPMI). As placas foram colocadas em estufa por 24 horas a 37C

s seguintes concentraes de niclosamida: 1 M, 2 M e 3 M, juntamente com

os controles 1, 2 e 3.

RPMI RPMI + RPMI +

Cist Cist + EtOH

RPMI + RPMI + Cist RPMI +

Cist + 3uM + 2uM Cist + 1
uM

Figura 8. Placa do tratamento do cisticerco de Taenia crassiceps (cepa ORF)

com Niclosamida. RPMI: controle contendo somente meio RPMI; RPMI+Cist:
controle 2 contendo meio RPMI e cisticerco em estdio larval; RPMI+Cist+ EtOH:
controle 3 contendo meio RPMI, cisticerco estdio larval e etanol (usado para
Figura 5. Placa odo Tratamento
dissolver frmaco); doRPMI+Cist+3uM,
cisticerco de Taenia2uM
crassiceps (cepa ORF)
e 1uM: comcontendo
poos Niclosamida.
respectivamente 3uM, 2uM e 1 uM de Niclosamida, meio RPMI e cisticerco no
estdio larval.

O experimento foi realizado em 6 repeties. As dosagens utilizadas foram

determinadas a partir da recomendao dos fabricantes e dissolvidas em etanol

de acordo com Tomlin (1994), sendo ento calculada uma dose menor do que a

necessria para eliminar o parasito, visto que o objetivo deste trabalho foi avaliar

as adaptaes do parasito frente ao frmaco.

22
8.3. Anlise bioqumica dos cisticercos

Os cisticercos foram retirados da estufa aps 24 horas de exposio e

foram fixados em nitrognio lquido como descrito por Vinaud et al. (2007). Em

seguida procedeu-se a extrao dos cidos orgnicos para a anlise

cromatogrfica, como descrito por Bezerra et al. (1999).

A extrao dos cidos orgnicos nos meios de cultura foi realizada por

meio de uma coluna cromatogrfica de troca inica (Bond Elut - Varian). Foi

utilizado um sistema acoplado uma bomba a vcuo, ativou-se a coluna de

extrao com 1 mL de HCl (0,5 mol.L-1), 1 mL de Metanol e 2 mL de H2O

ultrafiltrada. Depois foi adicionado 1 mL da amostras. Aps, foram acrescentados

2 mL de gua ultrafiltrada e a coluna foi retirada da bomba a vcuo. Em seguida

foram aplicados 250 L de H2SO4 (0,5 M) e centrifugado 2000 g/5 minutos

10C (Bezerra et al. 1999).

A amostra resultante foi submetido a uma anlise em cromatografia lquida

de alta eficincia (CLAE Varian ProStar) com uma coluna de excluso BIORAD-

Aminex ion exclusion HPX 87H (300 X 7,8 mm). A coluna de separao

protegida por uma coluna de proteo BIORAD-Aminex HPX 85. O eluente

utilizado na fase mvel foi o cido sulfrico (5 mMol.L-1), com vazo de 0,6

mL.min-1, acoplado a um detector UV/visvel em comprimento de onda de 210nm.

Cada amostra injetada corresponde a um volume de 50 L (Bezerra et al. 1999;

Vinaud et al. 2007, 2008, 2009; Fraga et al. 2012a, 2012b, 2012c).

Os resultados foram analisados por um software PROSTAR conectado ao

cromatgrafo calibrado para identificar os seguintes cidos orgnicos do

metabolismo de cidos orgnicos: Piruvato, Lactato, Oxaloacetato, Citrato, -

23
cetoglutarato, Succinato, Fumarato, Malato, Acetato, Acetoacetato, -

hidroxibutirato e Propionato.

O procedimento acima descrito possibilitou a anlise dos cidos orgnicos

do lquido vesicular. Este procedimento foi realizado para a anlise dos cidos

orgnicos secretados/excretados (S/E) atravs da anlise do meio de cultura,

seguindo protocolo de anlise bioqumica.

8.4. Anlise Estatstica

A anlise dos dados obtidos foi processada pelo programa Sigma Stat 2.3.

A estatstica descritiva foi executada para determinao da mdia e desvio

padro, e para avaliar as diferenas entres os grupos analisados, essas variveis

obtidas foram testadas quanto distribuio normal e varincia homognea.

Quando ao apresentarem distribuio normal utilizou-se anlise da varincia. As

diferenas observadas foram consideradas significantes quando p<0,05.

24
 9. RESULTADOS e DISCUSSO

A excreo de cidos orgnicos referentes ao metabolismo da via da

gliclise aerbio e anaerbio, via do ciclo do cido tricarboxlicos e a via de

oxidao de cidos graxos em cisticercos de T. crassiceps in vitro e diante de

diferentes concentraes da niclosamida foi detectada e analisada, gerando

assim um perfil metablico do cisticerco frente ao uso desse frmaco in vitro.

A anlise de varincia (ANOVA) foi realizada sobre as mdias desvio-

padro dos dados amostrais obtidos, vistos nas Tabelas 1 e 2. No houve

diferena estatstica significativa (p<0,05) entre os grupos controle e os grupos

tratados com a niclosamida em relao aos cidos detectados e dosados tanto na

produo destes cidos no fluido vesicular quanto na secreo/excreo (S/E)

destes cidos pelos cisticercos no meio de cultura expostos s doses de

niclosamidas usadas neste trabalho. H exceo do grupo tratado com o frmaco

nas concentraes de 1, 2 e 3 uM (10-6mol.L-1) em relao ao grupo controle

quando dosada a S/E de succinato no meio onde foi cultivado os cisticercos, no

qual houve diferena estatisticamente significativa detectada entre o succinato do

grupo tratado em relao ao controle.

Apesar desse resultado estatstico, nota-se nas Tabelas 1 e 2 que h uma

diferena entre as mdias desvio-padro do grupo controle quando se

comparada com as dos grupos tratados. O que sugere a presena de

interferncia ocasionada pelo frmaco sobre as vias metablicas desses cidos.

Ressaltasse que foram feitos testes estatsticos entre dois grupos controles

sendo um contendo RPMI+cisticerco e o outro contendo RPMI+cisticerco+etanol

25
para verificar se o etanol, usado para dissolver o frmaco em soluo, interferia

na anlise das dosagens usando o frmaco em comparao ao controle sem o

frmaco. Nessa anlise no se evidenciou qualquer diferena estatstica

significativa entre esses dois grupos controle.

Desse modo, ao analisar a produo de cidos orgnicos por cisticercos de

T. crassiceps tratados in vitro com 1uM, 2uM e 3 uM de niclosamida, foi

possvel detectar a produo de piruvato, mas no de lactato. Estes so cidos

orgnicos presentes na via da gliclise. Mesmo no havendo diferena estatstica

significativa do piruvato detectado nos grupos controles em relao aos tratados

nota-se que h o direcionamento do cisticerco para a realizao de catabolismo

aerbio com a evidncia dos nveis de piruvato constantes entre os grupos

testados, enquanto os de lactato no foram detectados. O piruvato pode ter sido

consumido em nveis elevados pelo ciclo do cido ctrico. A preferncia do

cisticerco de T. crassiceps, no estdio larval, pelo metabolismo aerbio foi

descrito por Vinaud et al. (2008). Eles verificaram um predomnio da via aerbia

explicado pela deteco dos cidos orgnicos referentes ao ciclo do cido ctrico

com taxas de concentraes mantidas em todas as fases evolutivas e diante de

frmacos anti-helmnticos como Praziquantel e o Albendazol.

Observa-se tambm na Tabela 1 que h uma quantidade de lactato dosado

na S/E do cisticerco no grupo controle e no se consegue detectar as

concentraes desse cido na S/E dos grupos tratados. Isso pode ser explicado

pela a ao do frmaco que age com mais eficcia sobre a via de metabolismo

anaerbio, por isso indicado para helmintos na fase adulta (Frayha et al. 1997;

Weinbach & Garbus 1969) e no para a fase larval, que possui o metabolismo

aerbio conforme constatado por Vinaud et al. (2008). Isso explica no cisticerco a

26
presena de uma certa concentrao do piruvato seguir a via mitocondrial,

consumido pelo ciclo do cido ctrico, sendo substrato do complexo piruvato

desidrogenase, gerando Acetil-CoA. O piruvato mitocondrial tambm pode ter sua

origem pela converso malato mitocondrial que passa para o interior da

mitocndria e pode ser convertido tanto ao Piruvato quanto ao Fumarato, este

tambm pode acarretar ao aumento consequente de succinato (Corbin et al.

1998). O lactato pode no ter sido detectado no grupo controle do metabolismo da

via glicoltica anaerbia no lquido vesicular produzido pelo cisticerco por ter sido

excretado.

Os cidos orgnicos que indicam o ciclo do cido ctrico: oxaloacetato,

citrato, -cetoglutarato, malato e fumarato no demonstraram diferenas

estatsticas significativas nas concentraes identificadas, tanto na S/E quanto na

produo pelos cisticercos, entre o grupo controle e o grupo tratado (Tabelas 1 e

2). provvel que o frmaco, nas concentraes utilizadas, no influenciam os

mecanismos catalticos de ao das enzimas fosfoenolpiruvato carboxiquinase,

malato desidrogenase citosslica e mitocondrial, citrato sintase, enzima mlica

mitocondrial e citosslica, malato desidrogenase citosslica e mitocondrial,

fumarase e fumarato redutase.

Vinaud et al. (2008) apesar de terem usado frmacos diferentes da

niclosamida, compartilham esses mesmos resultados aos cidos orgnicos

citados no comeo deste pargrafo. J Fraga et al. (2012c) demonstraram dados

diferentes quanto as alteraes nas concentraes desses cidos frente a

interao do praziquantel e o albendazol, mas so resultados obtidos in vivo o

que identifica a metabolizao do frmaco pelo hospedeiro, levando a metablitos

27
ativos mais eficazes contra o parasito, como relatado pelos prprios autores deste

trabalho ao comparar os resultados com o de Vinaud et al (2008).

As concentraes do succinato S/E no grupo controle em relao aos

grupos expostos ao frmaco foram detectadas diferenas estatsticas

significativas quando analisadas. Isso sugere a influncia da niclosamida em

induzir maior S/E desse cido. Frayha et al. (1997) e Philip (2015) sugerem que a

niclosamida interfere no metabolismo energtico de helmintos, principalmente no

metabolismo anaerbio, nesse caso ocasionando mais danos forma adulta da

Taenia, inibindo a formao dos microtbulos atravs do bloqueio da captao de

glicose, resultando na depleo de glicognio dos parasitos e possivelmente pela

inibio da produo de adenosina trifosfato (ATP), necessrios para a

sobrevivncia e reproduo dos parasitos.

Isto pode ser devido inibio do frmaco fosforilao oxidativa ou a

propriedade dela de estimular ATPase. Nota-se que niclosamida possui uma

semelhana estrutural com o dinitrofenol (DNP). Esta molcula realiza o

desacoplamento da fosforilao oxidativa na mitocndria do parasito durante o

transporte de eltrons do NADH para flavoprotena (Frayha et al. 1997; Philip

2015), sugerindo que, devido a semelhana estrutural DNP com a niclosamida,

tambm possa permitir o mesmo efeito citado sobre a mitocndria. Assim, o

succinato no foi utilizado na cadeia transportadora de eltrons, mas deve ter sido

excretado.

Tambm ciente que o complexo succnico desidrogenase de helmintos

do fgado, como em Fasciolose e Paragonimiase, muito vulnervel e que

inibido seletivamente por bitionol, este um difenil sulfureto halogenado, e outros

frmacos quimicamente relacionados, tal como as salicilanilidas (por exemplo,

28
niclosamida), diclorofeno e hexaclorofeno. O bitionol tem um efeito de separao

na fosforilao oxidativa proibindo assim a formao de ATP nos parasitos

(James & Gilles 1985).

O succinato em invertebrados um cido orgnico que pode ser excretado

como produto final e utilizado para converso propionato (Corbin et al. 1998).

Alm de poder ser utilizado via succinato desidrogenase na cadeia transportadora

de eltrons na fase do complexo II da cadeia respiratria, pois Del Arenal et al.

(2001) demonstraram que as mitocndrias de cisticercos de T. crassiceps

possuem protenas como citocromo bc1, c e aa3, as quais, nos vertebrados,

fazem parte da cadeia transportadora de eltrons e o succinato o primeiro

composto a entrar nesta cadeia, sendo, portanto utilizado nesta via.

Nas concentraes do succinato produzidos intracelular no foi verificado

diferena significativa entre o grupo controle e o tratado com o frmaco.

provvel que o succinato produzido fosse liberado para o meio.

Os produtos finais do metabolismo de carboidratos em T. crassiceps so

lactato, acetato, succinato e alanina. No metabolismo respiratrio so acetato,

citrato e succinato o que sugere a existncia de vias tanto citoplasmticas quanto

mitocondriais de produo de energia (Corbin et al. 1998; Vinaud et al. 2007;

2008).

Na anlise estatstica das concentraes dos cidos relacionados s vias

metablicas referentes oxidao de cidos graxos (-hidroxibutirato,

acetoacetato, acetato e propionato) no houve diferena estatstica significativa

ao avaliar tanto a S/E no meio de cultura quanto no lquido intra-vescular extrado

dos cisticercos destes cidos pelo cisticerco. notvel que no foram detectados

os cidos Acetoacetato, -hidroxibutirato, acetato e propionato tanto no grupo

29
controle como nos grupos tratados nos lquidos vesiculares extrados dos

cisticercos, mas somente na S/E desses cidos. Vinaud et al. (2009), em estudo

in vitro, e Fraga et al. (2012a), in vivo, tambm no detectaram diferena na

produo de acetato por cisticercos de T. crassiceps.

O acetato no detectado nos grupos amostrais dos cisticercos citados pode

ter combinado com o acetil-CoA dando origem ao acetoacetil-CoA, que se

condensou com o acetil-CoA para formar -hidroxi--metilgluraril-CoA, o qual

quebrado para formar acetoacetato livre e acetil CoA (Lenhinger et al. 2006).

Os cidos -hidroxibutirato, acetato e propionato foram detectados na S/E

dos cisticercos de T. crassiceps, tanto no grupo controle como nos tratados com o

frmaco. O que sugere a excreo desses cidos na clula para o meio de

cultura. Vinaud et al. (2009) e Fraga et al. (2012a) expem em suas pesquisas um

panorama diferente de comportamento para o cido -hidroxibutirato

demonstrando a influncia dos frmacos usados (praziquantel e albendazol)

sobre o metabolismo do cido ctrico e a gliclise, o que levaria o uso de uma via

alternativa de captao de energia, nesse caso a via de cidos graxos.

H uma ressalva a ser feita quanto concentrao do cido propionato na

S/E dos grupos controles quando se comparado aos grupos tratados, mesmo no

identificando diferena estatstica significativa entre eles. Observando-se as

mdias do grupo controle com as dos trs grupos tratados distintos, percebe-se

uma diferena evidente entre eles, onde se encontra uma maior mdia das

concentraes dos controles em relao aos grupos tratados, sugerindo que a

converso de succinato propionato foi influenciada nos grupos tratados,

justificando a diminuio de propianato sobre a ao das diferentes

concentraes de niclosamida.

30
 possvel que a ao da niclosamida sobre complexo succnico

desidrogenase de helmintos, citadas por James & Gilles (1985), possa ter

interferido na converso de succinato propionato diminuindo as concentraes

desse cido nos grupos tratados.

Esses resultados acabam por indicar que a niclosamida, nas

concentraes utilizadas no bloqueiam o ciclo do cido ctrico ou ciclo do cido

tricarboxlico, confirmando a preponderncia do metabolismo em aerobiose nos

cisticercos (estgio larval) como via de produo de energia, tendo em vista que o

efeito do mecanismo da ao do frmaco acentuado sobre a forma adulta da

Taenia, ou seja, sobre o metabolismo anaerobio.

Tabela 1. Concentrao de cidos orgnicos (uM) secretado/excretado (S/E) no meio de

cultura por cisticercos de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes concentraes
de niclosamida mdia e desvio padro ().
Controle Niclosamida Niclosamida Niclosamida
1uM 2uM 3uM
Oxaloacetato 17,2916,05 46,8033,59 47,0231,55 73,7452,96
Citrato 95,4763,98 225,07150,02 296,43240,96 322,03323,31
-cetoglutarato 5,62,5,53 9,985,85 7,378,78 10,8814,55
Piruvato 16,8117,77 20,9919,75 13,8714,08 28,3530,06
Malato 121,95109,97 187,12170,66 244,13211,51 259,52206,04
Succinato 1213,75757,27 2607,631483,03 3156,692138,16 2979,921567,69
Lactato 807,10492,72 ND ND ND
-hidroxibutirato 430,07424,74 415,96419,20 335,62372,59 704,06666,24
Acetoacetato 149,9490,37 165,59112,59 152,0171,00 236,3818,51
Acetato 1035,65846,81 1549,501417,91 1268,211091,94 1545,421351,59
Fumarato 27,3516,42 32,0822,18 46,5433,93 46,4134,41
Propionato 343,81684,35 44,7718,10 55,3730,37 66,6974,26
ND no detectado. P < 0,05.

31
Tabela 2. Concentrao mdias (uM) de cidos orgnicos no lquido intra-vescular
extrado dos cisticercos por cisticercos de Taenia crassiceps presentes no meio de
cultura (RPMI) expostos in vitro a diferentes concentraes de niclosamida.
Controle Niclosamida Niclosamida Niclosamida
1uM 2uM 3uM
Oxaloacetato 39,4329,37 29,1420,47 35,0936,89 50,9236,37
Citrato 99,9564,83 171,61140,49 197,34211,67 -
-cetoglutarato 12,602,81 10,184,37 11,939,08 17,485,31
Piruvato 35,0621,40 23,2416,00 21,0514,27 22,5818,02
Malato 477,61255,23 424,35449,06 339,31220,48 353,01183,82
Succinato 1850,03566,75 2044,0981515,9 2015,081061,37 1785,06918,45
Lactato ND ND ND ND
-hidroxibutirato ND ND ND ND
Acetoacetato 304,92169,35 336,56277,61 8669,0220688,69 332,19217,29
Acetato ND ND ND ND
Fumarato 146,8386,83 186,80139,20 198,40150,07 181,39122,89
Propionato ND ND ND ND
ND no detectado. P>0,05.

32
 10. CONCLUSES

Houve a deteco e quantificao in vitro dos cidos orgnicos relativos ao

metabolismo da via da gliclise aerbia e anaerbia (piruvato e lactato,

respectivamente), do ciclo do cido tricarboxlico (oxaloacetato, citrato, -

cetoglutarato, succinato, fumarato e malato) e da oxidao de cidos graxos

(acetato, acetoacetato, -hidroxibutirato e propianato) na fase larval do cisticerco

de T. crassiceps (ORF) aps o tratamento com dosagens subletais de

niclosamida.

Quanto s anlises dos resultados obtidos pode-se evidenciar a influncia

negativa, ou seja, diminuindo a mdia das concentraes da Secreo/Excreo

dos grupos tratados em comparao dos grupos controles, sobre a excreo de

lactato e uma interferncia sobre o succinato positiva, ou seja, um aumento das

mdias das concentraes da Secreo/Excreo dos grupos tratados em relao

aos controles, levando-o a excreo. Isso demonstra uma preferncia do estgio

larval do cisticerco de T. crassiceps pelo metabolismo aerbio de produo de

energia quando em meio tratado com niclosamida, frmaco com ao maior sobre

o metabolismo anaerbio.

33
 11. RECOMENDAES

A de se considerar pelos resultados obtidos a necessidade de se realizar

mais anlises complementares, como por exemplo, para deteco das

concentraes de glicose e at mesmo de substratos ligados a outras vias de

metabolismo como o de protenas.

Evidenciam-se tambm pelos dados obtidos que os desvios-padro das

mdias das concentraes dos cidos orgnicos detectados esto com uma

amplitude considervel, isso pode ser resolvido aumentando-se o nmero

amostral. Alm disso, pode-se usar no lugar do desvio-padro o intervalo de

confiana, que prefervel para relatar uma estimativa e sua medida de preciso.

34
 12. REFERNCIAS

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Zenka J, Prokopic J. Contribution to the knowledge of aerobic processes in Taenia
crassiceps larvae (Zeder, 1800). Folia Parasitol (Praha) 33: 3316, 1985.

39
 13. ANEXOS

13.1. Anexo 1 Parecer do Comit de tica, TCLE

TCLE. Parecer do Comit de tica

40
13.2. Anexo 2 - Cromatogramas

Cromatograma 1. Deteco in vitro de cidos orgnicos secretados/excretados por

cisticercos em estdio larval do grupo controle 1 (somente RPMI)

Cromatograma 2. Deteco in vitro de cidos orgnicos secretados/excretados por

cisticercos em estdio larval do grupo controle 2 (Meio de cultura RPMI e cisticerco)

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Cromatograma 3. Deteco in vitro de cidos orgnicos secretados/excretados por
cisticercos em estdio larval do grupo controle 3 (Meio de cultura RPMI, cisticerco e
etanol)

Cromatograma 4. Deteco in vitro de cidos orgnicos secretados/excretados por

cisticercos em estdio larval do grupo com 3 uM de Niclosamida (Meio de cultura RPMI,
cisticerco e 3 uM de Niclosamida)

42
Cromatograma 5. Deteco in vitro de cidos orgnicos secretados/excretados por
cisticercos em estdio larval do grupo com 2 uM de Niclosamida (Meio de cultura RPMI,
cisticerco e 2 uM de Niclosamida)

Cromatograma 6. Deteco in vitro de cidos orgnicos secretados/excretados por

cisticercos em estdio larval do grupo com 1 uM de Niclosamida (Meio de cultura RPMI,
cisticerco e 1 uM de Niclosamida)

43
Cromatograma 7. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por cisticercos em
estdio larval do grupo controle 2 (Cisticerco processado cultivado anteriormente em
meio RPMI).

Cromatograma 8. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por cisticercos em

estdio larval do grupo controle 3 (Cisticerco processado cultivado anteriormente em
meio RPMI e etanol)

44
Cromatograma 9. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por cisticercos em
estdio larval do grupo com 3 uM de Niclosamida (Cisticerco processado cultivado
anteriormente em meio RPMI e 3 uM de Niclosamida)

Cromatograma 10. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por cisticercos em

estdio larval do grupo com 2 uM de Niclosamida (Cisticerco processado cultivado
anteriormente em meio RPMI e 2 uM de Niclosamida)

45
Cromatograma 11. Deteco in vitro de cidos orgnicos produzidos por cisticercos em
estdio larval do grupo com 1 uM de Niclosamida (Cisticerco processado cultivado
anteriormente em meio RPMI e 2 uM de Niclosamida)

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