PRACTICA N 4 DE ANLISIS POR INSTRUMENTACIN

MANTENIMIENTO Y CALIBRACION DE ESPECTROFOTOMETROS UV-VIS

La palabra espectrofotmetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen, y de la

palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotmetro, construido mediante procesos
avanzados de fabricacin, es uno de los principales instrumentos diagnsticos y de investigacin
desarrollados por el ser humano. Utiliza las propiedades de la luz y su interaccin con otras sustancias,
para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lmpara de caractersticas
especiales es guiada a travs de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada
longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es
captada y comparada con la intensidad de la luz que incidi en la muestra y a partir de esto se calcula
la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentracin de la sustancia.
El espectrofotmetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentracin de una
sustancia en una solucin, permitiendo as la realizacin de anlisis cuantitativos.

MANTENIMIENTO DEL ESPECTROFOTOMETRO.

Los espectrofotmetros, en general, son equipos muy especializados y costosos. Su conservacin
depende en gran medida de la forma de instalacin y utilizacin. El medio ambiente que los rodea y la
calidad de los servicios de electricidad constituyen factores de primordial importancia, para que los
equipos puedan prestar los servicios de acuerdo con las especificaciones para los que fueron
fabricados. Las rutinas de mantenimiento que pueden llegar a requerir varan en complejidad, van
desde la limpieza cuidadosa de sus componentes hasta procedimientos especializados, que solo deben
realizar tcnicos o ingenieros que hayan recibido la capacitacin correspondiente y dispongan de la
informacin tcnica desarrollada por los fabricantes.
El mantenimiento preventivo del espectrofotmetro debe responder a las rutinas y frecuencias
recomendadas por el fabricante.

A continuacin, se presenta un grupo de rutinas bsicas que puede ser realizada en el laboratorio.

1. Limpiar externamente el espectrofotmetro, incluyendo los controles, pantallas o metros de

medicin. Esto se puede realizar con una pieza de tela fina similar a la textura de los pauelos
humedecida con agua destilada.
2. Inspeccionar y limpiar el cable de alimentacin elctrica.
3. Verificar que la lmpara est limpia y en buen estado. Si no funciona, instalar una nueva, con las
mismas especificaciones de la original. En los espectrofotmetros modernos, el estado de la lmpara
es detectado automticamente mediante el software que controla el estado y el funcionamiento del
equipo, por lo que es fcil determinar en qu momento es necesario cambiar la lmpara. Efectuar el

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cambio de la lmpara y realizar el ajuste posterior siguiendo el procedimiento recomendado por el
fabricante.
4. Revisar el fusible de proteccin. Antes de abrir el alojamiento del fusible, comprobar que el
espectrofotmetro est apagado y que sus contactos se encuentren limpios y en buen estado. Si es
necesario reemplazarlo, colocar uno nuevo con las mismas caractersticas del recomendado por el
fabricante.
5. Colocar el instrumento en la configuracin operacional.
6. Accionar el interruptor de encendido para permitir un funcionamiento por cinco (5) minutos.
Verificar lo siguiente:
a) Si las lmparas o indicadores piloto funcionan.
b) Si el indicador de lectura permanece en cero (0).
c) Si la luz de la fuente funciona.
7. Realizar una prueba de corriente de fuga en las posiciones de encendido y apagado.
a) Verificar el polo a tierra y la polaridad correcta.
b) Verificar la polaridad correcta sin polo a tierra.
c) Verificar la polaridad inversa sin polo a tierra.
8. Calibrar el panel frontal del espectrofotmetro siguiendo las instrucciones del fabricante.
9. Medir la sensibilidad del equipo.
10. Realizar una prueba siguiendo la ley de Beer.
11. Regresar el espectrofotmetro a la configuracin inicial, si la calibracin se ha efectuado con xito.

BUENAS PRCTICAS DE USO DEL ESPECTROFOTMETRO

1. Efectuar la calibracin del espectrofotmetro, cada vez que se realiza el anlisis de un grupo de
muestras.
2. Mantener cerrada la tapa del portamuestras durante el proceso de medicin, para asegurar una
lectura adecuada.
3. Evitar reutilizar las cubetas desechables.
4. Utilizar nicamente cubetas de cuarzo, para efectuar anlisis por debajo de los 310 nm.
5. Evitar el uso de cubetas plsticas, si se utilizan solventes orgnicos.
6. Utilizar cristalera de boro silicato de alta calidad para preparar los estndares. Evitar el uso de
cristalera de sodio xido de sodio siempre que sea posible, debido a que el contacto prolongado con
los estndares puede permearla y, en consecuencia, producir resultados errneos.
7. Limpiar cuidadosamente las cubetas de vidrio despus de utilizarlas. Desechar aquellas que
presenten rayones en la superficie pulida.

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8. Utilizar en lo posible reactivos de alta calidad. Reactivos de baja calidad pueden causar
contaminacin incluso en concentraciones muy bajas. Los diluyentes utilizados agua o solventes
debern estar libres de impurezas.
9. Verificar que las muestras o estndares no se han desgasificado dentro de las cubetas.
Este fenmeno produce burbujas sobre la superficie interna de las cubetas y errores en las lecturas.
10. Tener en cuenta, cuando se pretenda utilizar nuevos procedimientos, que no todas las sustancias
cumplen con la ley de Beer. Efectuar pruebas de linealidad sobre el rango de concentraciones a ser
utilizadas. Se recomienda preparar un grupo de soluciones fuertes conocidas y verificar los
Espectrofotmetro
11. Resultados. Los fenmenos que afectan la ley de Beer son los siguientes:
a) Las altas concentraciones por asociacin molecular de especies inicas.
b) Variaciones en la hidratacin a bajas concentraciones producen cambios en la naturaleza de los
iones complejos

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 PRACTICA N 5 DE ANLISIS POR INSTRUMENTACIN
ESPECTROFOTOMETRIA CURVA DE CALIBRACION

Introduccin

Al observar una solucin acuosa de un colorante a trasluz, observamos una leve coloracin, la cual se
debe a la interaccin entre las molculas del colorante y la luz que atraviesa la disolucin. Adems en
caso de tener varias soluciones de distintas concentraciones es posible determinar un gradiente de
concentracin a partir de la intensidad de la coloracin. Estas observaciones dan origen a una serie de
prcticas analticas llamada Espectrofotometra, basada en la interaccin de las molculas y las
radiaciones electromagnticas.

Una radiacin electromagntica se puede describir como un flujo de partculas llamadas fotones, o bien
como una onda propagndose en el espacio. De esta ltima descripcin se toma el concepto de longitud
de onda, definindolo como la distancia entre dos mximos consecutivos de la onda. La longitud de onda
es inversamente proporcional a la energa de la misma, de tal manera que el espectro de radiaciones
electromagnticas abarca un amplio rango de energas, las de menor energa son las ondas de radio y las
de mayor energa son las llamadas radiacin gamma.

El estado energtico de una molcula se puede alterar por la absorcin de radiacin electromagntica a
determinada longitud de onda, lo que se puede medir para realizar un estudio cuali o cuantitativo, este
fenmeno es el fundamento de la espectrofotometra. Cuando un haz de luz incide sobre un medio
homogneo parte de la radiacin es absorbida y parte transmitida, la fraccin de luz que se absorbe y se
transmite depender de la cantidad de molculas presentes en el medio (de la concentracin) los que nos
permite cuantificar una sustancia

Las principales ventajas de la espectrofotometra son:

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 Sensibilidad relativa elevada.
Facilidad para realizar mediciones rpidas.
Grado de especificidad relativamente elevado.

Para obtener la mxima sensibilidad en una determinacin debe conocerse la longitud de onda de mayor
absorcin de la sustancia analizada, que no deber coincidir con una alta absorcin de otras sustancias
presentes en la reaccin.

Sea I la intensidad de una radiacin que atraviesa un medio homogneo, parte de la radiacin es
absorbida por la muestra y otra parte es transmitida, ambas con una intensidad, i, de tal manera que se
define transmitancia de una muestra como la relacin entre la radiacin transmitida i versus la intensidad
luminosa incidente I, multiplicado x 100:

% T = ( i / I) x 100

La absorbancia es una medida de la cantidad de Energa luminosa incidente absorbida por una sustancia
en solucin. Est relacionada con Transmitancia por medio de :

A= - Log T A= log ( 100 / %T)

La Ley de Lambert y Beer expresa que la absorbancia de una solucin es directamente proporcional al
camino recorrido por la radiacin electromagntica y a la concentracin de la solucin.

A= abc
A: absorbancia
a: absortividad especfica de cada soluto
b: distancia recorrida por el haz de luz en cm
c: concentracin de la solucin
La absortividad es la constante de proporcionalidad que nos permite igualar la ecuacin, sus unidades
dependern de b y c, ya que la absorbancia no tiene unidades; si b est en centmetros y c en moles por
litro, la absortividad estar en litros / mol centmetro y se denomina coeficiente de absorcin molar (E).

Requerimientos para poder aplicar la Ley:

- La medicin del % de T es realizada con luz monocromtica
- La medicin del % de T es realizada a una regin de absorcin del componente a estudiar.
- La referencia es elegida de tal manera que C=0 cuando T= 100% o A= 0%

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- La naturaleza de la solucin debe ser tal que su transmisin responda a variaciones de C .

Espectrofotmetro
Los aparatos de medida de la absorcin de la radiacin electromagntica se denominan
espectrofotmetros y pueden representarse de forma sencilla mediante el siguiente esquema:

La luz procedente de la fuente se hace pasar a travs del monocromador, que la desdobla en haces
monocromticos. El colimador tiene una rendija de ajuste variable, y segn su abertura se obtiene luz de
una determinada longitud de onda. La longitud de onda que se desee utilizar se selecciona variando la
posicin del monocromador. La luz que sale del colimador se hace pasar por la solucin y luego incide
sobre el fototubo, donde se detecta. La seal se enva a un registrador, el cual puede ser la escala de un
galvanmetro calibrado.

Calibracin del espectrofotmetro

Prender el equipo llevando la llave hacia arriba. Esperar 15 minutos para que los circuitos alcancen
temperatura.
Elegir la longitud de onda deseada con el selector.
Verificar 0% de T. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro en reemplazo del tubo

Espectro de absorcin
Consiste en un grfico que representa el % T o la Absorbancia en funcin de la Longitud de onda a la cual
se realiza la medicin, para un amplio rango de longitudes de onda y para una misma concentracin c de
la muestra.
Permite determinar las longitudes de onda ptimas de absorcin y las concentraciones adecuadas de
trabajo. La longitud de onda optima ser aquella en el que el valor de absorbancia sea mximo

Los pasos para realizar un espectro de absorcin son:

Seleccionar la longitud de onda.
Ajustar 100 % T o 0 % A con el Blanco de reactivos.
Reemplazar el blanco por la muestra y leer absorbancia.
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Seleccionar una nueva longitud de onda y repetir las operaciones.
Graficar Absorbancia vs longitud de onda y seleccionar aquella donde la A sea mxima.

Curva de calibracin

Permite determinar la concentracin de una muestra incgnita. Consiste en medir una serie de soluciones
concentracin conocida de la sustancia de la muestra incgnita. Se grafican esos puntos y se emplea dicho
grafico para calcular la muestra problema.

Los pasos para realizar una curva de calibracin son:

Medir la A de las soluciones de concentracin conocida.
Medir la A de la muestra problema.
Graficar Absorbancia vs concentracin.

Si la sustancia cumple con la Ley de Lambert y Beer el grfico ser una recta y ser posible sacar un
factor ya que la pendiente de la recta ser la misma en todos los puntos. As se podr calcular la
concentracin de la muestra problema.

Si la sustancia no cumple la Ley, el grfico ser una curva y se extrapolar dentro de un rango apropiado
para calcular el valor de la muestra problema.

Parte experimental

Objetivos
- Aprender el uso del espectrofotmetro.
- Realizar espectro de absorcin de sustancias puras: soluciones de azul de metileno.
- Realizar una curva de calibracin para determinar la concentracin de una muestra problema de azul
de metileno.

Actividades:

1- Espectro de absorcin de solucin de azul de metileno

Utilizar la solucin de azul de metileno de 5mg/l.Llevar a cero de absorbancia con agua destilada antes
de realizar cada lectura en el espectrofotmetro. Medir las absorbancias a distintas longitudes de onda,
con intervalos de 20 nm, desde 500 nm hasta 700 nm y cada 10 nm entre 600 y 700 nm.
Graficar curva de absorbancia versus longitud de onda.
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Observar cul es la longitud de onda de mayor absorcin que se utilizar para realizar la curva de
calibracin y determinar la concentracin de una muestra problema.

2- Curva de calibracin

A partir de la solucin patrn de 5 mg/l realizar siete diluciones: 1/2; 1/4; 1/5; 1/6; 1/8; 1/10; 1/15.
Medir sus absorbancias a la longitud de onda determinada anteriormente y graficar absorbancia versus
concentracin.
Determinar con la grfica anterior la concentracin de la muestra problema.

Problemas

1- El coeficiente de absorcin especfico de una protena es de 6 dl/g.cm. Calclese la concentracin

en mg/ml si una solucin de sta presenta una absorbancia de 0,82 en una cubeta de 1 cm .

2- Un barbitrico presenta un mximo de absorbancia a 245 nm en un medio fuertemente alcalino.

Trabajando con una celda de 1 cm de espesor se obtienen los siguientes datos:

concentracin (M) Absorbancia

2,05 x 10-5 0,179
4,10 x 10-5 0,356
-5
8,20 x 10 0,718
-5
16,40 x 10 1,430
Determinar si cumple la ley de Lambert y Beer.

3- Calcule la concentracin de una solucin de ATP que posee una absorbancia de 0,87 a 259 nm,si el
coeficiente de absorcin molar a pH 7,0 es de 15,4 l/molcm y la longitud de paso de la cuba es de 1cm.
Cul ser la absorbancia de una solucin de ATP de concentracin 10g/L?. PM ATP: 491

4- Una solucin que contiene 2 gr/l de una sustancia, transmite el 75% de la luz incidente en una
cubeta de 1 cm a una determinada longitud de onda. Calcular la transmitancia de una solucin que
contenga 4 gr/l y la absorbancia de una solucin que contenga 6 gr/l.

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5- Al realizar un espectro de absorcin de protenas, se encontraron las siguientes absorbancias:
Longitud de onda (nm) Abs
240 0,100
250 0,099
260 0,170
270 0,245
280 0,290
290 0,198
300 0,171
310 0,115
Graficar y determinar la longitud de onda que utilizara para medir protenas.

6- Calcular la concentracin de una muestra problema de hemoglobina sabiendo que presenta a 540
nm una absorbancia de 0,45. En la curva de calibracin se obtuvieron los siguientes datos:
Absorbancia Concentracin ( g/ dl)
0,37 11
0,404 12
0,438 13
0,472 14
0,505 15
Determinar si el compuesto cumple con la Ley de Lambert y Beer a esa longitud de onda.

7- En una muestra de suelo se determin nitritos por un mtodo colorimtrico. La absorbancia de la

muestra a 540 nm fue de 0,52. En la curva de calibracin se encontraron los siguientes valores:
Absorbancia Concentracin ( ug/ ml)
0,23 0,20
0,47 0,40
0,65 0,60
0,90 0,80
Determinar la concentracin de nitritos en la muestra.
Es posible sacar un factor para determinar nitritos en prximas muestras?. Justificar.

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