LABORATORIO N1 DIAGNOSTICO MOLECULAR

SEPARACION DE CELULAS MONONUCLEARES

Este protocolo es utilizado como un medio de separacin que facilita la rpida recuperacin de
Linfocitos y otras clulas mononucleares viables a partir de pequeos volmenes de sangre total.
Durante la centrifugacin, los linfocitos y otras clulas mononucleares son retenidas en la
interface entre el plasma y la solucin de Histopaque-1077. Durante el centrifugado, los eritrocitos
granulocitos son agregados por la polisucrosa, sedimentndose rpidamente, mientras que los
linfocitos y las clulas mononucleares permanecen en la zona entre el plasma e HISTOPAQUE -
1077. La contaminacin por eritrocitos es casi nula.

Materiales:

PBS
Histopaque - 1077
Pipeta aforada
Prepipeta
Gradilla
Tubo de sangre con EDTA
Tubos Eppendorf 2mL
Goteros
Parafilm
Centrifuga

Protocolo
En un tubo Eppendorf (2mL) agregar 1 mL de Histopaque-1077
**Paso Crtico** Agregar muy cuidadosamente al tubo eppendorf 1 mL de sangre sobre el
Histopaque. (Se debe inclinar el tubo eppendorf en un angulo de 45 y luego
cuidadosamente sobreponer el mL de sangre sobre la capa de Histopaque)
Centrifugar a 700 x g por 30 min a temperatura ambiente.
Luego de la centrifugacin, cuidadosamente remueva los tubos desde la centrifuga. Podr
distinguir una capa de color opaco, all se encontraran las clulas mononucleares y
linfocitos. (Figura 1)
Aspirar la capa superior con una pipeta o gotero hasta 0,5 cm de la interface opaca. Luego
retire la capa que contiene las clulas de inters y transfiera a un nuevo tubo eppendorf.
Lavar las clulas agregando 1 mL de Buffer PBS y mezcle suavemente con una pipeta.
Centrifugar a 200 x g por 10 min.
Remover el sobrenadante y descartar.
Almacenar el tubo a -70C.

Notas: La centrifugacin a temperaturas menores a 4C puede provocar aglutinacin de las

clulas y una baja recuperacin.
Para obtener mejores resultados, la sangre debiera ser procesada dentro de las 2 horas post-
recoleccin

Figura 1. Formacin de fases post centrifugacin de muestra sangunea con Histopaque-1077