Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Curso 2010
Produccin de
metabolitos secundarios
en biorreactores
Alejandro Mentaberry
Departamento de Fisiologa, Biologa Celular y Molecular
FCEN-UBA
Sumario
Referencias
Potencial econmico
de los metabolitos secundarios
Cultivo
de tejidos y El metabolismo secundario regula
Concepto
metabolismo muchas de las relaciones
general
secundario de la planta con el medio circundante
Hecogenina Digitoxigenina
(aglicona de una saponina; (aglicona de digitoxina; tratamiento
detergente) de congestiones cardacas)
Taxol
Taxol Forbol
Forbol Costunlido
Costunlido
(droga anticancergena) (irritante y cocarcinognico) (repelente de inserctos;
(droga anticancergena) (irritante y cocarcinognico) (repelente de inserctos;
antinutriente de mamferos)
antinutrientede mamferos)
Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales
Cinchona
officinalis
Cocana
Quinina
Erythroxylon coca
Coffea arabica Cafena
fenlicos
derivados de Unos 8.000 fenlicos
fenilpropanoides se forman en las
gingeroles
plantas por las rutas
Pimiento rojo y negro
del cido shikimico o
del malonato/acetato
norhidrocapsaicina
capsaicina
Granos de caf
piperina
cido clorognico
Corteza de canela
cinnamaldehido
Algunas de las medicinas ms importantes o sus
precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso teraputico
Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$
Hiosciamina, Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinrgicos
escopolamina
Camptotecina Alcaloide indlico Camptotheca Antineoplsico
acuminata
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgsico local
Codena, morfina Alcaloide opiceo Papaver somniferum Analgsico
Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota
Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa
Pilocarpina Alcaloide imidazlico Pilocarpus jaborandi Colinrgico
Nicotina Alcaloide pirrolidnico Nicotiana spp. Terapia antitabaco
Quinina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Antimalrico
Quinidina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Cardiotnico
Reserpina Alcaloide indlico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrpico
Vinblastina, Alcaloide indlico Catharanthus roseus Antineoplsico
vincristina
Yohimbina Alcaloide indlico Apocynaceae, Afrodisaco
Rubiaceae
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$
Artemisinina Lactona sesquiterpnica Artemisia annua Antimalrico
Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales
Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Antitumoral
Glicsidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$
Digoxina, digitoxina Glicsidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotnico
Sennsidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante
Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$
Ipecac Mezcla de alcaloides de Cephaelis Emtico
ipecacuana ipecacuanha
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplsico
Produccin
de metabolitos - Independizarse de factores externos, tales como:
secundarios cambios de temperatura, sequas, plagas,
variabilidad de la produccin, factores polticos
por cultivo y sociales, etc.
in vitro
- Evitar la extincin de especies vegetales.
de clulas
y rganos - Disponer de condiciones controladas en el proceso
vegetales: de produccin y extraccin.
Precio
Producto Especie Aplicacin Rendimiento (%)
(U$S/kg)
Parmetros principales:
- Productividad: g de producto/L/da
Agregado de precursores
- Fuente de carbono
- Limitacin en nitrgeno
- Limitacin en fosfato
- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)
- Relacin C/N
Agregado de precursores
- Bajo costo
- Baja toxicidad
- No muy alejado del producto final en la ruta metablica
Diferencias entre suspensiones de clulas vegetales
y de clulas microbianas
Caracterizacin Clulas Clulas Consecuencias para
microbianas vegetales cultivos a gran escala
- Tasa de crecimiento
- Oxigenacin
- Agitacin
Ejemplos de tasas de crecimiento de
suspensiones de clulas vegetales en biorreactores
AG: bioreactor con agitacin Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
EA: bioreactor de elevacin por aire (airlift)
La densidad el inculo y del diseo del biorreactor inciden
en el desarrollo de las suspensiones celulares
Efecto de la densidad de inculo Tamao y distribucin de agregados
en el crecimiento de cultivos de Helianthus annuus en varios
de Picrasma quassiodides. biorreactores y en Erlenmeyer
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Scragg. Secondary products from plant tissue culture, 1990.
Tamao de agregado y acumulacin
de metabolitos secundarios
Distribucin del tamaos obtenido en
Porcentaje de callos de Vitis vinifera biorreactores con medio en presencia de
que contienen pigmentos de acuerdo carboximetilcelulosa (crculos cerrados)
con el tamao de los agregados y en medio control (crculos abiertos)
Tomado de: Nagamori et al., Biochemical Engineering Journal, 2001. Tomado de: Honda et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002.
Patrn de flujo de dos diseos de propulsor
Agitador de paletas planas o de Rushton Agitador de paletas inclinadas
(flujo radial) (flujo axial)
deflector deflector
Columna de burbujeo Airlift con tubo interno Airlift con loop externo
El biorreactor ms grande del mundo es de tipo air-lift
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Bhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.
Cultivo de rganos: races transformadas
Fenotipo de raz
transformada con
Agrobacterium
rhizogenes
Algunos
metabolitos Metabolito Gnero
secundarios Alcaloides
producidos Alcaloides piridnicos
Indoles
Nicotiana
Catharanthus
por races Tropano
Cinchona
Duboisia
transformadas Datura
Otros
Betalaina Beta
Sesquiterpenos Lippia
Artemisia
Poliacetilenos Coreopsis, Bidens
Tiofenos Tagetes
Malla de
inmovilizacin Adicin de nutrientes
Rotmetro
peristltica
Filtro de aire
Bomba
Bomba de aire
Generador de niebla
Aire Aire Reservorio Intensidad Condensador
On Off de niebla
Cmara
Controlador
Bomba de cultivo
Desventajas
- Slo para productos sintetizados en tallos y hojas
- Vitrificacin
Compuesto Planta
Entrampamiento:
- Geles o polmeros
- Membranas: microencapsulacin
o reactores de membrana
Inmovilizacin
Ventajas
- Posibilita la reutilizacin del biocatalizador y una
rpida separacin del medio de cultivo.
- Las clulas vegetales permanecen viables
por largos perodos de tiempo.
- Es posible establecer sistemas de cultivo continuo,
con el consiguiente aumento en la productividad.
- Es posible establecer cultivos de alta densidad
permitiendo el uso de biorreactores ms pequeos.
- La inmovilizacin favorecera la interaccin entre
las clulas, favoreciendo cierto grado
de diferenciacin con el consiguiente incremento
en la produccin.
- Es compatible con otras estrategias de optimizacin
. (elicitacin, permeabilizacin y remocin de producto)
- En muchos casos, la misma inmovilizacin induce
la secrecin del producto al medio de cultivo.
Inmovilizacin
Desventajas
Tomado de: Payne et al. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1991.
Elicitacin
Agentes biticos
Agentes abiticos
- Metales pesados
- Radiacin UV
- Presin osmtica
- Ultrasonido
Incremento de la produccin de metabolitos secundarios
por elicitacin en diferentes cultivos in vitro
Alcaloides Datura stramonium Phytophtora megasperma 55 mg / L de cultivo 0,85 mg / g peso seco 4,27 mg / g peso seco
del tropano (suspensiones) (extracto crudo)
Berberna Thalictrum rugosum Saccaromyces cereviseae 0,2 mg / g peso fresco 0,5% peso seco 2% peso seco
(suspensiones) (extracto crudo)
Alcaloides Catharanthus roseus Penicilinum spp. 0,01 g / L peso seco 3 mg / g peso seco
indlicos (races transformadas) (extracto crudo) 9 mg / g peso seco
Shock trmico
Cambios de pH
Elicitacin
Electropermeabilizacin
Remocin Lquido-lquido:
de producto
Compuestos inmiscibles en agua: Se utilizan solventes
in situ orgnicos o lpidos (sistemas de dos fases agua-orgnico).
Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.
Slido-lquido:
La segunda fase es un material slido como resinas u otros
absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.
Requerimientos:
- Autoclavables
- No txicos
- Fcil separacin del producto de inters
de la segunda fase
- No modificacin del medio de cultivo
- Permanencia de las clulas en la fase acuosa
Adaptaciones para la extraccin in situ del producto
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
un proceso para
la produccin
Establecimiento de cultivos in vitro
de metabolitos
secundarios
Estabilizacin y seleccin de cultivos
in vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,
liberacin al medio
Catharanthus roseus Triptofano decarboxilasa (TDC) Alcaloides indlicos Contenido de TIAs de 300 mg/L
(suspensiones) y estrictosidina sintasa (STR) (TIAs) comparado con control 50mg/L.
Lneas inestables
Coptis japonica (S)-esculerina 9-O- Berberina Incremento del flujo hacia la produccin
(suspensiones) metiltransferasa (SMT) de berberina de 15%
Mentha spp. Desoxixilulosa fosfato Aceites esenciales Incremento del 50% ene l contenido
(planta) reductoisomerasa (DXR) de aceites esenciales
- Compartimentalizacin de productos
- Limitaciones y arquitectura
de la ruta metablica
Shikonina
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery
Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 3 aos.
Suspensiones celulares
- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la produccin.
- Las bajas concentraciones de nitrgeno y la elicitacin inducen
la produccin de shikonina.
- Se utilizan fermentadores de agitacin mecnica y tambor rotatorio.
- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.
Proceso para la produccin de shikonina a partir de clulas
de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.
Berberina
Tomado de: Yamasaki Plant Photo Gallery
Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente de 5-6 aos.
Suspensiones celulares
- Las lneas celulares productoras se seleccionaron a travs de
. protoplastos y screening de por fluorescencia.
- El sistema de cultivo utilizado es el de batch alimentado y el producto est
. asociado al crecimiento.
Produccin de ginsensidos por Panax ginseng
Ginsensidos
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery
Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 5-7 aos .
- Se requieren perodos prolongados de cuidado que exponen a los cultivos
a riesgos de pestes y cambios drsticos de clima.
- La concentracin de saponinas es de 0,5 % peso seco.
Suspensiones celulares
- La concentracin de saponinas es de 0,65 % peso seco.
- La productividad de biomasa es de 700 mg/L/da.
- El medio de cultivo contiene bajas concentraciones de amonio.
- A gran escala se emplean tanques agitados mecnicamente a bajas velocidades.
Races transformadas
- La concentracin de saponinas es de 0,95 % peso seco.
- El medio de cultivo requiere del agregado de 2 mg/L de IBA y de 0,1 mg/L de quinetina.
- A gran escala se emplean tambores rotatorios.
Produccin de taxol por Taxus spp
Planta entera
- La edad de los rboles para extraer el producto es de 50-100 aos.
- La concentracin de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.
- Este mtodo de produccin podra llevar a la extincin de la especie.
. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difcil la purificacin del taxol.
. - El material vegeta empleado presenta variacin en la concentracin de precursores.
- Las plantas empleadas crecen lentamente.
Produccin de taxol por Taxus spp
Taxol
Schoepke Plant Image Gallery
Vinblastina
Planta entera
- La planta tiene bajas concentraciones
de alcaloides.
- La purificacin y extraccin son costosas.
Suspensiones celulares
- La limitacin de fosfato y nitrgeno combinado con la elictacin, inducen la produccin de
del precursor ajmalicina (utilizado para tratar hipertencin y problemas cardiolgicos).
- Las lneas celulares seleccionadas son resistentes a las fuerzas de corte, posibilitando
el desarrollo de cultivos a gran escala,
- En los cultivos a gran escala es necesario re-circular los gases de salida.
- Las suspensiones no acumulan alcaloides indlicos dimricos: vinblastina y vincristina.
- Se necesitara aumentar la productividad 40 veces respecto de la productividad especfica
obtenida actualmente (0,26 mg/g peso seco/da) para que el proceso sea viable.
Fenilpropanoides y flavonoides: algunos casos tpicos...
Estructuras de
vainillina y de
distintas
antocianinas
Pelargonidina-3-glucsido R2=OH (1)
Cianidina-3-glucsido R2+R3=OH (2)
Vainillina (1) Delfinidina-3-glucsido R1+R2+R3=OH (3)