EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE GLUCGENO EN EL HGADO DE CAVIA

PORCELLUS

I. INTRODUCCION

El glucgeno es el polisacrido de reserva ms importante en las clulas

animales. Al igual que la amilopectina, el glucgeno es un polmero con
subunidades de glucosa unidas por enlaces (14)

y ramificaciones del tipo (16), pero el glucgeno est ms ramificado (una

ramificacin cada 8 a 12 residuos) y es ms compacto que el almidn. El
glucgeno es especialmente abundante en el hgado, donde puede llegar a
representar el 7% de su peso; tambin se encuentra en el msculo esqueltico.
Algunos grnulos de glucgeno contienen tambin, ntimamente unidos, los
enzimas responsables de su sntesis y degradacin. Puesto que cada rama de
estos termina con un azcar no reductor (que no posee carbono anomrico
libre), estos polmeros tienen tantos extremos no reductores como ramas, pero
nicamente un extremo reductor. Cuando el glucgeno se emplea como
fuente de energa las unidades de glucosa son eliminadas de una en una a partir
de los extremos no reductores. Dada la naturaleza ramificada de la
amilopectina y el glucgeno, los enzimas degradativos (que actan en los
extremos no reductores) pueden trabajar simultneamente en muchos
extremos, aumentando la velocidad de conversin del polmero en
monosacridos (Lehninger et al, 2005).

La D- glucosa es el principal combustible de la mayora de organismos y ocupa

una posicin central en el metabolismo. Es relativamente rica en energa
potencial; su oxidacin completa a dixido de carbono y agua transcurre con
una variacin de energa libre estndar de -2.840 kJ/mol. Almacenando la
glucosa en forma de polmero de elevada masa molecular, una clula puede
apilar grandes cantidades de unidades de hexosa al tiempo que mantiene una
osmolaridad citoslica relativamente baja. Cuando aumenta de una manera
sbita las necesidades energticas de la clula, la glucosa se puede liberar
rpidamente a partir de estos polmeros de almacenamiento intracelular
(Lehninger et al, 2005).

En la gluclisis (del griego glykys, que significa dulce y lysis, que significa
romper) lo que sucede es que se degrada una molcula de glucosa en una
serie de reacciones catalizadas enzimticamente, dando dos molculas de
piruvato.

Durante la secuencia de reacciones parte de la energa libre cedida por la

glucosa se conserva en forma de ATP. La gluclisis fue la primera ruta
metablica elucida y es probablemente la que se conoce mejor, mientras que
la gluconeognesis es la sntesis de la glucosa a partir del piruvato y el lactato.
Para la sntesis de una mol de glucosa son necesarios 4 moles de ATP y 2 moles
de GTP ( ITP) a partir de 2 moles de piruvato y/o lactato. El camino que lleva la
glucognesis es bsicamente el inverso del de la gluclisis excepto por 3 pasos
especficos entre la glucosa y glucosa-6-fosfato, fructosa-6-fosfato y fructosa-1,6-
bifosfato, and fosfoenolpiruvato (PEP) y piruvato. Esta tiene su lugar
principalmente en el hgado y su misin es proporcionar glucosa para exportarla
a otros tejidos cuando se han agotado otras fuentes de glucosa. (Hayashi, 2008)

II. FUNDAMENTO TEORICO

III. OBJETIVOS
Utiliza las metodologas de bioqumica experimental para la
extraccin de glucgeno a partir de tejido animal (hgado de
cavia porcellus) y realizar su determinacin cualitativa.
Determinar la funcin e importancia del glucgeno.
IV. MATERIALES, REACTIVOS y otros
A. MATERIALES
Equipo de diseccin
Centrifuga
Tubos de centrifuga
Balanza
Provetas
Mortero
Pipetas
Varilla de vidrio
Cronometro

B. REACTIVOS
Etanol absoluto al 96%
Acido trocloroacetico al 5%
Hielo
C. OTROS
Cavia porcellus
Arena
Hielo
V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Decaptese un cobayo extrigase el hgado, colocndose
inmediatamente en hielo.
2. Una frio, pesar 5 gr de hgado

3. Crtese en trozos pequeos y colocar en un mortero enfriado

previamente, conteniendo un volumen (1 ml por grado de tejido) de
ATC al 10%.

4. Aadir 2.0 gr de arena lavada

5. Triturar el hgado manteniendo el mortero en hielo.

6. Centrifugar el homogenizado por 5 minutos a 2000 rpm.

7. Vaciar el sobrenadante en una probeta y colectar en vaso ppdo.

8. Enjuagar el mortero con ATC al 5% y centrifugar.

9. Centrifugar el homogenizado por 5 minutos a 2000 rpm.

10. Colectar los sobrenadantes en una probeta

11. Agitar la probeta contenida con sobrenadante con una varilla de

vidrio y dejar reposo durante 5 minutos.
12. Agitar la probeta y volver a centrifugar el homogenizado por 5
minutos a 2000 rpm.

13. Descartar los precipitados y separar el sobrenadante en una

probeta, agregar ATC 10% hasta volumen total de la probeta.

14. Adase mientras se agitan al homogenizado 2 volmenes de

alcohol al 95% por cada volumen de extracto.

15. Agtese a la mezcla y dejar en reposo hasta que el precipitado

flocule.

16. Si no flocula, adase una alcuota de NaCl y calentar el recipiente

con un poco de agua tibia hasta la obtencin de un precipitado.

17. Transfirase la suspensin a tubos y centrifugar durante 3 minutos a

2000 rpm. Descartar el sobrenadante.
 18. Disuelva el precipitado blanco en 5 de agua y repricipitar con dos
volmenes de etanol al 95%.

19. Volver a centrifugar la solucin anterior y lave el tubo de centrfuga

con 3 ml etanol al 95% dispersando con una varilla de vidrio.

20. Tras la centrifugacin, lavar el ppdo. con 3 ml de etanol al 95% y 3 ml

de ter etlico.

21. Secar la preparacin al ambiente, extendindose el precipitado en

capa fina en una luna de reloj.

VI. EXPRESION DE RESULTADOS

VII. DISCUSIONES
La gluconeognesis es el proceso de sntesis de glucosa o de glucgeno
a partir de precursores que no son carbohidratos. Los principales
sustratos son los aminocidos glucognicos, lactato, glicerol y
propionato. El hgado y los riones son los principales tejidos
gluconeognicos; los riones pueden contribuir con hasta 40% de la
sntesis de glucosa total en el estado de ayuno, y con ms durante
inanicin. Las enzimas gluconeognicas clave se expresan en el
intestino delgado, pero no est claro s hay produccin significativa de
glucosa por el intestino en el estado de ayuno.

Un aporte de glucosa es necesario, en especial para el sistema nervioso

y los eritrocitos. Despus de un ayuno durante toda la noche, la
glucogenlisis y la gluconeognesis hacen contribuciones casi iguales a
la glucosa en sangre; a medida que las reservas de glucgeno se
agotan, la gluconeognesis se hace progresivamente ms importante.

La falla en la gluconeognesis por lo general es mortal. La hipoglucemia

causa disfuncin cerebral, lo que puede conducir coma y muerte. La
glucosa tambin tiene importancia en el mantenimiento de la
concentracin de intermediarios del ciclo del cido ctrico aun cuando
los cidos grasos son la principal fuente de acetilCoA en los tejidos.
Adems, la gluconeognesis elimina lactato producido por los msculos
y los eritrocitos, y glicerol producido por el tejido adiposo. En rumiantes,
el propionato es un producto del metabolismo de los carbohidratos en
el rumen, y es un sustrato importante para la gluconeognesis.

La gluconeognesis excesiva ocurre en pacientes muy graves en

respuesta a lesin e infeccin, lo que contribuye a la hiperglucemia que
se relaciona con mal resultado. La hiperglucemia lleva a cambios de la
osmolalidad de los lquidos corporales, flujo sanguneo alterado acidosis
intracelular, y aumento de la produccin de radicales superxido, lo
 que da lugar a funcin alterada del endotelio y del sistema inmunitario,
y coagulacin sangunea alterada. La gluconeognesis excesiva
tambin es un factor contribuidor a la hiperglucemia en la diabetes tipo
2 debido a sensibilidad alterada de la gluconeognesis a la regulacin
descendente en respuesta a la insulina.

VIII. CONCLUSIONES
Se Utilizaron las metodologas de bioqumica experimental
(espectrofotometra) para la extraccin de glucgeno a partir
de tejido animal (hgado de cavia porcellus) y realizamos su
determinacin cualitativa.
Se determinaron las funciones e importancia del glucgeno.

IX. CUESTIONARIO
1. Realice el flujograma de la extraccin de glucgeno

PESAR LA MUESTRA DE CORTAR LA MUESTRA EN AGREGAR CIDO CORTAR LA MUESTRA EN

HIGADO TROZOZ PEQUEOS TRICLOROACETICO TROZOS PEQUEOS

AGREGARA ARENA CENTRIFUGAR DECANTAR EL LQUIDO

TRITURAR LA MUESTRA
LAVADA DURANTE 5 MINUTOS OPALESCENTE

VERTER EL CONTENIDO
EJUGAR EL MORTERO Y
EN EL TUBO DE AGITAL LA MUESTRA Y CENTRIFUGAR 5
PILON CON UNA
CENTRIFUGA CON DEJAR EN REPOSO MINUTOS
PORCION DE ATC
RESIDUOS

AADIR ETANOL AL 95% CENTRIFUGAR 5 AADIR ETANOL AL 95%

DECANTAR
HASTA QUE FLOCULE MINUTOS HASTA QUE FLOCULE

CENTRIFUGAR 5 SECAR LA MUESTRA AL

MINUTOS AIRE
2. El tipo de dieta, edad, peso, actividad fsica, estado de nimo influir
en el nivel de glucgeno heptico?

en los estados tanto de alimentacin como de ayuno se proporciona un

aporte de combustibles metablicos el sistema nervioso central y los
eritrocitos siempre necesitan glucosa. Los eritrocitos carecen de
mitocondrias y, por tanto, en todo momento dependen por completo de
la gluclisis (anaerbica) y de la va de la pentosa fosfato. El cerebro
puede metabolizar cuerpos cetnicos para satisfacer alrededor de 20%
de sus requerimientos de energa; el resto debe suministrarse mediante
glucosa. Los cambios metablicos que suceden en el estado de ayuno y
en la inanicin son las consecuencias de la necesidad de preservar la
glucosa y las reservas limitadas de glucgeno en el hgado y los msculos
para uso por el cerebro y los eritrocitos, y de asegurar el suministro de
combustibles metablicos alternativos para otros tejidos. En el embarazo
el feto requiere una cantidad importante de glucosa, al igual que la
sntesis de lactosa durante la lactacin.

un equilibrio de las actividades entre la glucgeno sintasa y La Fosforilasa

regula el metabolismo del glucgeno. Al mismo tiempo que la fosforilasa
es activada por un aumento de la concentracin de cAMP (por medio
de la fosforilasa cinasa), la glucgeno sintasa es convertida en la forma
inactiva; ambos efectos estn mediados por la protena cinasa
dependiente de cAMP (figura 19-8). De este modo, la inhibicin de la
glucogenlisis aumenta la glucognesis neta, y la inhibicin de la
glucognesis aumenta la glucogenlisis neta.
Asimismo, la desfosforilacin de la fosforilasa a, fosforilasa cinasa y
glucgeno sintasa b es catalizada por una enzima nica con
especificidad amplia, la protena fosfatasa-1. A su vez, esta ltima es
inhibida por la protena cinasa dependiente de cAMP por medio del
inhibidor- 1. De este modo, la glucogenlisis puede terminar, y la
glucognesis puede ser estimulada, o viceversa, de manera sincrnica,
porque ambos procesos son dependientes de la actividad de la protena
cinasa dependiente de cAMP. Cinasas y fosfatasas separadas pueden
fosforilar de manera reversible en ms de un sitio tanto la fosforilasa
cinasa como la glucgeno sintasa. Estas fosforilaciones secundarias
modifican la sensibilidad de los sitios primarios a la fosforilacin y
desfosforilacin (fosforilacin de mltiples sitios). Asimismo, permiten que
la insulina, por medio de un incremento de la glucosa 6-fosfato, tenga
efectos que actan de manera recproca a los del cAMP.

3. Cules son las diferencias entre glucgeno heptico y glucgeno

muscular?
 Figura N 1. almacenamiento de carbohidratos en un ser humano de 70 kg de peso

Glucgeno muscular

Glucgeno muscular es el combustible del msculo y esencial para poder

realizar cualquier tipo de activad fsica. Hay que prestarle especial atencin
cuando realizas deporte ya que aqu es muy importante mantener los niveles
de glucgeno muscular.

Su papel en el msculo es proporcionar la fuente primaria de energa al

msculo, permitiendo que se contraiga.

Glucgeno heptico

Sufre una serie de transformaciones para convertirse en glucosa en sangre

mediante adrenalina y glucagn. Ambas hormonas importantsimas en el
organismo y la salud. Esta es la principal fuente de glucosa sangunea cuando
estamos alimentndonos. As que es vital para seguir activos.

4. Qu enfermedades se dan por acumulacin de glucgeno?

TIPO NOMBRE ENZIMA DEFICIENTE DATOS CLINICOS

0 - Glucgeno sintasa Hipoglucemia; hipercetonemia; muerte
temprana
Ia Enfermedad de Glucosa 6- acumulacin de glucgeno en el
Von Gierke fosfatasa hgado y en clulas
de los tbulos renales; hipoglucemia;
acidemia lctica;
cetosis; hiperlipidemia
Ib - transportador de como en el tipo Ia; neutropenia y
glucosa 6-fosfato funcin de neutrfilos
del retculo alterada que llevan a infecciones
endoplsmico recurrentes
II Enfermedad de 1 4 y 1 6 Acumulacin de glucgeno en
pompe glucosidasa lisosomas: variante
(maltosa acida) de inicio juvenil, hipotona muscular,
lisosomal muerte por
 insuficiencia cardiaca hacia los dos
aos de edad; variante de inicio en el
adulto, distrofia muscular
IIIa Dextrinosis Enzima Hipoglucemia en ayuno;
limite, desramificadora hepatomegalia durante
enfermedad heptica y la lactancia; acumulacin de
de Forbe o de muscular polisacrido ramificado
cori caracterstico (dextrina limite); debilidad
muscular
IIIb Dextrinosis Enzima como en el tipo IIIa, pero sin debilidad
limite desramificadora muscular
heptica
IV amilopectinosis, Enzima Hepatosplenomegalia; acumulacin de
enfermedad ramificadora polisacrido con
de andersen pocos puntos de ramificacin; muerte
por insuficiencia
cardiaca o heptica antes de los cinco
aos de edad
V Deficiencia de Fosforilasa poca tolerancia al ejercicio; glucgeno
miofosforilasa, muscular muscular
sndrome de anormalmente alto (2.5 a 4%); lactato
Mcardle en sangre muy bajo
despus de ejercicio
VI Enfermedad de Fosforilasa Hepatomegalia; acumulacin de
Hers heptica glucgeno en el hgado;
hipoglucemia leve; por lo general buen
pronostico
VII Enfermedad de Fosfofructocinasa poca tolerancia al ejercicio; glucgeno
tarui 1 muscular y de muscular
eritrocitos anormalmente alto (2.5 a 4%); lactato
en sangre muy bajo
despus de ejercicio; anemia
hemoltica
VIII Fosforilasa cinasa Hepatomegalia; acumulacin de
heptica glucgeno en el hgado;
hipoglucemia leve; por lo general buen
pronostico
IX Fosforilasa cinasa Hepatomegalia; acumulacin de
heptica y glucgeno en el hgado
muscular y el musculo; hipoglucemia leve; por lo
general buen
pronostico
X protena cinasa Hepatomegalia; acumulacin de
dependiente de glucgeno en el hgado
caMp

X. BIBLIOGRAFIA
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2. Bioqumica: Fundamentos para Medicina y Ciencias de la vida. 1 Edicin,
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Educacin S.A