Rutinas Calidad en Lab

Procedimientos y pautas
Rutinas de control de calidad en la

industria lctea
QAM-588017-0501 1
ndice de materias
1. INTRODUCCIN................................................................................. 9
2. CONTROL DE CALIDAD DE LAS MATERIAS PRIMAS.................. 10
I Anlisis fisicoqumicos ......................................................................... 10

2.1. Determinacin de valores de pH .................................................................. 10
2.1.1. Objetivo ........................................................................................................ 10
2.1.2. Definiciones .................................................................................................. 10
2.1.3. Fundamento del mtodo............................................................................... 10
2.1.4. Materiales usados para el ensayo ............................................................... 10
2.1.4.1. Material de vidrio .......................................................................................................................... 10
2.1.4.2. Reactivos ....................................................................................................................................... 10
2.1.4.3. Equipos.......................................................................................................................................... 11
2.1.4.4. Otros materiales............................................................................................................................. 11
2.1.5. Metodologa de anlisis ................................................................................ 11
2.2. Determinacin de la acidez de la leche ....................................................... 12
2.2.1 Objetivo ........................................................................................................ 12
2.2.2 Definiciones .................................................................................................. 12
2.2.2.1 Indicadores .................................................................................................................................... 12
2.2.3 Introduccin .................................................................................................. 12
2.2.3.1 La acidez natural de la leche ......................................................................................................... 12
2.2.3.2 Acidez adquirida ........................................................................................................................... 12
2.2.3.3 Acidez potencial............................................................................................................................ 13
2.2.3.4 Explicacin de la conversin......................................................................................................... 13
2.2.3.5 Acidez real .................................................................................................................................... 14
2.2.3.6 Factores que influyen en el aumento de la acidez ......................................................................... 14
2.2.4 Materiales usados para el ensayo ................................................................ 14
2.2.4.1 Material de vidrio .......................................................................................................................... 14
2.2.4.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 14
2.2.5 Recomendaciones del mtodo ..................................................................... 15
2.2.6 Metodologa de anlisis ................................................................................ 15
2.3. Prueba de alcohol.......................................................................................... 16
2.3.1. Objetivo ........................................................................................................ 16
2.3.2. Materiales usados para el ensayo ................................................................ 16
2.3.2.2. Reactivos ....................................................................................................................................... 16
2.3.3. Metodologa de anlisis ............................................................................... 16
2.3.4 Evaluacin e interpretacin del resultado ..................................................... 16
2.4. Prueba de alizarol .......................................................................................... 17
2.4.1. Objetivo ........................................................................................................ 17
2.4.2. Introduccin .................................................................................................. 17
2.4.3.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 17
2.4.5. Evaluacin e interpretacin del resultado ..................................................... 17
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ndice de materias
2.5. Determinacin del punto de congelacin.................................................... 19
2.5.1. Objetivo ........................................................................................................ 19
2.5.2. Introduccin .................................................................................................. 19
2.5.3.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 19
2.5.3.3 Equipo ........................................................................................................................................... 19
2.5.3.4 Otros materiales............................................................................................................................. 19
2.6. Determinacin de la densidad ...................................................................... 21
2.6.1. Objetivo ........................................................................................................ 21
2.6.2. Introduccin .................................................................................................. 21
2.6.5. Clculos........................................................................................................ 21
2.7. Determinacin del contenido de grasa en la leche..................................... 22
2.7.1. Objetivo ........................................................................................................ 22
2.7.2. Introduccin .................................................................................................. 22
2.7.3. Mtodo gravimtrico ..................................................................................... 22
2.7.4. Mtodo volumtrico ...................................................................................... 22
2.7.5. Determinacin del tenor graso utilizando el mtodo de Gerber .................... 23
2.7.5.1 Materiales usados para el ensayo .................................................................................................. 23
2.7.5.2 Metodologa de anlisis................................................................................................................. 23
2.7.5.3 Observaciones ............................................................................................................................... 24
2.8. Determinacin del extracto seco no graso ................................................. 25
2.8.1. Objetivo ........................................................................................................ 25
2.8.2. Introduccin .................................................................................................. 25
2.9. Ensayo de reduccin del azul de metileno (ensayo de resazurina) .......... 26
2.9.1. Objetivo ........................................................................................................ 26
2.9.2. Introduccin .................................................................................................. 26
2.9.3.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 26
2.9.4. Metodologa de anlisis ............................................................................... 26
II Alteracin y adulteracin de la leche cruda....................................... 27

2.10. Ensayo cualitativo para verificar la presencia de amidas en leche ......... 27
2.10.1. Introduccin .................................................................................................. 27
2.10.2.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 27
2.10.2.3 Equipos.......................................................................................................................................... 27
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2.11. Ensayo cualitativo para verificar la presencia de sacarosa en leche .... 28
2.11.1 Introduccin .................................................................................................. 28
2.11.2.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 28
2.11.2.3 Equipos.......................................................................................................................................... 28
2.12. Ensayo cualitativo para verificar la presencia de cloruros en leche ..... 29
2.12.1. Introduccin .................................................................................................. 29
2.12.1.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 29
2.13. Evaluacin de la presencia de formalina como conservante de la leche. 30
I Mtodo de la floroglucina....................................................................................... 30
2.13.1.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 30
II Mtodo del cloruro frrico..................................................................................... 30
2.13.4.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 30
2.14. Evaluacin de la presencia de perxido de hidrgeno como conservante
en la leche................................................................................................................... 31
I Primer mtodo: con guayacol................................................................................ 31
2.14.1.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 31
II Segundo mtodo: con pentxido de vanadio ...................................................... 31
2.14.4.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 31
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2.15. Adulteracin de la leche cruda (mtodos rpidos)..................................... 32
I Ensayo para la deteccin de perxido de hidrgeno...................................... 32
II Ensayo para la deteccin de sal ....................................................................... 32
III Ensayo para la deteccin de jabn en polvo ................................................... 32
IV Ensayo para la deteccin de detergentes en la leche ..................................... 32
V Ensayo para la deteccin de almidn ............................................................... 32
VI Ensayo para la deteccin de glucosa ............................................................... 32
VII Ensayo para la deteccin de urea ..................................................................... 33
III Anlisis microbiolgicos..................................................................... 34

2.16. Recuento de bacterias esporuladas totales y termorresistentes.............. 34
2.16.1. Objetivo ........................................................................................................ 34
2.16.2. Definiciones .................................................................................................. 34
2.16.2.1 Esporas .......................................................................................................................................... 34
2.16.3. Introduccin .................................................................................................. 34
2.16.3.1 Bacterias termfilas formadoras de esporas .................................................................................. 34
2.16.3.2 Bacterias mesfilas formadoras de esporas ................................................................................... 34
2.16.4.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 35
2.16.4.3 Equipos.......................................................................................................................................... 35
2.16.5.1 Preparacin de la dilucin 10-1 ..................................................................................................... 36
2.16.5.2 Preparacin de la serie de diluciones............................................................................................. 37
2.17. Recuento de microorganismos aerobios psicrtrofos .............................. 38
2.17.1. Objetivo ........................................................................................................ 38
2.17.2. Definiciones .................................................................................................. 38
2.17.2.1 Microorganismos psicrtrofos....................................................................................................... 38
2.17.3. Introduccin .................................................................................................. 38
2.17.4.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 39
2.17.4.3 Equipos.......................................................................................................................................... 39
2.17.4.4. Otros materiales............................................................................................................................. 39
2.17.5.1 Preparacin de las diluciones ........................................................................................................ 40
2.17.6. Evaluacin e interpretacin de los resultados .............................................. 40
3. CONTROLES DEL PROCESO DE TRATAMIENTO TRMICO Y DE

LA CALIDAD DEL PRODUCTO TRATADO TRMICAMENTE ................ 41
3.1. Recuento en placa de microorganismos aerobios mesfilos totales en
leche cruda y productos pasteurizados................................................................... 41
3.1.1. Objetivo ........................................................................................................ 41
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3.1.2. Definiciones .................................................................................................. 41
3.1.2.1 Microorganismos mesfilos .......................................................................................................... 41
3.1.3. Introduccin .................................................................................................. 41
3.1.4.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 41
3.1.4.3 Equipos.......................................................................................................................................... 42
3.1.5.1 Preparacin de las diluciones ........................................................................................................ 42
3.2. Anlisis de coliformes totales ...................................................................... 44
3.2.1. Introduccin .................................................................................................. 44
3.2.2.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 44
3.2.2.3 Equipos.......................................................................................................................................... 44
3.3. Prueba de ebullicin de la leche .................................................................. 47
3.3.1. Introduccin .................................................................................................. 47
3.4. Anlisis sensorial Prueba triangular......................................................... 48
3.4.1. Introduccin .................................................................................................. 48
3.4.2. Prueba triangular .......................................................................................... 48
3.4.2.1 Objetivo......................................................................................................................................... 48
3.4.2.2 Fundamentos del mtodo .............................................................................................................. 48
3.4.2.3 Grupo de catadores........................................................................................................................ 48
3.4.2.4 Anlisis de los resultados .............................................................................................................. 49
3.4.2.5 Observaciones ............................................................................................................................... 49
3.4.2.6 Ejemplo ......................................................................................................................................... 49
3.5. Evaluacin microbiolgica de productos lcteos UAT .............................. 52
3.5.1. Objetivo ........................................................................................................ 52
3.5.2. Introduccin .................................................................................................. 52
3.5.3.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 52
3.5.3.3 Equipos.......................................................................................................................................... 52
3.6. Tcnica de la estra en cuadrante para aislar microorganismos............... 54
3.6.1. Introduccin .................................................................................................. 54
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3.6.2.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 54
3.6.2.3 Equipos.......................................................................................................................................... 54
3.7. Determinacin del ndice de homogeneizacin .......................................... 57
I Mtodo NIZO tradicional....................................................................................... 57
3.7.1.2 Equipos.......................................................................................................................................... 57
3.7.3.1 Ejemplo ......................................................................................................................................... 57
II Mtodo alternativo ............................................................................................... 58
3.7.4.2 Equipos.......................................................................................................................................... 58
4. CONTROLES DEL CIP Y DEL PERXIDO DE HIDRGENO EN LA

PRODUCCIN ASPTICA........................................................................ 59
4.1. Evaluacin de residuos de perxido en agua ............................................. 59
4.1.1. Enfoque analtico .......................................................................................... 59
4.1.1.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 59
4.1.1.3 Procedimiento ............................................................................................................................... 59
4.1.1.4 Clculos......................................................................................................................................... 59
4.1.1.5 Reaccin ........................................................................................................................................ 59
4.1.2. Otro enfoque................................................................................................. 59
4.2. Evaluacin de la concentracin de perxido de hidrgeno ...................... 61
4.2.4. Concentraciones de perxido de hidrgeno requeridas durante la produccin
con mquinas envasadoras TBA .............................................................................. 61
4.2.5. Verificacin del consumo de perxido de hidrgeno en mquinas
envasadoras TBA/3 .................................................................................................. 61
4.3. Eficiencia de CIP Mtodo microbiolgico tradicional y mtodo rpido de
bioluminiscencia ........................................................................................................ 62
I Mtodo microbiolgico tradicional...................................................................... 62
II Otro mtodo microbiolgico ............................................................................... 62
III Mtodo rpido de bioluminiscencia .................................................................. 64
4.3.1. Fundamentos del mtodo ............................................................................. 64
4.3.2. Procedimiento de anlisis ............................................................................. 64
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ndice de materias
4.4. Evaluacin de la concentracin de los agentes de limpieza ..................... 65
4.4.1. Concentracin de la solucin de soda custica (NaOH):.............................. 65
4.4.2. Concentracin de la solucin de cido ntrico (HNO3): ................................ 65
4.4.3. Preparacin del indicador ............................................................................. 66
4.4.3.1 Fenolftalena.................................................................................................................................. 66
4.4.3.2 Rojo de metilo ............................................................................................................................... 66
5. HIGIENE PERSONAL Y AMBIENTAL.............................................. 67

5.1. Carga microbiana del aire - Mtodo de sedimentacin .............................. 67
5.1.1. Materiales usados para el ensayo con Petrifilm ........................................ 67
5.1.1.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 67
5.1.1.3 Equipos.......................................................................................................................................... 67
5.1.2. Metodologa de anlisis utilizando Petrifilm .............................................. 67
5.1.3. Evaluacin e interpretacin de los resultados obtenidos con Petrifilm...... 67
5.1.4. Materiales usados para el ensayo con cajas de Petri................................... 68
5.1.4.2 Reactivos ....................................................................................................................................... 68
5.1.4.3 Equipos.......................................................................................................................................... 68
5.1.5. Metodologa de anlisis utilizando cajas de Petri ......................................... 68
5.1.6. Evaluacin e interpretacin de los resultados de las cajas de Petri ............. 68
5.2. Carga microbiana del aire Dispositivo toma muestra porttil ................ 69
5.3. Evaluacin de la higiene de las manos ....................................................... 71
5.3.1. Evaluacin microbiolgica de las manos del operador ................................. 71
5.3.2. Evaluacin microbiolgica de las manos antes y despus de lavarlas y
desinfectarlas ........................................................................................................... 71
5.3.2.1 Metodologa de anlisis................................................................................................................. 71
5.3.2.2 Evaluacin e interpretacin del resultado...................................................................................... 71
6. REFERENCIAS Y LECTURA ADICIONAL....................................... 72
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Rutinas del laboratorio de lechera
1. INTRODUCCIN
El propsito de este documento es servir como pauta para las rutinas diarias de control de
calidad en una industria lechera. Cubre los mtodos de ms comunes de control de
calidad, pero no pretende ser completo debido a los continuos descubrimientos y nuevos
desarrollos en el campo de las tcnicas cientficas aplicables al control de calidad
industrial.
El campo de aplicacin de la presente pauta es la industria lctea. Recomienda
procedimientos para las materias primas, as como para el producto intermedio y final.
No obstante, se enfoca principalmente en la leche comn y puede por lo tanto haber otros
controles de calidad importantes para otros productos lcteos que no estn incluidos en
esta pauta.
Este documento es una descripcin de mtodos y de procedimientos usuales en la
actualidad en la industria, y no pretende satisfacer los posibles requerimientos legales
para controles de calidad, cuya responsabilidad queda para cada productor en particular.
Adems es importante notar que algunos de los siguientes mtodos pueden ser bien
conocidos y usados en ciertos pases, pero no tener una aplicacin universal sino slo
regional.
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2. CONTROL DE CALIDAD DE LAS MATERIAS PRIMAS

I Anlisis fisicoqumicos
2.1. Determinacin de valores de pH
2.1.1. Objetivo
Evaluar el pH en alimentos lquidos como control de calidad preliminar para identificar
un estropeo microbiolgico as como una contaminacin qumica.
2.1.2. Definiciones
pH es el logaritmo de la inversa de la concentracin de iones hidrgeno, expresada en

moles por litro:
pH = log (1 / [H+] ) = - log [H+]
La escala de pH se usa comnmente entre los valores de 1-14 y por lo general en

soluciones acuosas. [50]
Solucin reguladora es una solucin que, dentro de ciertos lmites, resiste los
intentos de modificar su pH. El valor de pH sufre pocos cambios debido a la adicin de
cidos o de bases. Es bsicamente o un cido dbil con su correspondiente sal o una base
dbil con su correspondiente sal.
2.1.3. Fundamento del mtodo

Consiste en la evaluacin de la concentracin de iones hidrgeno (pH) usando un
potencimetro.
2.1.4. Materiales usados para el ensayo
2.1.4.1. Material de vidrio

- Vaso de precipitados (50 ml)
2.1.4.2. Reactivos
- Soluciones reguladoras (pH = 4.0 y 7.0)
- Solucin de cloruro de potasio
- Agua destilada
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2.1.4.3. Equipos
- Potencimetro
2.1.4.4. Otros materiales

- Papel para secar el electrodo
2.1.5. Metodologa de anlisis

- Calibre el potencimetro, primero en una solucin reguladora de pH = 7.0 y luego en
otra de pH = 4.0 (enjuague el electrodo con agua destilada entre ambas soluciones).
- Tras la calibracin, lave el electrodo con agua destilada, squelo ligeramente con papel
absorbente, y sumrjalo en el vaso que contiene a la muestra.
- Proceda a leer el valor de pH.
- Lave, seque y almacene el electrodo en una solucin de cloruro de potasio.
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2.2. Determinacin de la acidez de la leche

2.2.1 Objetivo
Evaluar la acidez de muestras de leche sometidas a titulacin con una solucin normal de
NaOH, a fin de identificar el resultado de un metabolismo microbiolgico intenso en la
muestra y obtener una estimacin aproximada de la calidad de la leche.
2.2.2 Definiciones
2.2.2.1 Indicadores
Son cidos o bases dbiles que muestran cambios de coloracin dentro de un rango
estrecho de pH. Estos cambios de color son debidos a modificaciones estructurales,
incluyendo aqullas relacionadas con la produccin de formas de resonancia como las
que se producen en la fenolftalena. La forma cida (incolora) predomina a pH menor
que 8,2, mientras que la cida (rosa) se manifiesta a pH mayor que 10,0. A pH 9,4 (punto
de viraje) puede encontrarse la misma cantidad de las dos formas.
2.2.3 Introduccin
La evaluacin de la acidez puede proporcionar datos acerca del estado de conservacin
del producto. Los mtodos de evaluacin de la acidez pueden confirmar la acidez de la
muestra sujeta a titulacin o bien suministrar informacin sobre la concentracin de iones
hidrgeno libres (pH).
Los mtodos de titulacin usan indicadores, que o se colorean o cambian su color a
ciertas concentraciones de iones hidrgeno cuando se titula con una solucin alcalina
normalizada. La acidez puede expresarse en ml de una solucin normalizada, porcentaje
o gramos del principal componente cido.
En el caso de la leche la acidez se expresa usualmente en grados Soxhlet, grados Dornic,
o porcentaje de cido lctico.
2.2.3.1 La acidez natural de la leche

La acidez natural de la leche es debida a:
- La presencia en solucin de fosfatos cidos, citratos, casena, albmina y dixido de
carbono.
- Reacciones secundarias desencadenadas por los fosfatos.
- La cantidad constante de casena y fosfatos presente, que no aumenta y no agra la
leche.
- Ausencia de cido lctico libre en el caso de la leche recin ordeada.
2.2.3.2 Acidez adquirida

Esta acidez se debe principalmente al cido lctico formado por la degradacin
microbiana de la lactosa y, ocasionalmente, a modificaciones en los lpidos. En el
metabolismo microbiano cada molcula de lactosa se descompone en cuatro molculas de
cido lctico segn la reaccin:
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C12H22O11 + H2O 4 C3H6O3

La acidez adquirida a causa de la fermentacin lctica contribuye a disminuir el pH hasta
alcanzar valores en el rango de 4-5. Todos los cidos orgnicos presentes en la leche
estn en este rango.
2.2.3.3 Acidez potencial

Es la acidez sujeta a titulacin. La titulacin con una solucin de hidrxido de sodio
evala la cantidad de iones hidrgeno presentes inicialmente en la leche ms los que se
liberan durante la titulacin.
La acidez potencial o titulable puede expresarse en varias unidades: los grados Soxhlet-
Henkel (SH), grados Dornic (D), grados Thrner y el porcentaje de cido lctico son
los ms comunes.
Los grados Soxhlet-Henkel (SH) se obtienen titulando 100 ml de leche con una solucin
de hidrxido de sodio N/4; cada mililitro corresponde a 1SH. Una leche recin ordeada
debe tener entre 6,4 y 7,2SH.
Los grados Dornic (D) se obtienen titulando 100 ml de leche con una solucin de
hidrxido de sodio N/9; cada mililitro corresponde a 1D. El valor normal de la acidez
potencial de la leche est entre 15 y 22 grados Dornic.
Los grados Thrner (Th) se obtienen titulando 100 ml de leche con una solucin de
hidrxido de sodio 0.1N, cada mililitro corresponde a 1Th.
El porcentaje de cido lctico se obtiene dividiendo los grados Dornic por 100.
Tabla de factores de conversin:
SH Th D % a.l.
SH 1 2,5 2,25 0,0225
Th 0,4 1 0,9 0,009
D 0,444 (= 4/9) 1,111 (= 10/9) 1 0,01
2.2.3.4 Explicacin de la conversin

Un mol de cido lctico (90g) neutraliza a un mol de hidrxido de sodio (40g). Una
solucin de un grado Dornic contiene 4,44g de NaOH (40/9) en 1000 ml de agua, y una
solucin 0.1N de NaOH contiene 4.00g de la misma base en el mismo volumen.
CH3CH(OH)COOH + NaOH CH3CH(OH)COONa + H2O

90g 40g
Por eso, la relacin entre esas dos cantidades nos lleva a la conclusin de que:
- un grado Dornic es equivalente a 1,111 (= 4.44/4) ml de una solucin de hidrxido
sodio 0.1N.
La relacin entre las otras unidades puede calcularse de igual manera.
Ejemplo prctico
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Digamos que la titulacin de 10 ml de leche consume 1,9 ml de una solucin 0.1N de

hidrxido de sodio. Convirtiendo la acidez de la leche a las diferentes unidades
obtenemos:
1,9 ml multiplicado por un factor 10 para obtener Th (porque se refieren a 100ml de
leche): 19Th
19Th multiplicado por un factor 0,9 para obtener 17,1D y stos se dividen por 100 para
obtener el porcentaje de cido lctico, es decir 0,171%.
El valor en SH es igual a 19 ml multiplicado por un factor 0,4; es decir 7,6SH.
2.2.3.5 Acidez real

La acidez real de la leche depende de la concentracin de iones hidrgeno y se evala por
medio del valor de pH usando un pH-metro.
El contenido de sales orgnicas de la leche la convierte en un sistema tampn que no
vara su pH dentro de ciertos lmites y es responsable de la estabilidad de las protenas.
No hay una relacin directa entre la acidez real y la acidez potencial (acidez total). La
leche fresca puede mostrar una elevada acidez potencial y una baja acidez real o
viceversa.
La fermentacin lctica no afecta inicialmente a la acidez real y el valor de pH no vara.
Esto significa que un incremento de la acidez potencial no necesariamente implica una
modificacin del pH o de la acidez real. Para leche fresca se considera normal un rango
de pH de 6,6-6,8.
2.2.3.6 Factores que influyen en el aumento de la acidez

- Condiciones y tiempo de conservacin de la leche.
- Leche de vacas que sufrieron una mastitis severa.
- Raza de las vacas.
- Presencia de calostro (leche de los primeros cuatro das tras la paricin).
- Influencia de la alimentacin de las vacas.
2.2.4 Materiales usados para el ensayo
2.2.4.1 Material de vidrio

- Pipetas volumtricas (10 ml)
- Matraz de Erlenmeyer (125 ml)
- Bureta graduada (10 ml).
2.2.4.2 Reactivos
- Solucin de hidrxido de sodio 0.1N o solucin alcalina de Dornic (NaOH N/9)
- Solucin alcohlica de fenolftalena: 2 g de indicador en 75 ml de etanol al 95% ms
20 ml de agua.
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2.2.5 Recomendaciones del mtodo

- Use material bien seco porque la presencia de agua en el indicador interfiere en la
titulacin.
- Se recomienda usar dos gotas de indicador (aproximadamente 0.1 ml) para determinar
la acidez. Se puede detectar una diferencia de hasta 3D cuando se usan cantidades
mayores (diez gotas).
- Cuando se ensaya leche en polvo debe realizarse una reconstitucin adecuada antes del
anlisis. Por ejemplo:
Leche en polvo entera = 1 + 7
Leche en polvo descremada = 1 + 10
- Generalmente se usan 5 g de SNG (slidos no grasos) reconstituidos con agua. La
cantidad final de mililitros usados en la titulacin debe multiplicarse por el factor 2 (ya
que por norma se refiere a 10 g de SNG)
- Siga la titulacin con un control para saber cundo ha llegado al punto de viraje (se
desarrollar una suave coloracin rosa).
2.2.6 Metodologa de anlisis

- Transfiera con la pipeta 10 ml de la muestra a un matraz de Erlenmeyer de 125 ml.
- Agregue unas dos gotas de la solucin alcohlica de fenolftalena al 1%.
- Proceda a titular usando el hidrxido de sodio 0.1N hasta que aparezca una coloracin
rosada.
- Lea y registre el resultado en mililitros de solucin alcalina y luego multiplique por el
factor apropiado (ver tabla en 2.2.3.3). [4, 5, 50]
QAM-588017-0501 15
2.3. Prueba de alcohol

2.3.1. Objetivo
Evaluar la estabilidad de las protenas de la leche mediante su precipitacin con alcohol a
diferentes concentraciones.

- Cajas de Petri
- Pipetas graduadas (2 ml)
2.3.2.2. Reactivos
- Soluciones de etanol neutralizadas (pH 7,0) de 70, 72, 74, 75, 76, 78 y 80GL (grados
Gay-Lussac).

- Transfiera a una caja de Petri 2 ml de leche y 2 ml de etanol 74 GL con una pipeta
graduada (2 ml); agite la caja cuidadosamente.
- Si no se forman cogulos ni escamas efecte un nuevo anlisis aumentando la
concentracin de alcohol. Estos anlisis deben llevarse a cabo hasta que se observen
cogulos o escamas.
2.3.4 Evaluacin e interpretacin del resultado

- El nmero de alcohol es la mayor concentracin de alcohol que, mezclada con la
misma cantidad de leche, no produce coagulacin o precipitacin.
- Observe que Tetra Pak recomienda que el producto sea estable a una solucin
alcohlica de 74 GL, mientras que la FIL sugiere 72 GL. [51, 52]
QAM-588017-0501 16
2.4. Prueba de alizarol

2.4.1. Objetivo
Estimar la calidad de las materias primas mediante la verificacin de la estabilidad de las
protenas y grado de acidez de la leche.
2.4.2. Introduccin
Este ensayo combina la prueba de alcohol y la determinacin colorimtrica del pH
(utilizando alizarina como indicador), de modo de visualizar simultneamente el punto de
coagulacin de la casena y el punto de viraje del pH.
La alizarina, cuando se expone a una solucin alcohlica (75GL), muestra la acidez y la
estabilidad de las protenas de la leche.

- Tubo de ensayo (20 - 25 ml)
2.4.3.2 Reactivos
- Solucin de alizarina en etanol (alizarol, comprada lista para usar o preparada en el
laboratorio): disuelva 2 g de alizarina en 100 ml de etanol neutralizado de 75GL.

- Pipetee 2 ml de leche y 2 ml del reactivo en el tubo de ensayo; agite lentamente
invirtiendo el tubo.
2.4.5. Evaluacin e interpretacin del resultado

- Color violeta: muestra alcalina.
- Color amarillo: leche cida.
- Color marrn rojizo: leche normal.
No hay coagulacin en leche normal; slo ocurre cuando la acidez es elevada.
Criterios para la evaluacin de la prueba de alizarol:
Leche pH %a.l. Floculacin Color
Leche fresca 6,66 - 6,75 0,14 0,16 Ninguna Prpura claro
Ligeramente 6,30 6,50 0,17 Posibles pequeas Castao

cida escamas rosado
cida 6,00 6,20 0,18 0,19 Pequeas escamas Amarillo

castao
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Muy cida <6,00 0,20+ Grandes escamas Amarillo

Coagulacin 6,60 6,75 0,14 0,16 Grandes escamas Prpura claro
dulce
Mastitis 6,80 + NA Pequeas escamas Violeta
lcali 6,80 + NA Ninguna Violeta

agregado
[52]
QAM-588017-0501 18
2.5. Determinacin del punto de congelacin

2.5.1. Objetivo
Evaluar el punto de congelacin de la leche para detectar una posible adulteracin por
agregado de agua al producto.
2.5.2. Introduccin
La evaluacin del punto de congelacin de la leche se realiza mediante un crioscopio
digital. La adicin de agua a la leche no slo reduce su calidad sino que tambin puede
llevar a un deterioro o contaminacin que resulten en un riesgo para la salud. La leche
tiene un punto de congelacin promedio de -0,54C, cuando se mezcla con agua su punto
de congelacin estar ms cercano a 0C.

- Tubos de crioscopia
- Pipeta graduada (2 ml)
2.5.3.2 Reactivos
- Soluciones de calibracin para el equipo y solucin anticongelante:
Solucin patrn A: agua destilada (punto de congelacin: -0,000C)
Solucin patrn B: solucin de cloruro de sodio (punto de congelacin: -0,600C).
Para prepararla coloque aproximadamente 12 g de cloruro de sodio en una mufla a
300C durante 5 h o a 130C durante por lo menos 24 h. Enfre la muestra en un
desecador. Pese exactamente 10,161 g y disulvalos en agua destilada, llevando el
volumen a 1000 ml. Deje estabilizar la solucin durante 24 h.
Un lquido de refrigeracin adecuado para el crioscopio es una solucin acuosa con
33% de polipropiln-glicol.
2.5.3.3 Equipo
- Crioscopio de resistencia trmica
2.5.3.4 Otros materiales

- Papel absorbente
- Gradilla
QAM-588017-0501 19

Ensaye la muestra y la solucin de cloruro de sodio una vez que hayan alcanzado la
misma temperatura.
Si la acidez total de la muestra supera los 20 ml de hidrxido de sodio 0,1 N por 10 g de
slidos no grasos, el resultado final no ser representativo de la leche original.
Proceda de acuerdo con las instrucciones suministradas por el fabricante del equipo.
[28, 30]
QAM-588017-0501 20
2.6. Determinacin de la densidad

2.6.1. Objetivo
Analizar la densidad de la leche para estimar el contenido de slidos.
2.6.2. Introduccin
La densidad de la leche vara entre 1,028 y 1,033 g/ml a 15.5C.
La densidad vara en funcin de la temperatura de la leche, su lavado y descremado.
Componentes de la leche:
- Agua: d = 1,000 g/cm3
- Grasas: d = 0,930 g/cm3
- Protenas: d = 1,346 g/cm3
- Lactosa: d = 1,666 g/cm3

- Probeta graduada
- Lactodensmetro

- Vierta lentamente unos 250 ml de leche en la probeta graduada, cuidando de no generar
espuma.
- Introduzca el lactodensmetro cuidadosamente. Despus de su estabilizacin registre la
temperatura (T) y la densidad (Dt). La densidad se refiere generalmente a una
temperatura de 20C (a veces 27C en pases tropicales). [1]
2.6.5. Clculos
Aplique una de las siguientes frmulas:
D = Dt + (T 20) x 0,25 (densmetro calibrado a 20C)
D = Dt + (T - 27) x 0,30 (densmetro calibrado a 27C), donde se ha supuesto que se trata
de un densmetro de Quevenne cuyo vstago est graduado en milsimas de la densidad
por encima de la unidad y:
1,0D = densidad en g/ml a la temperatura de referencia (20C 27C, respectivamente)
Dt = lectura del densmetro a temperatura T
T = temperatura de la lectura (no debera variar ms que 5C respecto a la temperatura
de referencia).
Si el lactodensmetro est graduado directamente en densidades la frmula a utilizar es:
d = dt + 0,0002 (T Tr), donde:
d = densidad a la temperatura de referencia (Tr) en g/ml
dt = densidad leda a la temperatura del ensayo (T).
QAM-588017-0501 21
2.7. Determinacin del contenido de grasa en la leche

2.7.1. Objetivo
Evaluar el contenido de grasa o lpidos en muestras de leche a fin de cumplir requisitos
legales y comerciales.
2.7.2. Introduccin
Se utilizan dos mtodos para evaluar el tenor graso de la leche:
- mtodo gravimtrico, y
- mtodo volumtrico.
2.7.3. Mtodo gravimtrico

Este mtodo es la tcnica ms comn para el anlisis de grasas en alimentos. Est basado
en la extraccin continua de lpidos mediante solventes orgnicos, principalmente ter
etlico, ter de petrleo o benceno. Se usa un extractor de Soxhlet para remover el
solvente, y luego se pesan los lpidos y se determina su contenido.
En algunos alimentos, como la manteca y la margarina, el contenido de grasa puede
evaluarse por diferencia. En este mtodo gravimtrico, el alimento se coloca en un matraz
apropiado y se calienta sobre un mechero de Bunsen, para liberar el agua que contiene.
Luego se determina en primer lugar el contenido de sustancias voltiles calentando en un
horno a 105C, y despus se lleva a cabo la extraccin directa de grasas agregando ter
etlico, agitando, decantando y separando la grasa de la solucin etrea. La grasa se seca
luego en un horno a 105C, se enfra y pesa. El contenido de grasa se obtiene por
diferencia de pesos.
Algunos alimentos, tales como mezclas lcteas, productos de soja y productos de trigo
(en polvo y con fibra), contienen lpidos que estn ntimamente asociados con protenas e
hidratos de carbono. Para estos alimentos es necesario un tratamiento previo de hidrlisis
cida, preferentemente usando cido clorhdrico concentrado y calor. Tras la hidrlisis, la
grasa se somete a secado y la cantidad presente se determina por gravimetra tras una
extraccin continua con ter de petrleo a 40-60C (mtodo de Weibull-Stoldt).
El mtodo de extraccin directa en fro se usa habitualmente para el anlisis de grasas en
alimentos lquidos. En este mtodo, que es til cuando no se requiere calentamiento para
la extraccin, la muestra se coloca en una ampolla de decantacin y se pesa. Adems, este
mtodo puede utilizarse en otros ensayos, como la evaluacin del contenido de perxidos
y la reaccin de Kreiss. [6, 14]
2.7.4. Mtodo volumtrico

El mtodo de Gerber es el ms aplicado para la determinacin de lpidos en leche y otros
productos lcteos como la crema de leche, quesos y yogur.
Este mtodo se basa en la liberacin de la grasa por descomposicin de la capa de
protena (casena) que rodea los glbulos de grasa en la emulsin lctea. Esto se consigue
por agregado de cido sulfrico de densidad 1.815 g/ml. Tambin se agrega alcohol
amlico para evitar la formacin de espuma y facilitar la separacin de la capa de grasa
del resto del alimento. La separacin se logra por centrifugacin en una centrfuga de
QAM-588017-0501 22
Gerber. El contenido de grasa se lee directamente en el butirmetro, sea en porcentaje en

peso o en volumen.
Para determinar automticamente el contenido de grasa de la leche y de otros productos
lcteos pueden utilizarse equipos como el Milko-tester. [3]
2.7.5. Determinacin del tenor graso utilizando el mtodo de Gerber
2.7.5.1 Materiales usados para el ensayo

Material de vidrio
- Pipeta volumtrica (11 ml)
- Pipetas graduadas (1 y 10 ml)
Reactivos
- cido sulfrico (d =1.812-1.820 a 20C)
- Alcohol amlico (d = 0.808-0.814 a 20C)
Equipos
- Centrfuga de Gerber calentada o centrfuga de Gerber y bao de agua a 65C (puede
usarse otra centrfuga en lugar de la de Gerber)
- Butirmetro de Gerber para leche u otro
- Termmetro (0-100C)
Otros materiales
- Gradilla para butirmetros
- Papel absorbente
- Pera de goma
- Pao
2.7.5.2 Metodologa de anlisis

- Transferir 10 ml de cido sulfrico al butirmetro usando una pipeta graduada.
- Agregar lentamente 11 ml de la muestra con la pipeta volumtrica. Debe prestarse
atencin a que no se queme la muestra al entrar en contacto con el cido. Para ello no
debe mezclarse con el cido, formando una capa sobre el mismo.
- Agregue inmediatamente 1 ml de alcohol amlico. Todos estos agregados deben
efectuarse sin mojar la parte interna del cuello del butirmetro (si ello ocurre, lmpielo
cuidadosamente con un papel absorbente).
- Coloque el tapn del butirmetro, envulvalo en un pao y agite en forma efectiva pero
con cuidado, sujetando el tapn con el pulgar, hasta que los lquidos se hayan disuelto
completamente.
- Ubique el butirmetro en la centrfuga, lleve sta a la velocidad requerida para alcanzar
una aceleracin centrfuga de (35050)g en 2 min y luego mantenga la velocidad
durante 4 min.
- Retire el butirmetro de la centrfuga y de ser necesario ajuste el tapn para ubicar la
columna de grasa dentro de la escala. Si la centrfuga no est calentada introdzcalos
QAM-588017-0501 23
con el tapn hacia abajo en un bao Mara a (652)C durante no menos de 3 min y
no ms de 10 min (con el nivel de agua sobre la parte superior de la columna de grasa).
- Manipulando el tapn, ajuste la lnea divisoria entre la grasa (capa transparente color
amarillo plido) y la mezcla restante a una raya de graduacin entera de la escala del
butirmetro.
- La lectura de la capa aceitosa (posicin del menisco superior de la columna menos
posicin del inferior) puede usarse para calcular los gramos de grasa por 100 g o por
100 ml de leche.
2.7.5.3 Observaciones
- Este mtodo debe usarse solamente con reactivos de alta calidad cuyas densidades sean
las indicadas ms arriba.
- Observe el orden en que se colocan cuidadosamente la muestra y los reactivos en el
butirmetro. El cido es ms denso que la leche y si se agregase tras la misma pasara a
travs de ella y la quemara. Por otra parte, el alcohol amlico es un solvente que
disuelve y extrae las grasas; si se agrega antes que la leche causara una coagulacin de
las protenas.
- Note que los butirmetros deben colocarse en la centrfuga de forma de balancear sus
pesos (generalmente de a pares).
- Si no se usa una centrfuga calentada, use un bao de agua para calentar las muestras
tras el centrifugado. [6]
QAM-588017-0501 24
2.8. Determinacin del extracto seco no graso

2.8.1. Objetivo
Determinar el extracto seco total y el extracto seco no graso de una muestra de leche.
2.8.2. Introduccin
El extracto seco total (o slidos totales) est representado principalmente por las
protenas, lactosa y grasa presentes en la leche. Pueden ocurrir variaciones del mismo
debidas a factores tales como la raza del ganado, su alimentacin, perodo de lactacin,
etc.
El extracto seco no graso es la diferencia entre el extracto seco total y el contenido de
materia grasa encontrado en la leche.

- Discos de Ackermann

- Calcule el extracto seco total con los discos de Ackermann haciendo coincidir las
graduaciones del crculo interior (mvil) y del crculo medio, que corresponden a la
densidad y contenido de materia grasa, respectivamente. La posicin de la flecha del
crculo interno sobre el disco exterior indica el extracto seco total (en porcentaje en
peso).
- El extracto seco no graso se determina sustrayendo el porcentaje en peso de materia
grasa del valor ledo de extracto seco total. [11]
QAM-588017-0501 25
2.9. Ensayo de reduccin del azul de metileno (ensayo de

resazurina)
2.9.1. Objetivo
Estimacin de la carga total de una muestra de leche por un mtodo rpido indirecto.
2.9.2. Introduccin
La evaluacin de la cantidad total de microorganismos presentes en la leche puede
hacerse mediante mtodos directos o indirectos.
Los procesos indirectos se aplican ms usualmente por su velocidad y bajo costo. Sin
embargo, no son tan precisos como los directos. El mtodo indirecto usado ms
frecuentemente para evaluar la cantidad total de microorganismos presentes en la leche
cruda es la reduccin del azul de metileno. En este proceso se determina la calidad
bacteriolgica de la leche. Bsicamente, se agrega azul de metileno a la leche y se
determina el tiempo requerido para decolorar la mezcla. Tambin se usan otros
indicadores como la resazurina.
La precisin de este ensayo disminuye al aumentar el tiempo de almacenamiento de la
leche pues la microflora mesfila nativa de la leche es reemplazada por una microflora
psicrtrofa.

- Probeta graduada (100 ml) o tubo de ensayo ancho (3 4 cm de dimetro).
- Pipeta graduada (1 ml).
2.9.3.2 Reactivos
- Azul de metileno (se prepara una solucin saturada en etanol 96GL y se diluyen 5 ml
de la misma en 95 ml de agua estril. Descartar a los 2 meses y no exponer a la luz).

En este ensayo se colocan unos 40 ml de leche en la probeta, cuidando de no mojar las
paredes, y se agrega 1ml de la solucin de azul de metileno sin que la punta de la pipeta
entre en contacto con la leche. Esta mezcla se incuba en un bao de agua a 37C, cuyo
nivel exceda al de la leche en la probeta. Se mide el tiempo requerido para que el color
azulado se torne blanco. La leche se clasifica en tres clases segn su tiempo de
decoloracin. Cuanto ms corto sea ste, mayor ser el nivel de actividad metablica
y, consecuentemente, mayor ser la cantidad de microorganismos presentes en la
leche. [52]
Clases Tiempo
1 >2h
2 0,5 h a 2 h
3 < 30 min
QAM-588017-0501 26
II Alteracin y adulteracin de la leche cruda

2.10. Ensayo cualitativo para verificar la presencia de
amidas en leche
2.10.1. Introduccin
La amida es utilizada como espesante y corrige la densidad de la leche con agua
agregada.
En el ensayo la amida forma un compuesto de adsorcin azulado con iodo (Lugol).

2.10.2.2 Reactivos
- Solucin al 1% de yodo en alcohol (Lugol).
2.10.2.3 Equipos
- Mechero de Bunsen con tela metlica y trpode

- Bao de agua helada.

Pipetee 10 ml de la leche a ensayar en un vaso 50 ml. Caliente hasta que hierva y enfre
en el bao de agua helada. Agregue 3 gotas de la solucin al 1% de yodo en etanol o
Lugol. Observe.

- Reaccin positiva: aparece un anillo azul.
- Reaccin negativa: aparece un anillo castao.
* Observaciones:
- El color azulado desaparecer al calentar.
- Efecte siempre un ensayo sobre un blanco.
QAM-588017-0501 27

sacarosa en leche
2.11.1 Introduccin
Puede agregarse sacarosa a la leche para enmascarar la adicin de agua y aumentar la
densidad.
En el ensayo la sacarosa (como cualquier aldosa) se combina con resorcina produciendo
una coloracin rosada.

- Tubos de ensayo (25 ml, 20x200)
2.11.2.2 Reactivos
- cido clorhdrico concentrado
- Solucin al 20% de resorcina en alcohol
2.11.2.3 Equipos
- Bao de agua con termostato

Pipetee 10 ml de la leche sospechosa en un tubo de ensayo. Agregue 1 ml de cido
clorhdrico concentrado y 2 gotas de la solucin de resorcina al 20% en alcohol. Agite
cuidadosamente. Caliente en un bao de agua hirviente durante 5 min. Observe.

- Reaccin positiva: coloracin rosada rojiza.
- Reaccin negativa: coloracin azul amarillenta.
* Observacin:
No considere el resultado si el color aparece tras un corto lapso de tiempo, pues ser
causado por hidrlisis de la lactosa.
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cloruros en leche
2.12.1. Introduccin
Este ensayo est basado en la precipitacin de los cloruros en forma de cloruro de plata.
La presencia de cloruros en la leche puede indicar un uso extensivo de fertilizantes
qumicos en el forraje para las vacas (pesticidas).

- Pipetas graduadas (1,5 y 10 ml)
- Tubos de ensayo
2.12.1.2 Reactivos
- Solucin de nitrato de plata 0,1N
- Solucin de cromato de potasio al 5%

- Vierta 5 ml de leche en un tubo de ensayo.
- Agregue 4-5 gotas de la solucin acuosa de cromato de potasio al 5% y revuelva.
- Agregue 2,5 ml de nitrato de plata 0,1N y revuelva.

Un color amarillento indica la presencia de cloruros en cantidad mayores a la normal. Si
la cantidad de cloruros estuviese dentro del rango normal para la leche, el color puede
variar de anaranjado oscuro a rojo oscuro.
QAM-588017-0501 29
2.13. Evaluacin de la presencia de formalina como

conservante de la leche
I Mtodo de la floroglucina
La floroglucina reacciona con la formalina produciendo un derivado hidroximetilado
rojizo.

- Tubos de ensayo
2.13.1.2 Reactivos
- Solucin de floroglucina al 1%
- Solucin de hidrxido de sodio (NaOH) al 10%

Transfiera 10 ml de leche a un tubo de ensayo y agregue 1 ml de solucin de floroglucina
al 1% y 2 ml de solucin de hidrxido de sodio al 10%.

Si hay formalina presente, aparecer un color rosado salmn. La reaccin es rpida.
II Mtodo del cloruro frrico

- Probeta graduada (5 ml)
- Tubos de ensayo
2.13.4.2 Reactivos
- cido sulfrico (1+1)
- Solucin de cloruro frrico (FeCl3) al 1%

Transfiera 5 ml de muestra y 1 ml de cido sulfrico (1+1) a un tubo de ensayo. Agregue
una gota de cloruro frrico al 1% y hierva.

Si hay formalina presente, aparecer una coloracin rosada.
QAM-588017-0501 30
2.14. Evaluacin de la presencia de perxido de hidrgeno

como conservante en la leche
I Primer mtodo: con guayacol

- Tubos de ensayo (20 ml)
2.14.1.2 Reactivos
- Solucin de guayacol al 1%
- Leche sin procesar

- Transfiera 10 ml de muestra a un tubo de ensayo.
- Agregue 2 ml solucin de guayacol al 1% y 2 ml de leche sin procesar.

La aparicin de una coloracin rosa salmn muestra que hay perxido de hidrgeno
presente en la muestra.
II Segundo mtodo: con pentxido de vanadio

- Tubo de ensayo
2.14.4.2 Reactivos
- Solucin de cido vandico al 1%: disolver 1g de pentxido de vanadio (V2O5) en 100
ml de cido sulfrico (H2SO4) al 6%

- Vierta 10 ml de leche en un tubo de ensayo.
- Agregue 10-20 gotas del reactivo. Revuelva.

Aparecer una coloracin rosada o rojiza en presencia de perxido de hidrgeno (H2O2).
[46]
QAM-588017-0501 31
2.15. Adulteracin de la leche cruda (mtodos rpidos)
I Ensayo para la deteccin de perxido de hidrgeno

Tome 5 ml de leche en un tubo de ensayo y luego agregue 5 gotas de parafenilendiamina
agitando bien. Un cambio de coloracin de la leche a azul confirma que se ha agregado
perxido de hidrgeno a la misma.
II Ensayo para la deteccin de sal

Se recurre a la adicin de sal a la leche principalmente para aumentar las lecturas
corregidas del lactmetro.
Para detectarla se toman 5 ml de nitrato de plata (0,8%) en un tubo de ensayo, se agregan
2 a 3 gotas de bicromato de potasio al 1% y 1 ml de leche y se mezclan completamente.
Si el contenido del tubo de ensayo toma un color amarillo, la leche contiene sal. Si
adquiere una coloracin chocolate, la leche est libre de sal.
III Ensayo para la deteccin de jabn en polvo

Tome 10 ml de leche en un tubo de ensayo, diluya con igual volumen de agua caliente y
luego agregue 1 2 gotas del indicador fenolftalena. El desarrollo de una coloracin rosa
indica que la leche est adulterada con jabn.
IV Ensayo para la deteccin de detergentes en la leche

Tome 5 ml de leche en un tubo de ensayo y agregue 0,1 ml de solucin de prpura de
bromocresol. La aparicin de una coloracin violeta indica la presencia de detergente en
la leche. Las muestras de leche no adulterada toman un color violeta plido.
V Ensayo para la deteccin de almidn

El agregado de almidn incrementa el contenido de SNG de la leche. Adems de almidn
tambin puede agregarse harina de trigo, tapioca y harina de arroz. Para detectarlo tome 3
ml de leche en un tubo de ensayo y hirvalo concienzudamente. Enfre luego a
temperatura ambiente y agregue 2 3 gotas de solucin acuosa de yodo al 1%. Un
cambio de la coloracin a azul indica que la leche est adulterada con almidn.
VI Ensayo para la deteccin de glucosa

Generalmente se agrega glucosa de baja calidad a la leche para incrementar las lecturas
del lactmetro. Hay dos ensayos disponibles para detectar la adulteracin de la leche con
glucosa.
1. Ensayo de Barford (cido fosfomolbdico)
Tome 3 ml de leche en un tubo de ensayo y aada 3 ml del reactivo de Barford,
mezclando a conciencia. Luego mantngalo en un bao de agua hirviente durante 3 min
y posteriormente enfre durante 2 min por inmersin en agua fra sin agitar. Agregue
ahora 1 ml de cido fosfomolbdico y agite. Si aparece un color azul, hay glucosa
presente en la muestra de leche.
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2. Ensayo del cido diactico

Tome una tira de diactico y sumrjala en la leche durante 30 s a 1 min. Si la tira cambia
el color, ello indica que la muestra de leche contiene glucosa. Si no hay cambio de
coloracin, no hay glucosa presente. En este mtodo puede cuantificarse la presencia de
glucosa en leche comparando el color desarrollado con la escala que viene en el envase
de las tiras.
VII Ensayo para la deteccin de urea

Generalmente se agrega urea en la preparacin de leche sinttica para elevar el contenido
de SNG. Hay dos ensayos disponibles para detectar esta adulteracin:
1. Ensayo del paradimetilaminobenzaldehido
Mezcle bien 5 ml de leche con 5 ml de paradimetilaminobenzaldehido al 16%. Si la
solucin se torna amarilla, la muestra de leche en cuestin tiene urea agregada.
2. Ensayo de la ureasa
Tome 5 ml de leche en un tubo de ensayo y agregue 0,2 ml de ureasa (concentracin 20
mg/ml). Agite bien a temperatura ambiente y luego agregue 0,1 ml de una solucin de
azul de bromo timol al 0.5%. La aparicin de una coloracin azul a los 10-15 min indica
una adulteracin con urea.
QAM-588017-0501 33
III Anlisis microbiolgicos

2.16. Recuento de bacterias esporuladas totales y
termorresistentes
2.16.1. Objetivo
Recuento de esporas totales y termorresistentes.
2.16.2. Definiciones
2.16.2.1 Esporas
Las esporas bacterianas son estructuras muy resistentes creadas cuando los
microorganismos formadores de esporas experimentan una sobrecarga del medio
ambiente.
Las esporas no pueden multiplicarse como tales, pero si se presentan condiciones
favorables (por ejemplo, temperatura y suministro de oxgeno correctos, etc.) cada espora
crea una clula vegetativa (viable) que es capaz de multiplicarse.
2.16.3. Introduccin
Las bacterias formadoras de esporas presentes usualmente en los alimentos pertenecen a
los gneros Bacillus, Clostridium y Desulfotomaculum. stos, debido a la resistencia
trmica de las esporas, estn generalmente asociados al deterioro de productos
procesados trmicamente y envasados en envases hermticos (productos comercialmente
estriles). La introduccin de estas esporas en dichos productos ocurre principalmente a
travs de las materias primas utilizadas en los procedimientos de formulacin, tales como
especias, azcar, harinas y leche en polvo.
Las bacterias formadoras de esporas estn divididas en dos grupos segn su resistencia
trmica y temperatura ptima de crecimiento:
2.16.3.1 Bacterias termfilas formadoras de esporas

Incluyen especies cuya temperatura ptima de crecimiento est alrededor de 55C y
cuyas esporas son muy resistentes al calor.
Hay dos tipos de generadores de esporas termfilos asociados con el deterioro de
productos comercialmente estriles: los termfilos aerobios y anaerobios.
2.16.3.2 Bacterias mesfilas formadoras de esporas

Incluyen especies cuya temperatura ptima de crecimiento est entre 30-35C, cuyas
esporas son muy resistentes al calor, y que tambin son capaces de sobrevivir a los
severos tratamientos trmicos aplicados a los alimentos de baja acidez.
Hay dos tipos de generadores de esporas mesfilos asociados con el deterioro de
productos comercialmente estriles: los mesfilos aerobios y anaerobios.
QAM-588017-0501 34

- Tubos de ensayo o matraces aforados con 9 ml 90 ml de diluyente, respectivamente
(todos estos materiales deben esterilizarse en conjunto en un autoclave a 121C durante
15 min)
- Tubos de ensayo estriles con rosca
- Cajas de Petri estriles
- Pipetas graduadas estriles (1 y 10 ml)
- Matraz de Erlenmeyer (500 1000 ml) con agar de recuento total (PCA). Pueden
prepararse tubos de ensayo con rosca, cada uno con aproximadamente 20 ml de la
preparacin (todos estos materiales deben esterilizarse en conjunto en un autoclave a
121C durante 15 min).
* Observaciones: todo el material de vidrio estril debe esterilizarse en una estufa a una
temperatura mnima de 170C durante ms de 2 h. El material de vidrio graduado debe
esterilizarse en autoclave a 121C durante 30 min.
2.16.4.2 Reactivos
- Etanol (alcohol etlico) al 70%. Preparacin: vierta aproximadamente 200 ml de etanol
absoluto en una probeta graduada de 250 ml, sumerja el alcoholmetro y agregue
gradualmente agua destilada hasta que se alcancen los 70GL. Observacin: verifique
la concentracin mensualmente, si detecta alguna variacin en la misma agregue etanol
absoluto hasta alcanzar los 70GL. Guarde la solucin dentro de un envase cerrado en
un lugar fresco.
- Medio de cultivo: agar de recuento total (PCA), infusin cerebro corazn (BHI) o
triptona-glucosa-extracto de levadura (TGY).
- Diluyente: solucin acuosa de peptona al 0,1% (1g de peptona / 1000 ml de agua
destilada), pH = 7. De ser necesario ajuste el pH, sea con cido clorhdrico 0,1 N (para
bajarlo) o con hidrxido de sodio 0,1 N (para subirlo).
2.16.4.3 Equipos
- Incubadoras a (35 y 55) 1C
- Bao termosttico a temperatura de ebullicin
- Balanza semi-analtica
- Autoclave
- Estufa de esterilizacin a 170C
- Alcoholmetro

- Lupa o contador de colonias
- Gradillas soporte para las pipetas estriles
QAM-588017-0501 35
- Mechero de Bunsen
- Fsforos
- Algodn
- Tijeras
- Cronmetro
- Agua destilada

- Agite cuidadosamente el envase.
- Limpie el exterior del envase con un algodn empapado en etanol al 70% para remover
contaminantes (limpie tambin la cara opuesta del envase).
- Abra el envase con tijera (que debe ser flameada en un mechero de Bunsen).
- Utilizando una pipeta estril, transfiera aspticamente 3-5 ml de la muestra a un tubo
de ensayo estril con rosca.
- Coloque el tubo en un bao termosttico a 80C (esporas totales) a 100C (esporas
termorresistentes) durante 10 minutes. Debe colocarse tambin en el bao un tubo
adicional con 10,0 ml de producto y un termmetro en su interior (el tiempo comenzar
a contarse cuando el termmetro del tubo adicional marque la temperatura
especificada).
- Lleve a cabo la serie de diluciones apropiada (ver punto 2.16.5.1).
- Inocule 1 ml de cada dilucin en cajas de Petri separadas, vacas y estriles (cuidando
de verter las diluciones a un costado del centro de la caja para facilitar el posterior
mezclado con el medio de cultivo). Abra las cajas cerca del mechero de Bunsen, y
apenas lo necesario para introducir la pipeta. Para aumentar la precisin del recuento se
recomienda inocular dos o ms cajas por dilucin (duplicados o triplicados).
- Agregue en las placas aproximadamente 15-20 ml de PCA, BHI o TGY previamente
fundidos y enfriados a 45-48C, temperatura a la cual el matraz no quema en contacto
con la piel (mtodo de siembra en profundidad).
- Revuelva suavemente las cajas, con movimientos en forma de ocho y cuidando que la
mezcla no toque las tapas de las cajas. Espere hasta que se solidifique el agar.
- Invierta las cajas e incbelas a 35-37C durante 48h (esporas totales), y a 35-37C a
55C durante 5 das (esporas termorresistentes mesfilas y termfilas,
respectivamente).
2.16.5.1 Preparacin de la dilucin 10-1

- Transfiera aspticamente 1 ml de muestra a un tubo de ensayo con 9 ml de diluyente, o
bien 10 ml de muestra a un matraz con 90 ml de diluyente, y agite.
- Se recomienda evitar sumergir las pipetas a una profundidad mayor que 2,5 cm
mientras se vierte el contenido (muestra) de las mismas.
- Cuando seleccione pipetas para el anlisis, elija siempre pipetas con una capacidad 10
veces mayor que el volumen a transferir. Por ejemplo, para transferir un volumen de 1
ml, use por lo menos pipetas de 10 ml.
QAM-588017-0501 36
2.16.5.2 Preparacin de la serie de diluciones

- Dilucin 10-2: transfiera aspticamente 1 ml de la dilucin 10-1 a un tubo con 9 ml de
diluyente, o 10 ml de la dilucin 10-1 a un matraz con 90 ml de diluyente, y agite.
- Las diluciones subsiguientes se obtienen de manera similar transfiriendo 1 ml 10 ml
de las diluciones previas a 9 ml 90 ml del diluyente, respectivamente.
- El diluyente utilizado para preparar las diluciones 10-2 y mayores, debe ser el mismo
que aqul utilizado en la preparacin de la primera dilucin (10-1).
- La cantidad de diluciones requeridas depende del nivel de contaminacin esperado. Por
ejemplo, si el recuento esperado en cada muestra est entre 2.500 - 25.000 ufc/g, las
diluciones recomendadas para recuento en placa son 10-1, 10-2 y 10-3, de forma de
encontrar cajas con 25 - 250. En caso de que no haya forma de evaluar previamente el
nivel de contaminacin de la muestra, debe prepararse e inocular una cantidad mayor
de diluciones (10-1 a 10-7).
- Cuando transfiera volmenes entre diluciones, use siempre una pipeta diferente para
cada dilucin. Antes de tomar la cantidad a transferir, agite vigorosamente el tubo o
matraz. La pipeta debe estar completamente llena (hasta la marca superior), incluso
cuando se descargue una cantidad menor que el volumen total de la pipeta. Se
recomienda evitar descargar la pipeta desde la ltima o anteltima marca. El lquido
debe descargarse con la punta de la pipeta tocando la pared interna del tubo o matraz,
de tal forma que fluya sobre la pared.
- Las pipetas no deben combarse. En caso de que la punta toque cualquier superficie no
estril, como por ejemplo la parte externa de la gradilla soporte, la punta de otras
pipetas, o las paredes externas de los tubos y matraces de dilucin, debe descargarse la
pipeta y reemplazarse por otra.

- Usando una lupa o un contador de colonias, cuente todas las colonias que se
desarrollen en la caja de Petri, si su cantidad est entre 25 y 250.
- Multiplique ahora la cantidad de colonias de cada caja por la inversa de la dilucin
inoculada. Si se ha utilizado ms de una caja por dilucin (duplicado o triplicado),
considere como cantidad de colonias a la media aritmtica de los recuentos obtenidos
en cada placa.
- Exprese los resultados en cantidad de esporas/ml g. Cuando presente los resultados
use notacin exponencial con slo una cifra decimal.
- Autoclave a 121C durante 30 min todas las placas antes de descartar el material. [51,
53]
QAM-588017-0501 37
2.17. Recuento de microorganismos aerobios psicrtrofos

2.17.1. Objetivo
Recuento de microorganismos aerobios psicrtrofos.
2.17.2. Definiciones
2.17.2.1 Microorganismos psicrtrofos
Estos microorganismos se desarrollan a temperaturas de entre 0C y 30C, con
temperaturas ptimas por debajo de 25C.
2.17.3. Introduccin
El mtodo de recuento en placa es un mtodo general utilizado para el recuento de
muchos tipos diferentes de microorganismos, tales como los aerobios mesfilos, aerobios
termfilos, aerobios psicrtrofos, mohos, levaduras, y otros.
Este mtodo se basa en la teora de que cada clula microbiana presente en una muestra
formar una colonia aislada y visible cuando se la fije en un medio de cultivo slido
apropiado, y que cambiando tanto el medio (de enriquecimiento, selectivo o diferencial)
como las condiciones de incubacin (temperatura y atmsfera), es posible aislar
determinados gneros o especies. Sin embargo algunos microorganismos forman grupos
que no se separan completamente durante la preparacin de la muestra, por lo que el
resultado del recuento en placa (unidades formadoras de colonias, ufc) ser menor que la
cantidad de clulas individuales presentes.
Los productos lcteos son susceptibles de contaminacin por bacterias psicrtrofas, lo
que puede llevar a un deterioro y menor calidad de dichos productos. Para determinar la
cantidad total de microorganismos aerobios psicrtrofos se recomienda utilizar el mtodo
de siembra en superficie. Este procedimiento evita exponer a las clulas a la temperatura
del agar fundido, pues son vulnerables a las altas temperaturas.

- Tubos de ensayo o matraces aforados estriles con 9 ml 90 ml de diluyente,
respectivamente
- Pipetas estriles (1 ml)
- Matraz de Erlenmeyer (500 1000 ml) con agar de recuento total (PCA) estril.
Pueden prepararse tubos de ensayo con rosca, cada uno con aproximadamente 20 ml de
la preparacin
* Observaciones: todo el material de vidrio estril debe esterilizarse en una estufa a una
QAM-588017-0501 38
2.17.4.2 Reactivos
un lugar fresco.
- Medio de cultivo: agar de recuento total (PCA).
2.17.4.3 Equipos
- Refrigerador a (6,5 0,5)C o incubadora a (18 1)C (24 1)C
- Bao termosttico
- Balanza de laboratorio
- Autoclave
- Alcoholmetro
- Estufa a (35 1)C
2.17.4.4. Otros materiales

- Asa de Drigalski
- Mechero de Bunsen
- Algodn
- Tijeras
- Agua destilada

- Abra el envase con tijeras limpias y flameadas y lleve a cabo la serie de diluciones
apropiada (ver punto 2.17.5.1).
- Es necesario preparar previamente las placas para el procedimiento de siembra en

superficie. A tal fin debe colocarse en las mismas 15-20 g de agar de recuento total
(PCA), fundirlo y dejar que vuelva a solidificar. La superficie del medio debe secarse
antes de usarlo (este proceso puede efectuarse en una estufa a 50C durante 2 h, a 30-
QAM-588017-0501 39
35C durante una noche, con las tapas colocadas, o bien en una cmara de flujo
laminar durante 0,5 a 1 h con las tapas parcialmente abiertas.
- Inocule 0,1 ml de cada dilucin sobre las superficies de las placas preparadas
previamente, usando una o ms cajas para cada dilucin. Usando un asa de Drigalski,
esparza el inculo sobre toda la superficie de la placa hasta que se absorba el lquido en
exceso. Deben usarse pipetas de 1 ml para transferir el inculo de 0,1 ml. No sople la
pipeta y no cambie la direccin de la punta de la misma al descargar la ltima gota.
- Al esparcir los inculos comience desde la placa con la mayor dilucin hasta la de
menor dilucin, esterilizando el asa de Drigalski con etanol al 70% entre aplicaciones.
* Observacin: como la cantidad de inculo usada en la siembra en superficie es 10
veces menor que aqulla usada en la siembra en profundidad, el lmite de deteccin del
mtodo est por encima de 100 ufc/g para muestras slidas y de 10 ufc/ml en el caso
de muestras lquidas. Si el nivel de contaminacin esperado para la muestra est por
debajo de dicho rango, debe inocularse una cantidad mayor de la primera dilucin,
distribuida entre varias cajas. La distribucin aplicada comnmente es: tres cajas con
0,3 ml y una con 0,1 ml. El tiempo requerido para la absorcin del lquido es mayor en
las placas donde se esparcen 0,3 ml y debe cuidarse especialmente que no queden
pelculas hmedas sobre la superficie.
- Espere a que se sequen las placas (mnimo 15 min), invirtalas e incbelas a 6,5C
durante 10 das.
* Observacin: la temperatura / tiempo de referencia para el recuento total de
microorganismos psicrtrofos es 6,5C / 10 d, pero hay diversas otras condiciones de
incubacin que pueden utilizarse en ciertas situaciones:
- Siembra en superficie: 7C / 7-8 d
- Anlisis de leche: 18C / 45 h
- Anlisis de leche y de crema de leche: 23-25C / 24-28 h
2.17.5.1 Preparacin de las diluciones

Ver puntos 2.16.5.1 y 2.16.5.2.
2.17.6. Evaluacin e interpretacin de los resultados

- Proceda a la lectura de las placas usando el mismo procedimiento que para el recuento
de esporas (descrito en el punto in 2.16.6.).
- Una vez que haya ledo todas las placas, puede identificarse el microorganismo
presente en las mismas por medio de diferentes mtodos.
44, 59]
QAM-588017-0501 40
3. CONTROLES DEL PROCESO DE TRATAMIENTO

TRMICO Y DE LA CALIDAD DEL PRODUCTO
TRATADO TRMICAMENTE
3.1. Recuento en placa de microorganismos aerobios
mesfilos totales en leche cruda y productos
pasteurizados
3.1.1. Objetivo
Recuento de la cantidad total de microorganismos aerobios mesfilos.
3.1.2. Definiciones
3.1.2.1 Microorganismos mesfilos
Estos microorganismos crecen a temperaturas entre 30C y 40C, con temperaturas
ptimas entre 30C y 35C.
3.1.3. Introduccin
Para una introduccin general a la tcnica de recuento en placa vea el punto 2.17.3.

- Tubos de ensayo o matraces aforados estriles con 9 ml 90 ml de diluyente,
respectivamente
- Matraz de Erlenmeyer (500 1000 ml) con agar de recuento total (PCA) estril.
Pueden prepararse tubos de ensayo con rosca, cada uno con aproximadamente 20 ml de
la preparacin
* Observaciones: el medio debe esterilizarse en autoclave a 121C durante 15 min.
Todo el material de vidrio estril debe esterilizarse en una estufa a una temperatura
mnima de 170C durante ms de 2 h. El material de vidrio graduado debe esterilizarse
en autoclave a 121C durante 30 min.
3.1.4.2 Reactivos
un lugar fresco.
- Medio de cultivo: agar de recuento total o de mtodos normalizados (PCA).
QAM-588017-0501 41

3.1.4.3 Equipos
- Incubadora a (30 1)C
- Autoclave
- Alcoholmetro

- Mechero de Bunsen
- Algodn
- Tijeras
- Agua destilada

- Abra el envase con tijeras limpias y flameadas y lleve a cabo la serie de diluciones
apropiada (ver punto 3.1.5.1).
- Pipetee 1 ml de cada dilucin en cajas de Petri separadas, vacas, estriles y rotuladas
(este procedimiento facilitar la mezcla subsiguiente con el medio de cultivo), abriendo
las cajas cerca del mechero de Bunsen, y apenas lo necesario para introducir la pipeta.
Para aumentar la precisin del recuento se recomienda inocular dos o ms cajas por
dilucin (duplicados o triplicados).
- Agregue en las placas aproximadamente 15-20 ml de PCA previamente fundido y
enfriado a 45-50C, temperatura a la cual el matraz no quema en contacto con la piel
(mtodo de siembra en profundidad).
- Revuelva suavemente las cajas, con movimientos en forma de ocho y cuidando que la
mezcla no toque las tapas de las cajas. Espere hasta que se solidifique el agar.
- Invierta las cajas e incbelas durante 48 h a (30 1)C (recuento en placa de aerobios
totales).
3.1.5.1 Preparacin de las diluciones

Ver puntos 2.16.5.1 y 2.16.5.2.
QAM-588017-0501 42

- Proceda a la lectura de las placas usando el mismo procedimiento que para el recuento
de esporas (descrito en el punto in 2.16.6.).
- Una vez que haya ledo todas las placas, puede identificarse el microorganismo
presente en las mismas por medio de diferentes mtodos.
33]
QAM-588017-0501 43
3.2. Anlisis de coliformes totales

3.2.1. Introduccin
Las bacterias coliformes son bacilos Gram negativos, aerobios facultativos o anaerobios,
que no forman esporas y que son capaces de fermentar a la lactosa produciendo gas en 24
a 48 h a 35C.
La presencia de coliformes en alimentos procesados se considera un indicador eficaz de
contaminaciones post-procesamiento debidas a procedimientos insuficientes de higiene o
saneamiento.

- Tubos de ensayo
- Pipetas (1 y 10 ml)
- Tubos de Durham
3.2.2.2 Reactivos
Ensayo presuntivo:
- Solucin de lauril-sulfato triptosa (LST); 10 ml por tubo
- Agua destilada
Ensayo de confirmacin de coliformes totales:
- Solucin de verde brillante lactosa bilis (VBL); 6 - 8 ml por tubo
- Agua destilada
3.2.2.3 Equipos

- Prepare la serie de diluciones del producto en solucin acuosa de peptona al 0.1%
(diluciones 10-1, 10-2 y 10-3, ver puntos 2.16.5.1 y 2.16.5.2).
* Observacin: el diluyente recomendado para analizar quesos, leche en polvo de baja
solubilidad, yogur y otras leches fermentadas es una solucin acuosa al 2% de citrato
de sodio. Para analizar leche en polvo de alta solubilidad y leche condensada
(concentrada o evaporada) se recomienda usar agua destilada estril.
- Transfiera 1 ml de la dilucin 10-1 a cada uno de una serie de tres tubos con 10 ml de
LST.
- El mismo procedimiento debe llevarse a cabo con las otras diluciones, totalizando 9
tubos.
* Observacin: las diluciones utilizadas varan segn la carga bacteriana estimada del
producto a analizar.
QAM-588017-0501 44
- Incube los tubos a 35C durante 24h. Observe si hay crecimiento bacteriano con
formacin de gas en el LST tras 24 h de incubacin. Si el resultado es negativo,
contine incubando otras 24 h ms y haga una nueva lectura.
- Transfiera mediante un asa un inculo de los tubos con LST positivos a los tubos con
VBL.
- Incube a 35C durante 24 48 h.
- Verifique la presencia de gas.

- Observe si hay crecimiento con formacin de gas en la solucin de VBL tras 24 h de
incubacin. Si el resultado es negativo, contine incubando otras 24 h y haga una
nueva lectura tras 48 h de incubacin total.
- Calcule el nmero ms probable (NMP) de coliformes totales en base a la combinacin
de tubos de LST con formacin confirmada de gas (o sea, que tambin producen gas
al ser inoculados en VBL) y la tabla adjunta. [22, 41, 42, 48]
TABLA DE NMEROS MS PROBABLES Nmeros ms probables (NMP) con

un nivel de seguridad del 95% para distintas combinaciones de tubos positivos en
series de 3 tubos. Cantidad de muestra inoculada: 10,0 - 1,0 y 0,1 g ml.
(Bacteriological Analytical Manual, 6ta edicin, E.U.A.: Food & Drug Administration,
1984)
QAM-588017-0501 45
Serie de tres tubos

Combinaciones de Nivel de seguridad: 95%
tubos positivos
NMP/g Mnimo Mximo
0-0-0 < 0,03 <0,05 <0,09
0-0-1 0,03 <0,05 0,09
0-1-0 0,03 <0,05 0,13
0-2-0 - - -
1-0-0 0,04 <0,005 0,20
1-0-1 0,07 0,01 0,21
1-1-0 0,07 0,01 0,23
1-1-1 0,11 0,03 0,36
1-2-0 0,11 0,03 0,36
2-0-0 0,09 0,01 0,36
2-0-1 0,14 0,03 0,37
2-1-0 0,15 0,03 0,44
2-1-1 0,2 0,07 0,89
2-2-0 0,21 0,04 0,47
2-2-1 0,28 0,10 1,50
2-3-0 - - -
3-0-0 0,23 0,04 1,20
3-0-1 0,39 0,07 1,30
3-0-2 0,64 0,15 3,80
3-1-0 0,43 0,07 2,10
3-1-1 0,75 0,14 2,30
3-1-2 1,20 0,30 3,80
3-2-0 0,93 0,15 3,80
3-2-1 1,5 0,30 4,40
3-2-2 2,1 0,35 4,70
3-3-0 2,4 0,36 13,0
3-3-1 4,6 0,71 24,0
3-3-2 11,0 1,50 48,0
3-3-3 >24 >1,50 >48,0
QAM-588017-0501 46
3.3. Prueba de ebullicin de la leche

3.3.1. Introduccin
Si una muestra de leche no pasa esta prueba, la misma debe contener mucho cido,
muchos microorganismos productores de sustancias que cuajan la leche, o bien un
porcentaje anormal de protenas como en el caso del calostro. Dicha leche no soportar
el tratamiento trmico durante el procesamiento y debe por lo tanto ser rechazada. [52]

- Tubos de ensayo

- Mechero de Bunsen
- Pinzas de madera

- Haga hervir una pequea cantidad de leche en un tubo de ensayo, agitando
constantemente.
- Observe si la leche se corta.

- La leche normal no se corta.
QAM-588017-0501 47
3.4. Anlisis sensorial Prueba triangular

3.4.1. Introduccin
El anlisis sensorial verifica cambios agradables y desagradables en bebidas y alimentos.
Este efecto se mide analizando estadsticamente los resultados de paneles de catadores
entrenados.
Las pruebas sensoriales estn dirigidas a informar a los productores de alimentos sobre
las preferencias de los consumidores y si el producto les resulta agradable. Un panel
sensorial ayudar al fabricante a:
1. identificar diferencias y preferencias entre las muestras;
2. seleccionar el mejor proceso para mejorar el nivel de calidad del producto;
3. desarrollar nuevos productos, y
4. evaluar cambios en la calidad del producto.
Hay varios mtodos de evaluacin, sea para describir el producto, para determinar si
resulta agradable, o para diferenciar el producto respecto de otro. Los mtodos
sensoriales son:
* Prueba de comparacin pareada
* Prueba triangular
* Prueba do-tro
* Prueba de ordenacin
* Prueba de comparaciones mltiples
Por ejemplo, la prueba triangular puede usarse para verificar si hay una diferencia
significativa entre muestras de leche chocolateada.
3.4.2. Prueba triangular

3.4.2.1 Objetivo
Verificar si hay una diferencia significativa entre dos muestras sujetas a diferentes
tratamientos. Por ejemplo, verificar si cambios en los ingredientes, procesamiento,
envasado o almacenamiento produjeron modificaciones sensoriales en el producto final.
3.4.2.2 Fundamentos del mtodo

Cada catador recibe tres muestras codificadas y es informado de que dos de ellas son la
misma cosa y la restante es diferente. Se le pide al catador que deguste las muestras, de
derecha a izquierda o viceversa, y que identifique la muestra diferente.
3.4.2.3 Grupo de catadores

Generalmente se emplean treinta a cuarenta personas para las pruebas triangulares, si bien
pueden utilizarse slo doce si las diferencias son ms bien grandes.
Los catadores o jueces no necesitan estar entrenados, pero se recomienda orientarlos
antes de llevar a cabo la prueba. Esta orientacin ayudar a la persona a familiarizarse
con el procedimiento de prueba y con el producto a probar.
QAM-588017-0501 48
3.4.2.4 Anlisis de los resultados

Para analizar los resultados es necesario:
- escribir la cantidad total de respuestas;
- contar la cantidad de respuestas correctas, y
- verificar si la cantidad de respuestas correctas es mayor que la que figura en la tabla de
anlisis de pruebas triangulares. De ser as, puede concluirse que hay una diferencia
significativa entre las dos muestras con el nivel de seguridad elegido para la prueba.
3.4.2.5 Observaciones
- Las muestras deben servirse en todas las combinaciones posibles:
AAB BBA
ABA BAB
BAA ABB
- Si el catador es incapaz de detectar diferencias, se le requerir elegir una muestra al
azar (esta eleccin al azar se considerar en el anlisis estadstico de los resultados). La
probabilidad de elegir la respuesta correcta en la prueba triangular es 1/3.
- Este ensayo slo verifica si hay alguna diferencia entre las muestras. No evala en qu
se diferencian las muestras ni cmo o cunto difieren.
3.4.2.6 Ejemplo
Un fabricante de chocolate ha probado nuevos tipos de envases para sus productos. As,
bebidas con chocolate producidas en el mismo lote fueron envasadas en dos tipos de
envases diferentes y almacenadas en las mismas condiciones ambientales durante tres
meses. Tras este perodo trimestral de almacenamiento, se llev a cabo una prueba
triangular para verificar si haba alguna diferencia entre las bebidas de chocolate
envasadas de diferente forma.
* Resultados:
- cantidad total de jueces: 30
- cantidad de respuestas correctas: 22
Segn la tabla para pruebas triangulares (ver abajo), para un total de 30 pruebas la
cantidad mnima de respuestas correctas necesaria para que haya una diferencia
significativa entre las muestras ensayadas es: 15 para p<0,05 (5%), 17 para p<0,01 (1%)
y 19 para p<0,001 (0,1%). Como se obtuvieron 22 respuestas correctas, puede concluirse
que hubo una diferencia significativa, con un 99,9% de seguridad (o nivel de
significancia p<0,001), entre las bebidas de chocolate envasadas en diferentes envases.
Si hubiese habido 14 respuestas correctas, no se habra detectado ninguna diferencia.
Si hubiese habido 16 respuestas correctas, hubiese habido una diferencia significativa con
un 95% de seguridad (nivel de significancia p<0,05). [55]
QAM-588017-0501 49
Ficha de cata para prueba triangular
FICHA DE CATA
Nombre: _____________________________________________ Fecha: __________
Por favor, cate estas muestras codificadas de ., de derecha a

izquierda.
Dos muestras son del mismo tipo y una es diferente. Haga una circunferencia alrededor de la
muestra diferente.
328 167 894
Comentarios:
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________
QAM-588017-0501 50
Tabla para pruebas triangulares*
Nmero de jueces Cantidad de respuestas correctas segn el

nivel de significancia
10% 5% 1% 0,1%
3 3 3 - -
4 4 4 - -
5 4 4 5 -
6 5 5 6 -
7 5 5 6 7
8 5 6 7 8
9 6 6 7 8
10 6 7 8 9
11 7 7 8 10
12 7 8 9 10
13 8 8 9 11
14 8 9 10 11
15 8 9 10 12
16 9 9 11 12
17 9 10 11 13
18 10 10 12 13
19 10 11 12 14
20 10 11 13 14
21 11 12 13 15
22 11 12 14 15
23 12 12 14 16
24 12 13 15 16
25 12 13 15 17
26 13 14 15 17
27 13 14 16 18
28 14 15 16 18
29 14 15 17 19
30 14 15 17 19
31 15 16 18 20
32 15 16 18 20
33 15 17 18 21
34 16 17 19 21
35 16 17 19 22
36 17 18 20 22
42 19 20 22 25
48 21 22 25 27
54 23 25 27 30
60 26 27 30 33
66 28 29 32 35
72 30 32 34 38
78 32 34 37 40
84 35 36 39 43
90 37 38 42 45
96 39 41 44 48
* Source: Meilgaard, M.; Civille, G.V.; Carr, B.T. (1987).
QAM-588017-0501 51
3.5. Evaluacin microbiolgica de productos lcteos UAT

3.5.1. Objetivo
Evaluar la presencia de microorganismos viables en productos con tratamiento UAT
(ultra alta temperatura, UHT) utilizando la tcnica de estriado con asa en cajas de Petri.
3.5.2. Introduccin
La tcnica de estriado con asa es un mtodo microbiolgico de control de la calidad bien
conocido. Difiere del tpico recuento en placa porque no da una informacin cuantitativa
de la calidad microbiolgica del producto, sino que da una respuesta s o no, que es
lo que realmente importa en el caso de productos comercialmente estriles.

- Cajas de Petri estriles con agar.
3.5.3.2 Reactivos
un lugar fresco.
3.5.3.3 Equipos
- Autoclave
- Alcoholmetro

- Mechero de Bunsen
- Fsforos
- Algodn
- Tijeras
QAM-588017-0501 52
- Asa de platino
- Agua destilada

- Las muestras deben pre-incubarse durante 7 das a 30C.
- Limpie la superficie del envase con un algodn embebido en alcohol.
- Abra los envases con una tijera flameada en el mechero de Bunsen.
- Calcine el asa de platino hasta que se torne incandescente.
- Espere unos pocos segundos y tome una pequea porcin de la primera muestra.
- Haga una estra recta (ver figura abajo) en la placa con el medio de cultivo especfico,
abriendo la caja cerca del mechero de Bunsen, y apenas lo necesario para introducir el
asa.
- Calcine el asa de platino hasta que se torne incandescente.
- Espere unos pocos segundos y tome la segunda muestra.
- Repita el procedimiento anterior para cada muestra (se recomienda no hacer ms de
cuatro estras por placa).
Estra
Asa 10 l
- El ensayo puede realizarse por duplicado o triplicado para aumentar la precisin.

- Invierta las cajas e incube a 30C durante 72 h.

- Cuando haya finalizado el perodo de incubacin, saque las placas de la incubadora y proceda a
evaluar el crecimiento microbiolgico. Se debe considerar como positiva una muestra si la estra
correspondiente muestra algn crecimiento, sin embargo si se detectan menos de 10 ufc / estra
usualmente ello se considera una contaminacin ambiental. [33, 42, 56]
QAM-588017-0501 53
3.6. Tcnica de la estra en cuadrante para aislar

microorganismos
3.6.1. Introduccin
La tcnica de estriado en placas de Petri se usa para identificar grupos microbianos tales
como los aerobios mesfilos, aerobios termfilos, aerobios psicrtrofos, mohos,
levaduras y otros.
La tcnica de estra en cuadrante se usa para obtener colonias separadas bien aisladas.
Esto se logra mediante la dilucin secuencial del material microbiano original (cultivo en
caldo o colonias de una placa) sobre toda la superficie de una nueva placa. A medida que
la muestra original se va diluyendo por estriado sobre sucesivos cuadrantes, la cantidad
de microorganismos disminuye. Usualmente por el tercer o cuarto cuadrante el asa slo
transfiere unos pocos microorganismos y estos producen unas pocas colonias aisladas.

- Cajas de Petri estriles con agar (especfico para cada microorganismo)
3.6.2.2 Reactivos
un lugar fresco.
- Medio de cultivo: use agar infusin cerebro-corazn (BHI) para leche UAT no
contaminada y agar de recuento total (PCA) para productos contaminados.
3.6.2.3 Equipos
- Autoclave
- Alcoholmetro
QAM-588017-0501 54

- Mechero de Bunsen
- Fsforos
- Asa de platino
- Agua destilada

- Sumerja el asa de platino en etanol y calcnela hasta que se torne incandescente.
- Deje enfriar el asa y tome con la misma una pequea cantidad de material bacteriano
(de un caldo de cultivo o de una nica colonia de una placa).
- Disemine inmediatamente el inculo sobre un cuarto de la placa moviendo muy
suavemente el asa de un lado a otro (ver rea 1 de la figura de abajo).
- Flamee nuevamente el asa y djela enfriar. Vuelva al borde del rea 1, que acaba de
estriar, y extienda la estra hacia el segundo cuadrante de la placa (rea 2) .
- Flamee nuevamente el asa y djela enfriar. Vuelva al rea 2, que acaba de estriar, y
extienda la estra hacia el tercer cuadrante de la placa (rea 3).
- Flamee nuevamente el asa y djela enfriar. Vuelva al rea 3, que acaba de estriar, y
extienda la estra hacia el cuarto cuadrante de la placa (rea 4).
Inoculacin de una placa estriada:
2
3 1. rea de inoculacin inicial y primera estra
donde se produce un fuerte crecimiento.
2. rea de estras secundarias obtenidas del

rea 1; el crecimiento es menos denso.
4
1
3. rea de estras terciarias obtenidas del
rea 2; con poco crecimiento.
4. rea de estras cuaternarias obtenidas del

rea 3; crecimiento en colonias aisladas.
* Observaciones: use la mayor parte posible de la placa, no slo el centro. Estre

nicamente un inculo (el contenido de un asa de caldo de cultivo, o una colonia o una
cantidad apenas visible de clulas de una placa).
- Invierta las cajas e incube en las condiciones especficas para los distintos tipos de
microorganismos:
Leche UAT no contaminada: (30 1)C
Productos contaminados: placas por duplicado a (30 1)C
QAM-588017-0501 55
- Cuando haya finalizado el perodo de incubacin, saque las placas de la incubadora y proceda a
la identificacin de los tipos de microorganismo mediante la tincin de Gram, tincin de
esporas con verde de malaquita y microscopa de contraste de fase. [33, 42, 57]
QAM-588017-0501 56
3.7. Determinacin del ndice de homogeneizacin
I Mtodo NIZO tradicional

- Pipeta de homogeneizacin especial (NIZO)
3.7.1.2 Equipos
- Centrfuga de Gerber (1100 100 rpm), que pueda calentarse hasta 40C
* Observacin: en caso de no haber disponible una centrfuga calentada, caliente la
muestra a 45C.

- Tapn de goma

- Aspire la muestra hasta la marca superior de la pipeta NIZO.
- Tape la punta de la pipeta con un tapn de goma y colquela en la centrfuga calentada.
- Centrifugue la muestra durante 30 min.
- Una vez terminada la centrifugacin, extraiga la pipeta, tape el extremo superior con un
dedo y quite el tapn de la punta inferior.
- Deje gotear lentamente la leche de la pipeta en un vaso de precipitados. Cuando el
lquido alcance la marca inferior de la pipeta (20 ml), detenga el vaciado.
- Determine el tenor graso del producto recolectado segn el mtodo de Gerber.
- El valor obtenido debe compararse con el tenor graso de la muestra original,
determinado previamente.

Si llamamos Fc al tenor graso de la muestra original, Fs al de la muestra separada y H al
ndice de eficiencia de homogeneizacin, la relacin entre estas tres cantidades es:
H% = 100 x Fs
Fc
Valores de H = 85-95% generalmente se consideran normales para leche UAT (varan
dependiendo de si el tratamiento fue directo o indirecto). En el caso de leche pasteurizada
los ndices son menores (70-75%).
3.7.3.1 Ejemplo
Si Fs = 3,0% y Fc = 3,2%, H% valdr:
QAM-588017-0501 57
100 x 3,0 = 91%

3,2
II Mtodo alternativo
3.7.4.2 Equipos
- Refrigerador (a una temperatura de alrededor de 7C)

- Coloque 250 ml del producto en la probeta graduada poco despus de que haya sido
esterilizado.
- Almacene bajo refrigeracin (alrededor de 7C) durante 48 h.
- Separe los 25 ml de la parte superior (A) de los 225 ml de la parte inferior (B) de la
muestra.
- Determine el tenor graso de ambas fracciones usando el mtodo de Gerber (ver 2.7.5).

El ndice de homogeneizacin (H) se obtiene mediante la siguiente frmula:
H = (B x 100) / A
El ndice de homogeneizacin debe ser por lo menos 90% (el valor ideal est por encima
de 95%).
QAM-588017-0501 58
4. CONTROLES DEL CIP Y DEL PERXIDO DE

HIDRGENO EN LA PRODUCCIN ASPTICA
4.1. Evaluacin de residuos de perxido en agua
4.1.1. Enfoque analtico
- Bureta (25 ml)
- Matraz de Erlenmeyer (250 ml)
4.1.1.2 Reactivos
- Permanganato de potasio 0,01N
- cido sulfrico 2N
4.1.1.3 Procedimiento
- Tome una muestra de exactamente 100 ml de agua del envase con la pipeta
volumtrica y transfirala al matraz de Erlenmeyer.
- Agregue 1 ml de la solucin de cido sulfrico 2N.
- Titule con la solucin de permanganato de potasio 0,01N hasta que el lquido vire a
una coloracin rosada durante ms de un minuto.
- Haga un ensayo blanco usando agua de grifo.
4.1.1.4 Clculos
ppm de perxido = (Vb Va) x 1,7
donde:
Va = volumen de permanganato gastado en la titulacin del blanco.
Vb = volumen de permanganato gastado en la titulacin de la muestra.
4.1.1.5 Reaccin
2 KMnO4 + 5 H2O2 + 4 H2SO4 = 2 KHSO4 + 2 MnSO4 + 5 O2 + 8 H2O
4.1.2. Otro enfoque

La evaluacin del residuo de perxido en envases Tetra Brik Aseptic puede tambin
efectuarse mediante las tiras analticas de Merck (Tetra Pak N 90298-30 - Merckoquant
1.10011.0001) o mediante el juego de reactivos Chemetrics (Tetra Pak N 90298-31). Los
propsitos de estos juegos de reactivos son: a) permitir una determinacin rpida y
conveniente de la cantidad residual de perxido de hidrgeno en el producto y b) permitir
QAM-588017-0501 59
verificar la cantidad de perxido de hidrgeno que llega a los envases cuando se

desconecta la resistencia calefactora de las envasadoras de sistemas sin bao de
inmersin (A1, TBA/3 y TCA).
Ambos juegos pueden usarse para medir el contenido de perxido de hidrgeno en agua,
mientras que slo el 90298-30 puede usarse para medir en soluciones orgnicas (leche).
El juego 90298-30, que consiste de 100 tiras micro-analticas, da un valor aproximado. El
cambio de color de las tiras indica el contenido de perxido de hidrgeno.
El juego 90298-31, que consiste en un paquete recambiable con 30 ampollas (90298-32),
comparadores y una gradilla de ensayo, da valores precisos. Adems, este mtodo
permite tambin la deteccin de cantidades residuales menores. Las ampollas, que
contienen un reactivo, succionan automticamente el agua y se colorean diferentemente
segn el contenido de perxido de hidrgeno.
La verificacin debe hacerse inmediatamente tras la produccin de los envases con agua
destilada o deionizada. [58]
QAM-588017-0501 60
4.2. Evaluacin de la concentracin de perxido de

hidrgeno

- Densmetro con termmetro

- Tome aproximadamente 250 ml de perxido de la mquina y virtalos en la probeta
graduada.
- Coloque el densmetro en la probeta, cerciorndose de que haya suficiente lquido
como para que flote. Si quedan burbujas adheridas al densmetro, hgalo girar
suavemente hasta que desaparezcan.
- Lea la temperatura y el valor de densidad en la escala, a nivel del lquido.
* Observacin: para calcular la concentracin de perxido de hidrgeno deben
medirse tanto la densidad como la temperatura (usualmente a 20C).

La concentracin de perxido de hidrgeno se obtiene conectando con una regla los
valores de temperatura y densidad en las escalas laterales de un nomograma especfico
(use slo el nomograma original de Tetra Pak), y leyendo la concentracin en
porcentaje en peso donde la regla corta la escala central de dicho nomograma.
4.2.4. Concentraciones de perxido de hidrgeno requeridas durante la

produccin con mquinas envasadoras TBA
La concentracin de perxido de hidrgeno ptima es 35%. Concentraciones de entre
30% y 50% son aceptables para la produccin con mquinas envasadoras de bao
profundo. Se recomienda cambiar todo el perxido cada 120 h 7 das de produccin (lo
que ocurra primero).
En las envasadoras TBA/3 y A1 el perxido de hidrgeno debe cambiarse diariamente.
Deben adems agregarse 3 ml de PSM por litro de perxido antes de comenzar la
produccin. No reutilice esta mezcla en producciones subsiguientes.
4.2.5. Verificacin del consumo de perxido de hidrgeno en mquinas

envasadoras TBA/3
- Quite el recipiente de perxido de hidrgeno de la mquina y reemplcelo por una
probeta graduada (preferentemente de plstico) con una cantidad conocida (1 a 2 litros)
de perxido de hidrgeno.
- Determine el consumo de perxido de hidrgeno tras cada hora de produccin
midiendo la cantidad que queda en la probeta.
* Observacin: se recomienda preparar el perxido de hidrgeno antes de comenzar la
produccin.
QAM-588017-0501 61
4.3. Eficiencia de CIP Mtodo microbiolgico tradicional

y mtodo rpido de bioluminiscencia
I Mtodo microbiolgico tradicional

Se hisopan las superficies a analizar con una torunda estril, luego se sumerge la torunda
en una solucin acuosa de peptona al 0.1%, que se incuba durante 24 h a 37C. Tras la
incubacin se esparce la solucin sobre placas de PCA y se incuba nuevamente durante
24 h a 37C.
Valores menores que 80 ufc / 100 cm2 son generalmente considerados como aceptables.
II Otro mtodo microbiolgico

- Empape una torunda de algodn estril introducindola en un tubo de ensayo con un
medio de transporte .
Torunda de algodn estril
Tubo de ensayo con

medio de transporte
- Frote (hisope) el rea a analizar con la torunda hmeda (izquierda/derecha y retorno).

Rote la torunda durante el hisopado. Tenga en cuenta que si el rea a analizar est
hmeda, deber usar una torunda seca.
Movimiento de la torunda de
algodn visto desde arriba
- Introduzca la torunda en el mismo tubo de ensayo con el medio de transporte y

exprima el lquido absorbido.
Rotacin de la torunda
Torunda de algodn estril
Tubo con medio de transporte
- Quiebre la punta de la torunda en el tubo de ensayo con medio de transporte.
QAM-588017-0501 62
Punta separada
- Coloque (quiebre) las torundas de algodn en el tubo de ensayo de tal manera que ste
pueda taparse.
Puntas quebradas
- Agite el tubo de ensayo con la/s torunda/s en un agitador-vibrador. Las torundas deben
estar girando. Asegrese de usar los mismos procedimientos de agitacin (esto es,
tiempo y velocidad) en todos los tubos de ensayo.
- Vierta el contenido del tubo de ensayo en una caja de Petri, o dilyalo a la
concentracin apropiada con el siguiente procedimiento.
- Tome con una pipeta estril 1 ml de solucin del tubo de ensayo con la/s torunda/s
(dilucin 1) y transfiralo a otro tubo de ensayo con 9 ml de diluyente (dilucin 2);
habr hecho as una dilucin decimal, lo que facilita los clculos ulteriores.
1 ml 1 ml
Tubo con 9 ml de Tubo con 9 ml de

Tubo con punta/s diluyente y 1 ml de diluyente y 1 ml de
de torunda dilucin 1 dilucin 2
Dilucin 1 Dilucin 2 Dilucin 3

.
- Agite el tubo de ensayo en el vibrador y siembre 1 ml de la solucin en una caja de
Petri estril (se recomienda hacer dos placas por dilucin). Repita la dilucin tantas
veces como fuere necesario (la dilucin ideal es la que genera 30 - 300 ufc / placa de 9
cm de dimetro).
1 ml
1 ml
Tubo de
ensayo con
Caja de Petri
dilucin x
N2
Caja de Petri N1
- Luego vierta el agar en las cajas de Petri y mezcle cuidadosamente.
QAM-588017-0501 63
Caja de Petri
Ejemplo de patrn de mezcla:

Caja de Petri tres 8 en cada direccin
- Incube las placas a una temperatura y durante un tiempo apropiados.

- Tras incubar cuente las ufc sobre las placas (preferentemente en placas con 30-300
ufc).
III Mtodo rpido de bioluminiscencia

4.3.1. Fundamentos del mtodo
El ATP (trifosfato de adenosina) est presente en todas las clulas de organismos
vivientes y emite luz cuando se combina con la luciferasa (una enzima encontrada en
organismos con bioluminiscencia, como las lucirnagas). Esta luz puede medirse y
determinar de tal forma indirectamente la cantidad de ATP proveniente de
contaminaciones microbiolgicas, restos de alimentos, etc., la que da una indicacin del
nivel de higiene.
4.3.2. Procedimiento de anlisis

- Pase el hisopo para ensayos de bioluminiscencia por el rea a ensayar.
- Transfiera la muestra al dispositivo de reaccin.
- Introduzca el dispositivo en el equipamiento especfico y lea el resultado.
QAM-588017-0501 64
4.4. Evaluacin de la concentracin de los agentes de

limpieza
4.4.1. Concentracin de la solucin de soda custica (NaOH):
4.4.1.1 Evaluacin con HCl (cido clorhdrico)
Reactivo: HCl 1N
Indicador: fenolftalena
Titulacin:
- Pipetee en un matraz de Erlenmeyer 10 ml de la solucin de sosa custica (NaOH) que
utiliza para CIP.
- Agregue unas 3 4 gotas de fenolftalena.
- Titule con la solucin de HCl 1N utilizando una bureta.
- Registre el volumen (en ml) de HCl 1N (VHCl) utilizado para llegar al punto de viraje
del indicador.
Clculo: %NaOH = VHCl x 0,40 donde %NaOH es la concentracin de sosa

custica expresada en porcentaje en peso.
4.4.1.2 Evaluacin con H2SO4 (cido sulfrico)

Reactivo: H2SO4 1N
Indicador: fenolftalena
Titulacin:
- Pipetee en un matraz de Erlenmeyer 10 ml de la solucin de sosa custica (NaOH) que
utiliza para CIP.
- Agregue unas 3 4 gotas de fenolftalena.
- Titule con la solucin de H2SO4 1N utilizando una bureta.
- Registre el volumen (en ml) de H2SO4 1N (VH2SO4) utilizado para llegar al punto de
viraje del indicador.
Clculo: %NaOH = VH2SO4 x 0,40 donde %NaOH es la concentracin de sosa custica
expresada en porcentaje en peso.
4.4.2. Concentracin de la solucin de cido ntrico (HNO3):
Reactivo: NaOH 1N
Indicador: rojo de metilo
Titulacin:
- Pipetee en un matraz de Erlenmeyer 10 ml de la solucin de cido ntrico (HNO3) que
utiliza para CIP.
- Agregue unas 3 4 gotas de rojo de metilo.
QAM-588017-0501 65
- Titule con la solucin de NaOH 1N utilizando una bureta.

- Registre el volumen (en ml) de NaOH 1N (VNaOH) utilizado para llegar al punto de
viraje del indicador.
Clculo: %HNO3 = VNaOH x 0,63 donde % HNO3 es la concentracin de cido
ntrico expresada en porcentaje en peso.
4.4.3. Preparacin del indicador

4.4.3.1 Fenolftalena
Se disuelve 1 g de fenolftalena [C6H4COO.C(C6H4OH)2] en 60 ml de etanol absoluto.
Esta solucin se diluye a 100 ml con agua destilada.
pH Color
8,3 Incoloro
9,8 Rojo
4.4.3.2 Rojo de metilo

Se disuelve 0,2 g de rojo de metilo [HOOC.C6 H4H:N.C6H4N(CH3)2] en 60 ml de etanol
absoluto. Esta solucin se diluye a 100 ml con agua destilada.
pH Color
4,2 Rojo
6,3 Amarillo
QAM-588017-0501 66
5. HIGIENE PERSONAL Y AMBIENTAL

5.1. Carga microbiana del aire - Mtodo de sedimentacin
En este mtodo pueden usarse placas 3M Petrifilm o cajas de Petri de 9 cm de dimetro.
5.1.1. Materiales usados para el ensayo con Petrifilm

- Pipeta estril (1 ml)
- Matraz para esterilizar el agua destilada
* Observaciones: Todo el material de vidrio estril debe esterilizarse en una estufa a una
5.1.1.2 Reactivos
- Agua destilada estril
5.1.1.3 Equipos

- 3M Petrifilm
- Discos plsticos, especficos para anlisis con 3M Petrifilm
5.1.2. Metodologa de anlisis utilizando Petrifilm

- Vierta aspticamente con una pipeta 1 ml de agua destilada estril sobre la pelcula.
- Cierre y presione la placa Petrifilm con el disco plstico especfico para tal fin.
- Espere que solidifique el medio (unos 20 - 30 min).
- Abra las placas Petrifilm, fjelas con cinta adhesiva en los puntos predeterminados
para el control y djelas abiertas durante 15 min.
- Cierre e incube las placas Petrifilm (horizontalmente, con la superficie transparente
hacia arriba) en una incubadora a (35 1)C durante (48 2) h. Se requiere una
manipulacin mnima al colectar las muestras para evitar cualquier recontaminacin
que pueda interferir con el resultado final.
* Observacin: Incube un Petrifilm sin exponer como control.
5.1.3. Evaluacin e interpretacin de los resultados obtenidos con

Petrifilm
- Pasado el perodo de incubacin, saque los Petrifilm de la incubadora.
- Cuente las colonias.
2
- Multiplique el resultado por 2,5 (para obtener la cantidad de colonias en 100 cm ).
QAM-588017-0501 67
2
- La cantidad mxima aceptable es 40 ufc / 100cm .
5.1.4. Materiales usados para el ensayo con cajas de Petri

- Cajas de Petri estriles de 9 cm de dimetro, con medio de cultivo PCA estril y
solidificado.
5.1.4.2 Reactivos
5.1.4.3 Equipos
5.1.5. Metodologa de anlisis utilizando cajas de Petri

- Abra las cajas de Petri en los puntos predeterminados para el control y djelas abiertas
durante 15 min.
- Cierre e incube las cajas (en posicin invertida) una incubadora a (35 1)C durante
(48 2) h.
* Observacin: Incube una placa sin exponer como control.
5.1.6. Evaluacin e interpretacin de los resultados de las cajas de Petri

- Pasado el perodo de incubacin, saque las cajas de Petri de la incubadora.
- Cuente las colonias.
2
- Multiplique el resultado por 1,57 (para obtener la cantidad de colonias en 100 cm ).
2
- La cantidad mxima aceptable es 40 ufc / 100cm .
QAM-588017-0501 68
5.2. Carga microbiana del aire Dispositivo toma muestra

porttil
Por favor tenga en cuenta que:
El mtodo est descrito para un toma muestra SAS. En tomadores de muestras de aire de
otros proveedores, por ejemplo Millipore, puede ser pertinente otra metodologa de
anlisis, aun cuando el principio del mtodo sea el mismo.

- Quite el cabezal de la mquina y la tapa de proteccin.
- Coloque una placa RODAC de 55 mm de dimetro con PCA.
- Enrosque el cabezal, ajstelo manualmente y comience a tomar muestra. La cantidad
de aire que se tome como muestra depende del nivel de contaminacin ambiental que
se sospeche; cuanto mayor sea este ltimo, menor ser el volumen (tiempo) a tomar.
- Tras tomar la muestra, incube las placas a (35 1)C durante (48 2) h.

Para evaluar los resultados se usa la tabla estadstica anexa y la siguiente frmula. La
tabla es necesaria porque si hay muchos microorganismos en el aire, hay una cierta
probabilidad de que pase ms de uno por orificio y se superpongan en la misma colonia.
y = Pr / V
donde:
V = Volumen de la muestra de aire (en litros)
r = unidades formadoras de colonias (en placa RODAC de 55 mm de dimetro)
Pr = Nmero efectivo de colonias (probabilidad) obtenido de la tabla anexa con el valor
de r
y = unidades formadoras de colonias por litro de aire
* Observacin: El resultado final puede expresarse en ufc/ft3 o en ufc/m3, multiplicando
el valor de y (ufc/l) por 28,32 1000, respectivamente.
QAM-588017-0501 69
Tabla de correlacin para recuento de colonias usando placas RODAC de

55 mm de dimetro
r Pr r Pr r Pr r Pr r Pr r Pr r Pr
1 1 32 34 62 73 92 119 122 178 158 278 194 471
2 2 33 36 63 74 93 121 123 180 159 282 195 480
3 3 34 37 64 76 94 122 124 182 160 286 196 489
4 4 35 38 65 77 95 124 125 185 161 289 197 499
5 5 36 39 66 78 96 126 126 187 162 293 198 508
6 6 37 40 67 80 97 128 127 189 163 297 199 519
7 7 38 42 68 81 98 130 128 192 164 301 200 530
8 8 39 43 69 83 99 131 129 194 165 305 201 542
9 9 40 44 70 84 100 133 130 196 166 309 202 554
10 10 41 45 71 86 101 135 131 199 167 313 203 567
11 11 42 46 72 87 102 137 132 201 168 317 204 580
12 12 43 48 73 88 103 139 133 204 169 322 205 595
13 13 44 49 74 90 104 141 134 206 170 326 206 611
14 14 45 50 75 92 105 142 135 209 171 331 207 627
15 15 46 51 76 93 106 144 136 212 172 335 208 646
16 17 47 53 77 95 107 146 137 214 173 340 209 666
17 18 48 54 78 96 108 148 138 217 174 344 210 687
18 19 49 55 79 98 109 150 139 220 175 349 211 712
19 20 50 57 80 99 110 152 140 222 176 354 212 739
20 21 51 58 81 101 111 154 141 225 177 359 213 770
21 22 52 59 82 102 112 156 142 228 178 365 214 807
22 23 53 60 83 104 113 158 143 231 179 370 215 851
23 24 54 62 84 106 114 160 144 234 180 375 216 905
24 25 55 63 85 107 115 162 145 237 181 381 217 978
25 26 56 64 86 109 116 165 146 240 182 387 218 1088
26 28 57 66 87 110 117 167 147 243 183 393 219 1307
27 29 58 67 88 112 118 169 148 246 184 399
28 30 59 69 89 114 119 171 149 249 185 405
29 31 60 70 90 116 120 173 150 252 186 412
30 32 61 71 91 117 121 175 151 255 187 418
152 258 188 425
* r = unidades formadoras de colonias contadas 153 261 189 432
*Pr = probabilidad 154 265 190 439
155 268 191 447
156 271 192 455
157 275 193 463
QAM-588017-0501 70
5.3. Evaluacin de la higiene de las manos

5.3.1. Evaluacin microbiolgica de las manos del operador
Se debe analizar regularmente el crecimiento bacteriano en las manos del operador,
ponindolas en contacto con una placa de agar PCA que se incubar seguidamente a 37C
durante 24 h.
5.3.2. Evaluacin microbiolgica de las manos antes y despus de

lavarlas y desinfectarlas
5.3.2.1 Metodologa de anlisis
- Tome muestras de higiene de manos haciendo que el dedo ndice del operador toque el
agar de una caja de Petri con PCA, en tres diferentes situaciones:
sin lavarse las manos;
tras lavrselas con detergente y secarlas con papel blanco, y
tras desinfectarlas con una solucin de alcohol yodado (etanol al 70% con
0,25% de yodo).
5.3.2.2 Evaluacin e interpretacin del resultado

- Verifique la disminucin de crecimiento bacteriano en las placas de PCA obtenidas
despus de lavarse y desinfectarse las manos.
QAM-588017-0501 71
6. REFERENCIAS Y LECTURA ADICIONAL
1. Milk and Liquid milk products-Density hydrometers for use in products with a
surface tension of approximately 45mN/m, ISO 2449 International Standard, 1974.
2. Milk and dried milk, buttermilk and buttermilk powder, whey and whey powder-
Determination of phosphatase activity (Reference method), ISO 3359 International
Standard, 1975.
3. Milk-Determination of fat content (Routine method), ISO 2446 International Standard,
1976.
4. Dried milk-Determination of titrable acidity (Reference method), ISO 6091
International Standard, 1980.
5. Dried milk-Determination of titrable acidity (Routine method), ISO 6092 International
Standard, 1980.
6. Milk- Determination of fat content-Gerber butyrometers, ISO 488 International
Standard, 1983.
7. Milk- Determination of protein content-Amino black dye-binding method (routine
method), ISO 5542 international Standard, 1984.
8. Dried milk-Assessment of heat class-Heat number reference method, ISO 6735
9. Dried milk-Determination of nitrate content-Method by cadmium reduction and
spectrometry ( screening method),ISO 8151 International Standard, 1987
10. Milk and milk products-Sampling-Inspection by variables, ISO 8197 International
Standard, 1988.
11. Sweetened condensed milk-Determination of total solids content (Reference method),
ISO 6734 International Standard, 1989.
12. Milk and milk products Guidance on sampling, ISO 707 International Standard, 1997.
13. Milk and milk powder-Determination of aflatoxin M1 content-Clean-up by
immunoafinity chromatography and determination by high-performance liquid
chromatography , ISO 14501 International Standard, 1998
14. Milk-Determination of fat content-Gravimetric method (Reference method), ISO
1211 International Standard, 1999.
15. Milk and dried milk-Determination of iodide content-Method using high
performance liquid chromatography, ISO 14378 International Standard, 2000.
16. Milk-Definition and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk
analysis, ISO 8196-1 International Standard, 2000.
analysis- Part 1: analytical attributes of indirect methods, ISO 8196-1 International
Standard, 2000
analysis- Part 2: Calibration and quality control in the dairy Laboratory, ISO 8196-2
19. Milk and milk products-Determination of residues of organochlorine compounds
(pesticides) Part 1: General considerations and extraction methods, ISO 3890-1
20. Milk and milk products Determination of residues of organochlorine compounds
(pesticides) Part 2: Test methods for crude extract purification and confirmation,
ISO 3890-2 International Standard, 2000.
21. Milk and milk products Detection of Salmonella spp. ISO 6785 International
Standard, IDF: 93(International Dairy Federation), 2001.
QAM-588017-0501 72
22. Milk and milk products-General guidance for the preparation of test samples, initial
suspensions and decimal dilutions for microbiological examination, ISO 8261
International Standard, IDF: 122 ( International Dairy Federation) , 2001.
23. Milk- Determination of nitrogen content- Part 1: Kjeldahl method, ISO 8968-1
International Standard, IDF: 20-1 (International Dairy Federation), 2001.
24. Milk-Determination of nitrogen content- Part 2: Block-digestion method (Macro
method), ISO 8968-2 International Standard, IDF: 20-2 (International Dairy Federation),
2001.
25. Milk-Determination of nitrogen content- Part 4: Determination of non-protein-
nitrogen content, ISO 8968-4 International Standard, IDF: 20-4 (International Dairy
Federation), 2001.
26. Milk-Determination of nitrogen content Part 5: Determination of protein nitrogen
content, ISO 8968-5 International Standard, IDF: 20-5 (International Dairy Federation),
2001.
27. Milk and milk products- Determination of nitrogen content-Routine method using
combustion according to the Dumas principle , ISO 14891 International Standard, IDF:
185 (International Dairy Federation), 2002.
28. Milk-Determination of freezing point-Thermistor cryoscope method (Reference
method), ISO 5764 International Standard, IDF: 108 (International Dairy Federation),
2002.
29. Milk and milk products-Determination of alkaline phosphatase activity- Part2:
Fluorometric method for cheese, ISO 11816-2 International Standard, IDF: 155-2
(International Dairy federation), 2003.
30. Milk fat products- Determination of water content-Karl Fischer method, ISO 5536
International Standard, IDF: 23 (International Dairy Federation), 2002.
31. Milk and milk products- Determination of alkaline phosphatase activity- Part 2:
Fluorometric method for cheese, ISO 11816-2 International Standard, IDF: 155-2
(International Dairy Federation), 2003.
32. Milk-Estimation of psychrotrophic microorganisms Colony count technique at
21C (rapid method), ISO 8552 International Standard, IDF: 132 (International Dairy
Federation), 2004.
33. Milk-Enumeration of microorganisms-Plate Loop technique at 30C, ISO 8553
International Standard, IDF: 131(International Dairy Federation), 2004.
34. Milk- Determination of lactulose content-Enzymatic method, ISO 11285 International
Standard, IDF: 175 (International Dairy Federation), 2004.
35. Milk-Determination of nitrogen content Part 3: Block-digestion method (Semi-
micro rapid routine method), ISO 8968-3 International Standard, IDF: 20-3
36. Milk Determination of urea content-Enzymatic method using difference in pH
(Reference method), ISO 14637 International Standard, IDF: 195 (International Dairy
Federation), 2004.
37. Milk and milk products-Enumeration of colony forming units of yeasts and/or
moulds-Colony-count technique at 25C,ISO 6611 International Standard ,IDF: 94 (
International Dairy Federation) , 2004.
38. Sweetened condensed milk- Determination of sucrose content-Polarimetric method,
ISO 2911 International Standard, IDF: 35 (International Dairy Federation), 2004.
39. Milk and milk products-Sampling-Inspection by attributes, ISO 5538 International
40. Dairy plant-Hygiene conditions-General guidance on inspection and sampling
procedures, ISO 8086 International Standard, IDF: 121 (International Dairy Federation),
2004.
QAM-588017-0501 73
41. Milk and milk products-Quality control in microbiological laboratories- Part 2:

Determination of the reliability and subsequent dilution steps, ISO 14461-2
International Standard, IDF: 169-2 (International Dairy Federation), 2005.
42. Milk and milk products Quality control in microbiological laboratories- Part 1:
Analyst performance assessment of colony counts, ISO 14461-1 International Standard,
IDF: 169-1 (International Dairy Federation), 2005.
43. Milk and milk powder Determination of aflatoxin M1 content Clan-up by
immunoaffinity chromatography and determination by thin-layer chromatography,
ISO 14674 International Standard, IDF: 190 ( International dairy Federation) , 2005.
44. Milk Enumeration of colony forming units of psychrotrophic microorganisms-
Colony Count technique at 6.5C, ISO 6730 International Standard, IDF: 101
45. Dried milk-Determination of content of lactic acid and lactates, ISO 8069 International
46. Milk fat-Determination of peroxide value, ISO 3976 International Standard, IDF: 74
(International Dairy federation), 2006.
47. Milk and milk products determination of Enterobacter sakazakii, ISO/TS 22964
International Standard/ Technical Specification, IDF/RM: 210(International Dairy
Federation), 2006.
48. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection
and enumeration of coliformes-most probable number technique, ISO 4831
49. Heat-treated milk-Determination of lactulose content Method using high-
performance liquid chromatography, ISO 11868 International Standard, IDF: 147
50. DAIRY PROCESSING HANDBOOK; Tetra Pak Processing Systems AB. Second
revised edition, 2003
51. In-flow Heat-treated Products, Processing, Packaging and Storage A Guide to
Quality. Dr. Bernhard von Bockelmann and Dr. Irene von Bockelmann. Tetra Pak
Technical Service AB, 2005
52. Handbook on Milk collection in Warm Developing Countries, IDF Doc. No. 9002,
International Dairy Federation, Brussels, Belgium
53. Procedure & Guidelines: A practical approach to the detection and enumeration of
spore forming bacteria, FSQ-588016-0101, Tetra Pak Technical Service AB, Lund
54. IDF, Milk and milk products. Enumeration of microorganisms - colony count at 30 C
IDF Standard 100A, International Dairy Federation, Brussels, Belgium (1987).
55. Sensory analysis - Methodology - Triangle test, ISO 4120:2004
56. Procedure & Guidelines: Guideline for Microbiological Evaluation of Commercially
Sterile Products; FSQ-588002-0104, Tetra Pak Technical Service AB, Lund
57. Streaking Microbial Cultures on Agar Plates, Science in the Real World: Microbes in
Action; Teresa Thiel University of Missouri-St. Louis 1999
58. Determination of contents of hydrogen peroxide, Tetra Pak Corporate Standard
M1797.32, August 1990
59. Procedure & Guideline: Guideline for Microbiological End Product Evaluation of
Chilled Dairy Products; FSQ-588003-0104 Tetra Pak Technical Service AB, Lund
QAM-588017-0501 74

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Procedimientos y pautas

Rutinas de control de calidad en la

2. CONTROL DE CALIDAD DE LAS MATERIAS PRIMAS.................. 10

I Anlisis fisicoqumicos ......................................................................... 10

II Alteracin y adulteracin de la leche cruda....................................... 27

III Anlisis microbiolgicos..................................................................... 34

3. CONTROLES DEL PROCESO DE TRATAMIENTO TRMICO Y DE

4. CONTROLES DEL CIP Y DEL PERXIDO DE HIDRGENO EN LA

5. HIGIENE PERSONAL Y AMBIENTAL.............................................. 67

6. REFERENCIAS Y LECTURA ADICIONAL....................................... 72

2. CONTROL DE CALIDAD DE LAS MATERIAS PRIMAS

pH es el logaritmo de la inversa de la concentracin de iones hidrgeno, expresada en

La escala de pH se usa comnmente entre los valores de 1-14 y por lo general en

2.1.3. Fundamento del mtodo

2.1.4. Materiales usados para el ensayo

2.1.4.1. Material de vidrio

2.1.4.4. Otros materiales

2.1.5. Metodologa de anlisis

2.2. Determinacin de la acidez de la leche

2.2.3.1 La acidez natural de la leche

2.2.3.2 Acidez adquirida

C12H22O11 + H2O 4 C3H6O3

2.2.3.3 Acidez potencial

2.2.3.4 Explicacin de la conversin

CH3CH(OH)COOH + NaOH CH3CH(OH)COONa + H2O

Digamos que la titulacin de 10 ml de leche consume 1,9 ml de una solucin 0.1N de

2.2.3.5 Acidez real

2.2.3.6 Factores que influyen en el aumento de la acidez

2.2.4 Materiales usados para el ensayo

2.2.4.1 Material de vidrio

2.2.5 Recomendaciones del mtodo

2.2.6 Metodologa de anlisis

2.3. Prueba de alcohol

2.3.2. Materiales usados para el ensayo

2.3.2.1. Material de vidrio

2.3.3. Metodologa de anlisis

2.3.4 Evaluacin e interpretacin del resultado

2.4. Prueba de alizarol

2.4.3. Materiales usados para el ensayo

2.4.3.1. Material de vidrio

2.4.4. Metodologa de anlisis

2.4.5. Evaluacin e interpretacin del resultado

Criterios para la evaluacin de la prueba de alizarol:

Leche pH %a.l. Floculacin Color

Leche fresca 6,66 - 6,75 0,14 0,16 Ninguna Prpura claro

Ligeramente 6,30 6,50 0,17 Posibles pequeas Castao

cida 6,00 6,20 0,18 0,19 Pequeas escamas Amarillo

Muy cida <6,00 0,20+ Grandes escamas Amarillo

Mastitis 6,80 + NA Pequeas escamas Violeta

lcali 6,80 + NA Ninguna Violeta

2.5. Determinacin del punto de congelacin

2.5.3. Materiales usados para el ensayo

2.5.3.1 Material de vidrio

2.5.3.4 Otros materiales

2.5.4. Metodologa de anlisis

2.6. Determinacin de la densidad

2.6.3. Materiales usados para el ensayo

2.6.4. Metodologa de anlisis

2.7. Determinacin del contenido de grasa en la leche

2.7.3. Mtodo gravimtrico

2.7.4. Mtodo volumtrico

Gerber. El contenido de grasa se lee directamente en el butirmetro, sea en porcentaje en

2.7.5. Determinacin del tenor graso utilizando el mtodo de Gerber

2.7.5.1 Materiales usados para el ensayo