Sistema de Complemento

El sistema de complemento est formado por un conjunto de protenas

sricas que se activan en cascada y por protenas reguladoras .la activacin
puede iniciarse a travs de complejos antgeno- anticuerpo en la via clsica y
por accin de componentes bacterianos y diversas enzimas en la via alterna
.Ambas vas convergen a nivel de c3 originando el mismo producto final. El
reconocimiento de los microorganismos por el complemento tiene lugar de
tres formas

1. Va clsica
2. Via alternativa
3. Via de la leptina

A travs de estas distintas vas puede activarse el sistema de

complemento las cuales desencadenan la sntesis de C3b la cual
inicia los pasos finales en la activacin de complemento que culminan
en la produccin de pptidos que estimulan la inflamacin de C5a y
C9 polimerizado que forma el complejo de ataque a la membrana.

La mayora de los componentes del complemento se sintetizan en el

hgado (excepto C1q , D y P) el C1q lo sintetizan clulas epiteliales y
el factor D el adipocito.

Existen varios receptores especficos para distintos componentes

activados del complemento, y que se localizan en distintas
poblaciones de leucocitos.

Las primeras teoras acerca de la existencia del sistema de

complemento (C) aparecieron en el siglo XIX, mientras se estudiaban
los efectos de los anticuerpos contra los microorganismos y globulos
rojos. Las descripciones iniciales de Grohmann, Nutal, Buchner ,
Pfeiffer e Isayen en relacin con el fenmeno de lisis sealaban que,
adems de los cuerpos inmunoespecificos estables al calor (hoy
 conocido como anticuerpos), se requeria la presencia de suero
normal- no calentado- para la efectiva lisis de los microorganismos.

El sistema del complemento consta de protenas sricas y de

superficies celular que interactan entre ellas y con otras molculas
del sistema inmunitario de una forma sumamente regulada. Las
protenas del complemento son protenas plasmticas que
normalmente estn inactivas ; solo se activan en determinadas
circunstancias para generar productos que intervienen en varias
funciones efectoras del complemento. Varias caractersticas de la
activacin del complemento son esenciales para su funcin normal .
La activacin del complemento supone la protelisis secuencial de
protenas para generar enzimas con actividades proteolticas , las
protenas que adquieren actividad enzimtica proteoltica mediante la
accin de otras proteasas llamadas zimgenos.
Componentes con denominaciones a base de nmeros tras la letra
C

Motivos cronolgicos
Sin relacin con el orden en que actan

Muchas de estas protenas son proenzimas ( zimgenos), por lo que se

requieren de su rotura proteoltica para su activacin , quedando por su
ruptura 2 sub-unidades.

Fragmento mayor b
Fragmento menor a

Ejemplo C3 C3b(mayor)
C3a (menor)
Excepcin : C2 C2a (mayor)
C2b
Vas de la activacin del complemento

Hay tres vas principales de la activacin del complemento la via clsica , que
se activa por ciertos isotipos unidos a antgenos ; la via alterna , que se
activa sobre las superficies de las clulas microbianas en ausencia de
anticuerpos, y la via de la lectina, que se activa por una leptina plasmtica
que se une a residuos de manosas sobre los microorganismos .

1- La ruta clsica : conecta con el sistema inmune adaptativo por medio

de su interaccion con inmunocomplejos

2- La ruta alternativa: conecta con el sistema de inmunidad natural o

inespecfica, interaccionando directamente con la superficie del
microorganismo.

3- La ruta de las lectinas : es una especie de variante de la ruta clsica ,

pero que se inicia sin necesidad de anticuerpos, y por lo tanto
pertenece al sistema de inmunidad.

Las tres rutas comparten las ltimas fases, consistentes en el

ensamblaje, sobre las superficies del microorganismo, del denominado
complejo de ataque a la membrana.

Las consecuencias de la activacin y fijacin del complemento

incluyen:
Lisis del microorganismo o clula diana.
Opsonizacin, con la consiguiente mejora de la fagocitosis y
destruccin.
Los productos difusibles del complemento activado provocan un
incremento de la quimiotaxis sobre los fagocitos y funcionan
con anafilotoxinas en el control de la respuesta inflamatoria .
Amplificacin de la respuesta humoral especifica
Eliminacion de los inmunocomplejos
FIJACIN DEL COMPLEMENTO

TCNICA KENT Y FIFE (CH50) - ENSAYO CH50

FUNDAMENTO DE CH50: la reaccin se inicia con la interaccin antgeno

(glbulos rojos de carnero) con el anticuerpo (hemolisina) al agregar el suero
del paciente cuyos niveles de complemento se desean investigar, se inicia la
activacin de la cascada de protenas desde C1-C9 con lo cual se obtiene la
destruccin de los glbulos rojos. El grado de hemolisis se calcula mediante
lectura espectrofotomtrica. Los resultados se expresan en unidades
hemolticas las cuales representan la cantidad de complemento requerido
para lograr la hemolisis del 50% de los glbulos rojos de una suspensin
estandarizada.

CH50: hemolisis, permite determinar la funcin completa del sistema del

complemento.

PROTENAS QUE ACTIVAN LAS VAS:

VAS CLSICA Activada: ag-ac Inicia: C1q Forma: C4bC2a (C3 convertasa)
C4bC2a C3b (C5 convertasa)

VA ALTERNA Activada: presencia de microroganismos Inicia: C3,

properdina B, properdina D Forma C3bBb (C3 convertasa) y C3bBC3b (C5
convertasa)

VA DE LECTINAS Activadas: polisacridos o manosa Inicia: MBL Forma

C4b2a3b Hidroliza: MASP-1, MASP-2, MBL.
Ensayo CH50 Va alterna

Fundamento: Los glbulos rojos de conejo tienen las propiedad de activar las
vas alternas del sistema de complemento del suero humano, tratado
previamente con solucin buffer de EDTA y concentraciones apropiadas de
Mg produciendo hemolisis.

Mtodos usados para determinar el sistema de complemento

1. Inmunodifusin radial

2. Nefelometra

3. Turbidimetra

4. ELISA

IDR: Esta tcnica se basa en la difusin libre de la muestra en un gel que

contiene anticuerpos contra la Ig que se desea cuantificar. La formacin de
los complejos entre antgenos y anticuerpos da lugar a la formacin de un
anillo o crculo de precipitacin alrededor del punto de aplicacin, cuya rea
es proporcional a la concentracin de antgeno en la muestra

PRINCIPIO

Un anticuerpo es incorporado en agarosa fundida, la cual es vertida dentro

de una caja de Petri la cual se deja solidificar. Se cortan pequeos pozos
dentro de la agarosa y estos son llenados con concentraciones conocidas de
antgeno correspondientes al anticuerpo, con el objeto de construir una curva
de calibracin. Las muestras desconocidas se colocan dentro de los pozos.
Los antgenos en solucin difundirn hacia fuera del pozo en un patrn
circular rodeando al pozo. El anticuerpo est presente en exceso y la difusin
del antgeno continuar hasta que se forme un precipitado antgeno-
anticuerpo en forma de anillo estable. Habr complejo Ag-Ac en toda la zona
circundante al pozo dentro de la lnea de precipitina. En esta lnea es donde
est presente el mayor nmero de complejos, ya que en ese punto el
antgeno y el anticuerpo estn en proporciones iguales. Esta es conocida
como la zona de equivalencia.
2. Nefelometra.

Inmunonefelometra Esta tcnica se basa en la medicin de la dispersin de

la luz causada por la formacin de complejos insolubles antgeno-anticuerpo,
al agregar un suero anti-Ig (IgG, IgA o IgM, segn el caso) a la muestra de
suero a determinar (Fig.5.2). Sus principales ventajas son: (a) provee
resultados en minutos; (b) puede automatizarse, para el manejo de un alto
nmero de muestras; y (c) debido a que no se basa en un principio de
difusin, la presencia de polmeros de Igs de tamaos diversos no conduce a
errores importantes. Su principal desventaja radica en la interferencia que
puede causar la turbidez propia de la muestra, ya sea por la presencia de
complejos inmunes pre-existentes o de otros agregados moleculares
insolubles de origen no-inmunolgico. Este aspecto se controla en la tcnica
mediante la utilizacin de un "blanco" de muestra.

3. Turbidimetra

La turbidimetra mide la disminucin de la luz transmitida a travs de una

suspensin de partculas utilizando para ello un espectrofotmetro (detector
en la misma direccin del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para
soluciones concentradas (para que haya una buena disminucin de la luz
transmitida) ej. determinacin de protenas totales en suero, LCR u orina
(haciendo que las protenas precipiten con TCA o cido sulfosaliclico).
 Poblacin linfocitaria

La determinacin de linfocitos T y B es esencial para confirmar y

monitorear inmunodeficiencias primarias. Es til en el diagnstico de las
inmunodeficiencias secundarias y para clasificar trastornos
linfoproliferativos.
Para esto se han descrito varias tcnicas que permiten cuantificar estas
clulas.
Tcnica de separacin en gradientes:
Las primeras tcnicas empleadas para aislar los linfocitos sanguneos
consistan en mezclar la muestra con un agente aglutinante de eritrocitos,
con el fin de que estos se separaran debido a la sedimentacin de los
grumos. Sin embargo, estas tcnicas son lentas, dan un bajo rendimiento
final y una baja pureza. Posteriormente se desarrollaron las tcnicas de
centrifugacin en gradientes. Byum (1958) ide un mtodo basado en la
centrifugacin de la muestra sobre un gradiente de densidad discontinuo,
cuyo medio original consista en una mezcla de ficoll y metrizoato de
sodio, con densidad de 1,077 g/ml. Este mtodo es rpido y simple, por lo
que se utiliza muy comnmente para obtener preparaciones enriquecidas
de linfocitos sanguneos. Aunque estrictamente esta tcnica resulta en la
separacin de los leucocitos mononucleares, que incluyen tanto a los
linfocitos como a los monocitos, los primeros superan ampliamente en
nmero a los segundos, cuando se trabaja con muestras de sangre
perifrica.
Medio de separacin:
El medio de separacin para purificar linfocitos sanguneos consiste en
una mezcla de dos componentes. El ficoll 400 es un polmero sinttico de
sacarosa y epiclorhidrina, de 400.000 daltons, soluble en agua. Por otra
parte, el diatrizoato de sodio (que ha sustituido al metrizoato de la frmula
original de Byum) es un compuesto que, al ser mezclado con el ficoll,
forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad. La funcin del
diatrizoato es proveer la densidad ptima para la separacin y a la vez la
osmolaridad adecuada para mantener la viabilidad de las clulas. Adems,
el ficoll causa la aglutinacin de los eritrocitos, lo cual facilita an ms su
sedimentacin. Es recomendable que el medio de separacin se
mantenga en envases protegidos de la luz, debido a la fotosensibilidad del
diatrizoato.

Fundamento de la separacin

Al estratificar una muestra de sangre sobre el ficoll-diatrizoato y

centrifugar, las clulas mononucleares se separan de las dems debido a
diferencias de densidad. Como se mencion, el ficoll aglutina los
eritrocitos, por lo que estos pasan a travs del medio y sedimentan al
fondo. Los granulocitos tambin sedimentan por su tamao y densidad, y
por su tendencia a formar agregados. Los mononucleares (linfocitos y
monocitos), por su menor densidad, se quedan en la interfase entre el
plasma y el medio (Figs.1.1 y 1.2), con una contaminacin relativamente
baja de plaquetas y otros tipos celulares. Al final de la centrifugacin, los
leucocitos mononucleares se recogen del anillo blanco que se forma en la
interfase entre el plasma y el ficoll-diatrizoato.
Factores que afectan el procedimiento:

La cantidad de sangre a procesar debe guardar proporcin con el

volumen y la altura del medio de separacin. Al aumentar la altura del
estrato de sangre con respecto a la altura del medio, se aumenta la
contaminacin con eritrocitos en la interfase. Por esto, el dimetro del tubo
es un factor importante para establecer el volumen de sangre ptimo para
fraccionar. Para aumentar el tamao de la muestra, es preferible aumentar
el dimetro del tubo, tratando de no variar la altura de las capas de medio
y de sangre. El rendimiento y la pureza de los linfocitos dependen en gran
parte de la eficiencia en la remocin de los eritrocitos. Cuando estos son
aglutinados por el ficoll, algunos linfocitos son atrapados dentro de los
grumos, y por lo tanto se pierden. Este fenmeno se reduce diluyendo la
sangre 1:2 antes de fraccionarla, usando una solucin salina balanceada,
con el fin de mejorar el rendimiento final de los linfocitos. La aglutinacin
de los glbulos rojos se favorece conforme aumenta la temperatura, con lo
cual se acelera la separacin, pero se disminuye el rendimiento (ej. a
37C). En bajas temperaturas (4C) se disminuye la velocidad de
agregacin, por lo que hay que prolongar el tiempo de separacin. Una
temperatura de alrededor de 18C da resultados ptimos en cuanto al
balance entre tiempo y rendimiento.

Mtodo de rosetas: identificacin de clulas T

Las diferentes poblaciones y subpoblaciones de linfocitos no son

distinguibles morfolgicamente. Para identificarlas, se requieren mtodos
de laboratorio que detectan, por lo general, protenas de membrana que
utilizamos como "marcadores" de dichas poblaciones. Alrededor de 1970
se encontr que los linfocitos T humanos poseen la propiedad de unirse
espontneamente a los eritrocitos de carnero in vitro, formando
agrupaciones llamadas rosetas E. Esta propiedad ha sido til para
desarrollar una tcnica sencilla y de bajo costo para la cuantificacin de
los linfocitos T.
Es importante tener en cuenta que este, y otros mtodos de cuantificacin
de clulas, solo proveen informacin acerca del nmero de un
determinado tipo celular (en este caso linfocitos T), pero no dan
informacin sobre su funcionalidad. Es posible tener cifras normales de
linfocitos T, pero que funcionalmente sean deficientes. Su funcionalidad se
puede evaluar a travs de distintos mtodos

Indicaciones clnicas para la cuantificacin de linfocitos T: La

enumeracin de las poblaciones linfocitarias (T y B), en conjunto con las
pruebas que evalan su funcionalidad, contribuyen a precisar la naturaleza
de la inmunodeficiencia, ya sean innatas o adquiridas, y a predecir las
complicaciones ms probables que enfrentar el paciente.
Fundamento: El receptor de las clulas epitelioides tmicas LFA-3
(antgeno funcional linfocitario 3), se une al CD2 de los linfocitos T que
llegan de la mdula sea para iniciar la maduracin y estancia de los
linfocitos T en el timo. Los eritrocitos de carnero tienen una molcula muy
similar al LFA-3, cuando se ponen en contacto linfocitos T y eritrocitos de
carnero, se unen formando las rosetas E, ni los linfocitos B, ni las clulas
NK forman Rosetas, porque no tienen CD2, lo que permite separarlos y
contarlos.
Formacin de rosetas E: El mtodo de las rosetas E no requiere trabajar
en condiciones de esterilidad. Bsicamente consiste en purificar linfocitos
de sangre perifrica (mediante la tcnica del ficoll-diatrizoato), ajustar su
concentracin, y mezclarlos con eritrocitos de carnero. Despus de un
perodo de incubacin, se coloca cuidadosamente la mezcla de clulas en
una cmara de Neubauer, para observar la proporcin (%) de linfocitos
que formaron rosetas o no. El uso de la cmara en esta etapa es esencial,
ya que si la lectura final se realiza en un portaobjetos con cubreobjetos
convencional, la presin que ejerce este ltimo, al colocarlo, disgrega un
cierto nmero de rosetas. En cambio, el espacio (0,1 mm) existente entre
el cubreobjetos y la superficie de la cmara de Neubauer evita este
problema. El anticoagulante recomendado para obtener la muestra de
sangre es la heparina sdica (10-50 U/ml) sin preservantes. El EDTA
puede causar una disminucin en la formacin de rosetas. La muestra
debe ser procesada el mismo da, para preservar al mximo la viabilidad
linfocitaria.

Rosetas EA

Propiedad que tienen los linfocitos B (con receptores en su superficie para

el fragmento Fc de las inmunoglobulinas) de producir rosetas con
hemates recubiertos de anticuerpos antieritrocitarios (p. ej., hemates D
recubiertos de anticuerpos anti-D). Se le denomina test de rosetas EA
(eritrocito-anticuerpo), pues no precisa complemento.
Estas clulas son, en su mayora, theta negativa. No es un buen marcador
de linfocitos B, pues otras clulas distintas de las clulas B tienen dicho
marcador, como los monocitos, las clulas T activadas y las clulas K.
Adems, no todas las clulas B tienen receptor para el fragmento Fc de
las inmunoglobulinas.
 Bibliografa

Abul k. Abbas, MBBS Andrew H. Lichtman MD, PhD. Inmunologia

cellular y molecular 5ta edicion, editorial Elsevier(2004)

Cova , Jose . EL SISTEMA E COMPLEMENTO, MD instituto de

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Buscador en lnea[ webdelprofesor.ula.ve/medicina/jacova/
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Lomonte, B. (2009) Tcnicas de Laboratorio en Inmunologa

Clnica, 122 pp. Universidad de Costa Rica. Acceso libre en:
http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/