CUANTIFICACIN DE PROTENAS

Las protenas estn constitutidas por cadenas polipeptidcas. Un polipptido puede

adoptar distintas conformaciones o plegamientos (el plegamiento est asociado con su
futura funcin biolgica). Los esqueletos polipeptidicos estn conformados por
aminocidos, unidos entre ellos por enlaces peptdicos. Debido a la estructura peptdica y
la presencia de determinados grupos en su cadena lateral, estn pueden reaccionar con
una variedad de agentes qumicos originndose productos coloreados, siendo estas
reacciones la base para la determinacin cualitativa y cuantitativa de las protenas.

Metodos ms empelados en la cuantificacin de protenas

Espectrofotmetria luz ultravioleta (280nm)
Este mtodo es simple y el volumen de la muestra depender mucho del tipo de
espectrofotmetro que se emplear. La mayora de las protenas absorben en el UV a 280
nm. Debido bsicamente a grupos cromforos de tirosina y triptofano. Si se considera que
la cantidad de estos dos aminocidos es siempre constante la absorbancia debe ser
proporcional a la concentracin de protena. Sin embargo, la muestra proteica debe
encontrarse pura y no contener componentes no proteicos con el mismo espectro de
absorcin, tales como cidos nucleicos contaminantes.

Ensayo de Lowry

El ensayo de Lowry, propuesto por Oliver H. Lowry en 1951, se basa en dos reacciones
qumicas. La primera reaccin es la reduccin de los iones de cobre en condiciones
alcalinas, los cual forma un complejo con los enlaces peptdicos (reaccin de Biuret). La
segunda es la reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-enlace
peptdico, el cual causa un cambio en el color de la solucin a azulado con una absorcin
en el rango de 650 a 750 nm. La cantidad de protena en la muestra puede ser estimada
utilizando una curva de calibracin con una solucin de una protena estndar.
cido bicinconnico (BCA) o ensayo basado en cobre
El ensayo de cido bicinconnico (BCA) fue inventado por Paul K. Smith en 1985. Tanto el
ensayo de BCA como el de Lowry se basan en la conversin del Cu2+ a Cu1+ en
condiciones alcalinas. Esta conversin es definida como la reaccin de Biuret. Esta
reaccin es influenciada por cuatro aminocidos (cistena, cistina, tirosina y triptfano) y
tambin por la cadena peptdica.

Ensayo de Bradford
El ensayo de Bradford, originalmente descripto por la Dr. Marion Bradford en 1976, el
mismo est basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en
respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con
aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante con
las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde 465 a 595
nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en que el Coomasie G-250 puede presentarse en
dos colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante
se une a la protena. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595
y 465 nm (595-465nm).

REFERENCIAS
Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.