CONSUMO DE GLUCOSA EN ANAEROBIOSIS POR Saccharomyces cerevisiae

I. INTRODUCCIN

Los organismos vivos necesitan producir energa indispensable para cumplir sus diferentes funciones metablicas.
Esta energa la obtienen principalmente a partir del consumo de carbohidratos como la glucosa, que es la molcula
mayormente utilizada por los sistemas biolgicos.

La glucolisis, por medio de la cual la glucosa se degrada parcialmente, almacenndose parte de la energa bajo la
forma de ATP, tiene como producto final al piruvato. Dependiendo del microorganismo y tejido que lo metaboliza
y de la presencia o ausencia de oxgeno, el piruvato se convierte en alcohol o lactato.

Desde el punto de vista evolutivo, se acepta que el metabolismo ha ido perfeccionndose, adquiriendo nuevas
modalidades a medida que los seres vivos se desarrollaban evolutivamente ms complejos. As, tenemos que las
bacterias, que son menos evolucionadas, presentan un predominio del ciclo anaerbico, debido a que estos
microorganismos carecen de sistemas enzimticos para su catabolismo aerbico.

En cambio, en animales ms evolucionados, como es el caso de los mamferos y aves, los carbohidratos sufren una
degradacin completa; es decir, pasan por el catabolismo anaerbico y aerbico.

En condiciones anaerobias, algunos microorganismos, en particular las levaduras, producen alcohol etlico y CO 2.
En cambio, los tejidos de los mamferos solo producen cido lctico en ausencia de oxgeno.

Algunos tejidos se distinguen metablicamente por el hecho de realizar una activsima gluclisis, incluso en
presencia de bastante oxgeno; entre estos tejidos tenemos el cerebro y las clulas cancerosas.

La reaccin global neta de la glucolisis en anaerobiosis es: Glucosa + 2 ADP + 2Pi 2 Lactato + 2ATP + 2H 2O.

La presente experiencia prctica de laboratorio, tiene como finalidad la demostracin del consumo de glucosa en
anaerobiosis por Saccharomyces cerevisiae (levadura de pan o vino).

II. MATERIAL Y MTODOS

1. MATERIALES

- Material Biolgico:
Saccharomyces cerevisiae levadura de pan o del vino (suspensin al 1%).

- Materiales y equipos de laboratorio:

Sistema de fermentacin: Matraz de 50 mL de capacidad.
Tapn de jebe atravesado por un tubo de vidrio, manguerilla y pinza.
Bomba al vaco.
Gradilla y tubos de 16 x 125 mm.
Pipetas de 1, 2, 5 y de 10 mL.
Embudos de vidrio y papel filtro Watman N1.
Cocina elctrica y pocillo de 500 mL.
Espectrofotmetro.

- Reactivos y soluciones:
Buffer de acetato 0.1 M pH 5.
Glucosa 0.2 M.
cido sulfrico 2/3 N.
Tungstato de sodio 10%.
Solucin cprica alcalina.
Solucin fosfomolbdica.
Agua destilada.
 2. MTODOS

A. SISTEMA DE INCUBACIN

1. En una matraz de 50 mL, adicionar:

a) Buffer acetato 0.1 M pH 5 ... 12.0 mL
b) Glucosa 0.2 M en buffer acetato 0.1 M pH 4.6 .. 1.8 mL
c) Suspensin de levadura 1% en buffer acetato ... 1.5 mL

2. Mezclar y tomar una alcuota de 1 mL y colocarla en un tubo que contiene 1 mL de H 2SO4 2/3 N.
Mezclar y dejar en reposo como mnimo 2 minutos, mientras se procede con el siguiente paso. Esta
alcuota corresponde a la muestra tiempo cero (0 minutos).

3. Despus de extrado la muestra tiempo cero, tapar el matraz con el tapn de jebe y extraer el aire
con una bomba de vaco durante 3 a 5 minutos. Proceder a la incubacin, a 37C durante 1 hora;
anotando el tiempo de incubacin desde el momento en que se toma la primera muestra (muestra
tiempo cero).

4. Luego de transcurrido una 1 hora, tomar la segunda muestra y proceder como en el paso 2.

5. A las muestras de los pasos 2 y 4, se les adiciona 1 mL de Tungstato de sodio (Na 2WO4) al 10%.
Mezclar vigorosamente, dejar en reposo por 2 minutos, agregar 7 mL de agua destilada, mezclar por
inversin y filtrar.

B. DETERMINACIN DEL AZCAR RESIDUAL

El azcar residual se determinara con los filtrados del paso 5, utilizando el siguiente sistema:

TUBOS (mL)
COMPONENTES (mL) Y PROCESO
B I II
Agua destilada 1.0 0.5 0.5
Filtrado del paso 2 (tiempo 0) -- 0.5 --
Filtrado del paso 4 (tiempo 60) -- -- 0.5
Solucin cprico alcalina 1.0 1.0 1.0
Mezclar y colocar en bao de agua hirviendo por 8 minutos.
Al trmino de este tiempo enfriar en agua corriente.
Solucin fosfomolbdica 1.0 1.0 1.0
Mezclar energticamente y dejar en reposo por 3 minutos.
Agua destilada 7.0 7.0 7.0
Mezclar por inversin y dejar en reposo durante 10 minutos. Realizar las lecturas
colorimtricas utilizando un espectrofotmetro a 420 nm.

III. RESULTADOS

CLCULOS

1. Corregir las lecturas de los tubos I y II restndoles la lectura del tubo B (Blanco).

2. Cuantificar la glucosa residual multiplicando las lecturas corregidas por el factor de calibracin, y expresando
los resultados en mg de glucosa/100 mL de suspensin de levadura.
Factor de calibracin = 800 mg de glucosa/100 mL de suspensin de levadura.

3. Interpretar los resultados

IV. DISCUSIN

V. CONCLUSIONES

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

 CONSUMO DE GLUCOSA EN AEROBIOSIS POR Saccharomyces cerevisiae
EFECTO PASTEUR

I. INTRODUCCIN

Un gran nmero de levaduras pueden metabolizar los azcares en aerobiosis y en anaerobiosis. Al permitir la
respiracin un mejor rendimiento celular, entonces, se consume menos azcar en aerobiosis que en anaerobiosis,
o dicho de otro modo, la aerobiosis implica una disminucin del consumo de azcar y una disminucin de la
fermentacin. Esta inhibicin de la fermentacin por la respiracin se llama Efecto Pasteur.

Esta inhibicin se explica por la competicin entre el piruvato descarboxilasa (fermentacin) que tiene una baja
afinidad por el piruvato (KM = 3 - 4 mM) y la piruvato deshidrogenasa (respiracin) que tiene una gran afinidad (KM
= 0,1 0,2 mM). As pues nicamente cuando la cantidad de piruvato sobrepasa la capacidad de la piruvato
deshidrogenasa puede entonces acumularse para permitir el funcionamiento de la piruvato descarboxilasa y, de
este modo, hacer posible la fermentacin.

La disminucin del consumo de glucosa en aerobiosis puede explicarse, por una regulacin a nivel de etapas de la
gliclisis (Consultar Bioqumica de Strayer, 2004).

La importancia del Efecto Pasteur vara segn las especies de levaduras. Es tanto ms marcado cuanto ms
importante es el metabolismo respiratorio en las cepas. El Efecto Pasteur es ms notorio en Candida tropicalis. En
Saccharomyces cerevisiae, el Efecto Pasteur bien est ausente, o bien tiene una amplitud muy dbil.

La presente experiencia prctica de laboratorio, tiene como finalidad la demostracin del efecto de la aireacin
sobre el consumo de glucosa por Saccharomyces cerevisiae (levadura de pan o vino).

II. MATERIAL Y MTODOS

3. MATERIALES

- Material Biolgico:

Saccharomyces cerevisiae levadura de pan o del vino (suspensin al 10% en agua destilada).

- Materiales y equipos de laboratorio:

Sistema de incubacin: Matraz o tubo de ensayo de 50 mL de capacidad.

Manguerilla delgada para salida y entrada de aire.
Bomba de aire.
Gradilla (01) y tubos de 16 x 125 mm (07).
Pipetas de 1, 2 y de 10 mL (02 por cada una).
Embudos de vidrio y papel filtro Watman N1.
Embudos de vidrio (02) y papel filtro cortado (02)
Cocina elctrica y pocillo.
Espectrofotmetro.

- Reactivos y soluciones:

Buffer de acetato 0.1 M pH 5.

Glucosa 0.2 M en agua destilada.
cido sulfrico 2/3 N.
Tungstato de sodio 10%.
Solucin cprica alcalina.
Solucin fosfomolbdica.
Agua destilada.
 4. MTODOS

C. SISTEMA DE INCUBACIN

1. En una matraz o tubo de ensayo de 50 mL, adicionar:

d) Buffer acetato 0.1 M pH 5 ... 12.0 mL
e) Glucosa 0.2 M en agua destilada .... 1.8 mL
f) Levadura 10% .... 1.5 mL

2. Mezclar y, en el acto, tomar una alcuota de 1 mL y colocarla en un tubo que contiene 1 mL de H2SO4
2/3 N. Mezclar y dejar en reposo como mnimo 2 minutos, mientras se procede con el siguiente paso.
Esta alcuota corresponde a la muestra tiempo cero (0 minutos).

3. A travs de una manguerilla fina, conectar el sistema de incubacin a una bomba de aire para el
suministro de una franca y correspondiente aireacin. Proceder a la incubacin con aireacin
constante, anotando el tiempo de incubacin desde el momento en que se toma la primera muestra
(muestra tiempo cero).

4. A continuacin a la muestra del paso 2 (tiempo 0), se le adiciona 1 mL de Tungstato de sodio al 10%.
Mezclar vigorosamente, dejar en reposo por 2 minutos, agregar 7 mL de agua destilada, mezclar
inversin y filtrar.

5. Luego de transcurrido 1 hora (tiempo 60), tomar la segunda muestra y proceder, primero, como en
el paso 2 y, luego como en el paso 4.

D. DETERMINACIN DEL AZCAR RESIDUAL

El azcar residual se determinara en los filtrados de los pasos 4 y 5, utilizando el siguiente sistema:

TUBOS (mL)
COMPONENTES (mL) Y PROCESO
B I II
Agua destilada 1.0 0.5 0.5
Filtrado del paso 4 (tiempo 0) -- 0.5 --
Filtrado del paso 5 (tiempo 60) -- -- 0.5
Solucin cprico alcalina 1.0 1.0 1.0
Mezclar y colocar en bao de agua hirviendo por 8 minutos.
Al trmino de este tiempo enfriar en agua corriente.
Solucin fosfomolbdica 1.0 1.0 1.0
Mezclar energticamente y dejar en reposo por 3 minutos.
Agua destilada 7.0 7.0 7.0
Mezclar por inversin y dejar en reposo durante 10 minutos. Realizar las lecturas
colorimtricas utilizando un espectrofotmetro a 420 nm.

III. RESULTADOS

CLCULOS

1. Corregir las lecturas de los tubos I y II restndoles la lectura del tubo B (Blanco).

2. Cuantificar la glucosa residual multiplicando las lecturas corregidas por el factor de calibracin, y expresando
los resultados en mg de glucosa/100 mL de suspensin de levadura.
Factor de calibracin = 800 mg de glucosa/100 mL de suspensin de levadura.

3. Interpretar los resultados

IV. DISCUSIN
V. CONCLUSIONES
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS