Biologa Estructural

Felipe Trajtenberg
!
Unidad de Cristalografa de Protenas
Institut Pasteur de Montevideo
Por qu estudiar las macromolculas
biolgicas desde un punto de vista
estructural?

Apectos generales sobre Biologa

Estructural

Perspectiva histrica en el rea

Conceptos a tener en mente

Biologa Estructural:
Es una rama de la biologa molecular, la
bioqumica y la biofsica, interesada en la
estructura molecular de macromolculas
biolgicas, especialmente protenas y cidos
nucleicos, cmo adquieren las estructuras que
tienen, y cmo afectan las alteraciones de
dicha estructura en sus funciones bioqumicas
y celulares
Biologa Estructural:
Es una rama de la biologa molecular, la
bioqumica y la biofsica, interesada en la
estructura molecular de macromolculas
biolgicas, especialmente protenas y cidos
nucleicos, cmo adquieren las estructuras que
tienen, y cmo afectan las alteraciones de
dicha estructura en sus funciones bioqumicas
y celulares
Biologa Estructural:
Es una rama de la biologa molecular, la
bioqumica y la biofsica, interesada en la
estructura molecular de macromolculas
biolgicas, especialmente protenas y cidos
nucleicos, cmo adquieren las estructuras que
tienen, y cmo afectan las alteraciones de
dicha estructura en sus funciones bioqumicas
y celulares
Biologa Estructural:
Es una rama de la biologa molecular, la
bioqumica y la biofsica, interesada en la
estructura molecular de macromolculas
biolgicas, especialmente protenas y cidos
nucleicos, cmo adquieren las estructuras que
tienen, y cmo afectan las alteraciones de
dicha estructura en sus funciones bioqumicas
y celulares
 Ecosistemas

Comunidades Ecologa

Poblaciones

Organismos
Fisiologa
In vitro In vivo

Tejidos
Histologa
Clulas Biologa Celular

Molculas
Biologa Molecular/Bioqumica
Atomos Biologa Estructural
 Contexto Biolgico
Sequencia

Escalas
estructurales
3D
MESDAMESETMESSRSMYNAMEI
SWALTERYALLKINCALLMEWALL Structure
YIPREFERDREVILMYSELFIMACE
NTERDIRATVANDYINTENNESSE
EILIKENMRANDDYNAMICSRPAD
NAPRIMASERADCALCYCLINNDR
KINASEMRPCALTRACTINKARKI
polymerase
CIPCDPKIQDENVSDETAVSWILL
WINITALL
SSBs
Complexes
helicase

Organism primase

Assemblies

Cell

Structures

Cell
Por qu nos interesan las estructura atmicas
de las macromolculas biolgicas?

la estructura 3D define la funcin de las molculas

entender como interaccionan y cambian

conformacionalmente, en eventos funcionalmente
relevantes

Cmo las enzimas catalizan reacciones y son

reguladas?

etc...
Diagramas 2D
 Sitio activo en 3D

Diagramas 2D
Un ejemplo sera como disear nuevas drogas
en forma racional:
Un ejemplo sera como disear nuevas drogas
en forma racional:

Gleevec o Imatinib

Inhibidor de una tirosina quinasa BCR-Abl para el

tratamiento de cncer (leucemia mieloide crnica)
Biologa Estructural:
Bioinformtica Estructural
! Calorimetra
(no solo predicciones, sino
tambin simulaciones, dinmica
molecular, qumica cuntica, etc)
Cristalografa de rayos X
NMR
Microscopa electrnica
SAXS
tcnicas espectroscpicas
(CD, EPR, etc...)
Espectrometra de masa
Dispersin de lux
Resonancia plasmnica de
superficie
...
pero, las biomolculas son casi siempre demasiado
pequeas para poder ser 'vistas', aun con los
microscopios pticos ms avanzados.
pero, las biomolculas son casi siempre demasiado
pequeas para poder ser 'vistas', aun con los
microscopios pticos ms avanzados.

De all que la mayora de los mtodos *experimentales*

que usamos para determinar estructuras implican medir
simultneamente vastos nmeros de molculas idnticas
(y ponerlas "en fase" espacial y/o temporalmente)
pero, las biomolculas son casi siempre demasiado
pequeas para poder ser 'vistas', aun con los
microscopios pticos ms avanzados.

De all que la mayora de los mtodos *experimentales*

que usamos para determinar estructuras implican medir
simultneamente vastos nmeros de molculas idnticas
(y ponerlas "en fase" espacial y/o temporalmente)

El estudio de partculas nicas aisladas es hoy un

dominio de punta que se est desarrollando
activamente
Mtodos para la determinacin de estructuras:
Cristalografa de rayos X (0.6 - 4)

Resonancia magntica nuclear (2 - 3??)

Crio-microscopa electrnica (3 - 30)

SAXS (>30)

Resolucin ptica = capacidad para

discriminar entre dos objetos en una imagen
 RMN vs cristalografa de protenas

ambas pueden generar estructuras a resolucin atmica

ambas necesitan grandes cantidades de protena pura

RMN
no necesita cristales (aunque la solucin es MUY concentrada) -->>
DINAMICA

est limitada a protenas 'pequeas' (30 kDa ya es difcil)

es fcil detectar qu parte de una protena interacta con ligandos

las estructuras no son muy precisas

(depende del nmero de interacciones que restringan la construccin de
los modelos)

IBR (Rosario), LNLS (Campinas), CNRMN (Rio), prox. FIL (Bs As)

PX
necesita cristales (frecuentemente es difcil)

las estructuras pueden ser muy precisas (depende de la resolucin)

no hay lmite de tamao (se han resuelto estructuras de >106 daltons)

IFSC (So Carlos), IPMONT (Montevideo), LNLS (Campinas)
 EM vs cristalografa de protenas
PX
necesita mucha muestra

necesita obtener cristales (frecuentemente 'difcil')

genera estructuras con resolucin atmica - se pueden interpretar los resultados
estructurales en trminos de conformaciones moleculares muy precisas

no tiene un lmite de tamao en la muestra (se han resuelto estructuras de >106
daltons)

EM
no necesita cristales

se necesita menos material

resolucin de 10 o peor- no hay atomicidad, slo blobs

se puede aplicar slo a molculas suficientemente grandes como para ser
"vistas" (ms de 150-300 kDa) - no hay tamaos mximos.
 EM vs cristalografa de protenas
PX
necesita mucha muestra

necesita obtener cristales (frecuentemente 'difcil')

genera estructuras con resolucin atmica - se pueden interpretar los resultados
estructurales en trminos de conformaciones moleculares muy precisas

no tiene un lmite de tamao en la muestra (se han resuelto estructuras de >106
daltons)

EM
no necesita cristales

se necesita menos material

resolucin de 10 o peor- no hay atomicidad, slo blobs

se puede aplicar slo a molculas suficientemente grandes como para ser
"vistas" (ms de 150-300 kDa) - no hay tamaos mximos.

En competencia directa (como en la estructura del ribosoma o de la RNA polimerasa)

PX da mucha ms informacin; pero, la EM puede ser enormemente til para
ensambles macromoleculares difciles de cristalizar, o que se producen en bajas
cantidades, y mimetizando muchas veces mejor las situaciones fisiolgicas.
 EM vs cristalografa de protenas
Son tcnicas complementarias!
C u a n d o la e st r u ct u ra d e lo s
co mp o n ente s in divi duale s de u n
complejo ha sido determinada por PX,
pero la forma en la que se ensamblan
no es conocida, un mapa EM a una
resolucin de 15-30 puede ser usado
para ajustar cuantitativamente las
estructuras atmicas y entender las
interacciones moleculares

 EM vs cristalografa de protenas
Son tcnicas complementarias!
C u a n d o la e st r u ct u ra d e lo s
co mp o n ente s in divi duale s de u n
complejo ha sido determinada por PX,
pero la forma en la que se ensamblan
no es conocida, un mapa EM a una
resolucin de 15-30 puede ser usado
para ajustar cuantitativamente las
estructuras atmicas y entender las
interacciones moleculares

Reconstruccin EM de la RNA
Polimerasa de levadura, mostrando
la interaccin entre el ncleo (rojo)
y dos subunidades adicionales (azul)
 EM vs cristalografa de protenas
Son tcnicas complementarias!
C u a n d o la e st r u ct u ra d e lo s
co mp o n ente s in divi duale s de u n
complejo ha sido determinada por PX,
pero la forma en la que se ensamblan
no es conocida, un mapa EM a una
resolucin de 15-30 puede ser usado
para ajustar cuantitativamente las
estructuras atmicas y entender las
interacciones moleculares

Reconstruccin EM de la RNA
Polimerasa de levadura, mostrando
la interaccin entre el ncleo (rojo)
y dos subunidades adicionales (azul)
 EM vs cristalografa de protenas
Son tcnicas complementarias!
C u a n d o la e st r u ct u ra d e lo s
co mp o n ente s in divi duale s de u n
complejo ha sido determinada por PX,
pero la forma en la que se ensamblan
no es conocida, un mapa EM a una
resolucin de 15-30 puede ser usado
para ajustar cuantitativamente las
estructuras atmicas y entender las
interacciones moleculares

Reconstruccin EM de la RNA
Polimerasa de levadura, mostrando
la interaccin entre el ncleo (rojo)
y dos subunidades adicionales (azul)
Algo de historia

el desarrollo del rea dependi de como

nacieron y evolucionaron las metodologas

First structural
image by EM

1964
First MD simulation
First protein structure
1977
1958

DNA structure First structure by NMR

1953 1978

1900 1925 1950 1975 2000 ...

Algo de historia

el desarrollo del rea dependi de como

nacieron y evolucionaron las metodologas

First structural
image by EM

1964
First MD simulation
First protein structure
1977
1958

DNA structure First structure by NMR

1953 1978

1900 1925 1950 1975 2000 ...

Algo de historia

el desarrollo del rea dependi de como

nacieron y evolucionaron las metodologas

First structural
image by EM

1964
First MD simulation
First protein structure
1977
1958

DNA structure First structure by NMR

1953 1978

1900 1925 1950 1975 2000 ...

Algo de historia

el desarrollo del rea dependi de como

nacieron y evolucionaron las metodologas

First structural
image by EM

1964
First MD simulation
First protein structure
1977
1958

DNA structure First structure by NMR

1953 1978

Science 2003 Benkovic

1900 1925 1950 1975 2000 ...

 X-ray diffraction

In 1901 Rntgen was

awarded the very first
Nobel Prize in Physics.

Rntgen

1889

1900 1925 1950 1975 2000 ...

 Premio Nobel en Fsica (1914) por el
descubrimiento que los cristales son capaces
de difractar los rayos X

The guiding idea was that interferences

arise in consequence of the space lattice
structure of the crystals, because the
lattice constants are ca. 10 times greater
than the conjectured wavelengths of the X-
Max von Laue
rays.
1912

1900 1925 1950 1975 2000 ...

 Premio Nobel en Fsica (1915)
por los servicios prestados en
el analysis de estructuras
cristalinas con rayos X

W. Bragg and L. Bragg n = 2d.sen

1913

1900 1925 1950 1975 2000 ...

 Primeras evidencias que las
proteins no son coloides sin
estructura definida

D. Crowfoot and J.D. Bernal

1934

1900 1925 1950 1975 2000 ...

 Premio Nobel en Qumica (1964) por la determinacin
estructural de sustancias bioqumicas relevantes

D. Crowfoot

1949

1900 1925 1950 1975 2000 ...

 En 1951, en funcin de la estructura de
aa, enlace peptdico, Pauling, Robert
Corey and Herman Branson predijeron
correctamente las alfa hlices y las hoja
beta

L. Pauling

1920-1960

1900 1925 1950 1975 2000 ...

Ao "fundacional" (aunque se vena preparando
desde principios de siglo) 1962

Premio nobel de Medicina

F Crick, J Watson y F Wilkins

estructura del ADN - mecanismo de replicacin

!
Premio Nobel de Qumica

M Perutz y J Kendrew

Estructura de las primeras protenas - plegamiento 3D

J. Watson and F. Crick

J Kendrew

M. Perutz 1953 1958

1900 1925 1950 1975 2000 ...

 original papers

J. Watson and F. Crick

1953

1900 1925 1950 1975 2000 ...

NATURE | VOL 421 | 23 JANUARY 2003 | www.nature.com/nature 2003 Nature Publishing Group
 R. Franklin

J. Watson and F. Crick

1953

1900 1925 1950 1975 2000 ...

Kendrew y Perutz recibieron el
premio Nobel de qumica (1962) J Kendrew
por la determinacin de la primera
estructura atmica de protenas 1958
usando rayos X

1900 1925 1950 1975 2000 ...

 M. Perutz

1960

1900 1925 1950 1975 2000 ...

1962: Michael Rossmann described the first use of molecular replacement

!
1964: Aaron Klug showed that the principles of structure determination by X-ray diffraction could be used to
develop crystallographic electron microscopy

!
1965: David C. Phillips determined in atomic detail the first structure of an enzyme

!
1969: Benno P. Schoenborn demonstrated that neutron diffraction could be used to reveal the position of fixed
hydrogen atoms in biological molecules.

!
1971: The Protein Data Bank (PDB) was established at Brookhaven National Laboratory

!
1972: Paul Berg assembled the first DNA molecules that combined genes from different organisms

!
1977: Martin Karplus report the first MD simulation of a macromolecule of biological interest

!
1978: Kurth Wthrich used nuclear magnetic resonance (NMR) as a method for determining protein structures

!
1985: Johann Deisenhofer, Robert Huber, and Hartmut Michel determined in atomic detail the first integral
membrane protein: a photosynthetic reaction center from a purple bacterium

!
1990: Wayne Hendrickson proposed the method called the multiwavelength anomalous diffraction (MAD) method

!
1999: Ada Yonath, Tom Steitz, Venki Ramakrishnan, and Harry Noller led to the determination of the first structures
of the ribosome

!
2001: Roger Kornberg solved the 3-D structure of RNA polymerase

!
2007: Brian Kobilka solve the first structure of a human G protein-coupled receptor (GPCR)

!
2013: Martin Karplus, Michael Levitt and Ariel Warshel nobel prize for the development of multiscale models for
complex chemical systems

1900 1925 1950 1975 2000 ...

1962: Michael Rossmann described the first use of molecular replacement

!
1964: Aaron Klug showed that the principles of structure determination by X-ray diffraction could be used to
develop crystallographic electron microscopy

!
1965: David C. Phillips determined in atomic detail the first structure of an enzyme

!
1969: Benno P. Schoenborn demonstrated that neutron diffraction could be used to reveal the position of fixed
hydrogen atoms in biological molecules.

!
1971: The Protein Data Bank (PDB) was established at Brookhaven National Laboratory

!
1972: Paul Berg assembled the first DNA molecules that combined genes from different organisms

!
1977: Martin Karplus report the first MD simulation of a macromolecule of biological interest

!
1978: Kurth Wthrich used nuclear magnetic resonance (NMR) as a method for determining protein structures

!
1985: Johann Deisenhofer, Robert Huber, and Hartmut Michel determined in atomic detail the first integral
membrane protein: a photosynthetic reaction center from a purple bacterium

!
1990: Wayne Hendrickson proposed the method called the multiwavelength anomalous diffraction (MAD) method

!
1999: Ada Yonath, Tom Steitz, Venki Ramakrishnan, and Harry Noller led to the determination of the first structures
of the ribosome

!
2001: Roger Kornberg solved the 3-D structure of RNA polymerase

!
2007: Brian Kobilka solve the first structure of a human G protein-coupled receptor (GPCR)

!
2013: Martin Karplus, Michael Levitt and Ariel Warshel nobel prize for the development of multiscale models for
complex chemical systems

1900 1925 1950 1975 2000 ...

1962: Michael Rossmann described the first use of molecular replacement

!
1964: Aaron Klug showed that the principles of structure determination by X-ray diffraction could be used to
develop crystallographic electron microscopy

!
1965: David C. Phillips determined in atomic detail the first structure of an enzyme

!
1969: Benno P. Schoenborn demonstrated that neutron diffraction could be used to reveal the position of fixed
hydrogen atoms in biological molecules.

!
1971: The Protein Data Bank (PDB) was established at Brookhaven National Laboratory

!
1972: Paul Berg assembled the first DNA molecules that combined genes from different organisms

!
1977: Martin Karplus report the first MD simulation of a macromolecule of biological interest

!
1978: Kurth Wthrich used nuclear magnetic resonance (NMR) as a method for determining protein structures

!
1985: Johann Deisenhofer, Robert Huber, and Hartmut Michel determined in atomic detail the first integral
membrane protein: a photosynthetic reaction center from a purple bacterium

!
1990: Wayne Hendrickson proposed the method called the multiwavelength anomalous diffraction (MAD) method

!
1999: Ada Yonath, Tom Steitz, Venki Ramakrishnan, and Harry Noller led to the determination of the first structures
of the ribosome

!
2001: Roger Kornberg solved the 3-D structure of RNA polymerase

!
2007: Brian Kobilka solve the first structure of a human G protein-coupled receptor (GPCR)

!
2013: Martin Karplus, Michael Levitt and Ariel Warshel nobel prize for the development of multiscale models for
complex chemical systems

1900 1925 1950 1975 2000 ...

 Protein Data Bank (PDB)

Es una base de datos donde se almacenan las

estructuras que se han generado. Esta informacin
esta completamente disponible!!!

!
www.pdb.org

Cristalografa de rayos X #87755

Resonancia magntica nuclear #10384

Microscopa electrnica #740

Algunos conceptos generales aprendidos
en 60 aos de trabajo
 Las estructuras
secundarias y terciarias de
las macromolculas,
conllevan informacin clave
para determinar la funcin

myoglobin

Arquitectura, Ingeniera,
Forma, Topologa, Distancias,
Flexibilidad

protein A
Los 20 aminocidos encontrados en las protenas naturales
 los aminocidos son
molculas quirales (a
excepcin de la glicina)

en protenas de origen natural

solo encontramos esteroisomeros L
Niveles de complejidad estructural

La secuencia lineal de
aminocidos define la
estructura primaria
Niveles de complejidad estructural

La secuencia lineal de
aminocidos define la
estructura primaria
Enlace peptdico es planar:
ojo! L vs D no es lo mismo que pptidos cis vs trans

trans cis
ojo! L vs D no es lo mismo que pptidos cis vs trans

trans cis
con lo que aparece el concepto de ngulos dihedros, 3 por
aminocido , y . Estos tres definen el plegamiento!!!
con lo que aparece el concepto de ngulos dihedros, 3 por
aminocido , y . Estos tres definen el plegamiento!!!

= 0 180
pero y pueden tomar cualquier
valor? en teora s (son enlaces
simples)

Grfico de Ramachandran
(distribucin de combinacin de
dihedros de la cadena principal)

Ramachandran, G.N.; Ramakrishnan, C.; Sasisekharan, V. (1963). "Stereochemistry

of polypeptide chain configurations". Journal of Molecular Biology 7: 959.
pero y pueden tomar cualquier
valor? en teora s (son enlaces
simples)

Grfico de Ramachandran
(distribucin de combinacin de
dihedros de la cadena principal)

Ramachandran, G.N.; Ramakrishnan, C.; Sasisekharan, V. (1963). "Stereochemistry

of polypeptide chain configurations". Journal of Molecular Biology 7: 959.

no Gly Gly

efecto estrico de
la cadena lateral

En cuanto a los dihedros de las cadenas laterales (!),
mucha mayor dispersin, aunque energticamente hay
conformaciones preferidas : rotmeros

eclipsado alternado ('staggered')

1=180 1=60 1=-60

 Estructura secundaria

hojas , hlices , loops

Estructura terciaria

plegamiento 3D (clases)

Estructura cuaternaria

multmeros y complejos

Las fuerzas no covalentes juegan un rol fundamental
para entender las interacciones : por qu se pliegan la
protenas, cmo interactan con otras molculas

El problema del plegamiento de las protenas...
El problema del plegamiento de las protenas...
Por qu nos interesan las estructura atmicas
de las macromolculas biolgicas?

la estructura 3D define la funcin de las molculas

entender como interaccionan y cambian

conformacionalmente, en eventos funcionalmente
relevantes

Cmo las enzimas catalizan reacciones y son

reguladas?

etc...
 Uno de los grandes desafos de la
biologa (estructural)
llenar el 'hueco' entre el mundo molecular y la
clulas vivas un problema de "escala espacial "

necesidad de usar aproximaciones multidisciplinarias

desde la xtalografa : mirar complejos macromoleculares!!

Estrategia tpica para encarar la Biologa
Estructural de resolucin atmica

Desglosar la complejidad de manera que el sistema

puda ser entendido a un nivel bsico

Tcnicas de determinacin (RMN y Rx), mutagnesis basada

en estructura y ensayos funcionales

Armar la imagen del conjunto a partir de la

reconstruccin de las partes a alta resolucin
(rompecabezas)

Consistencia con evidencia en solucin (in vitro e in vivo):

bioqumica, microscopas, interacciones, espectroscopas
 Biologa estructural en IPMONT

Cristalografa de Biofsica de protenas

macromolculas
'en solucin

(PXF) (UBP)

Protenas recombinantes

Biosimulaciones
Mutagnesis basada en
Moleculares estructura

Estudios funcionales

(UPR)
Unidad de Cristalografa
de Protenas