Tese - 6615 - Jose Arcanjo Nunes PDF

1
JOS ARCANJO NUNES
PROPAGAO IN VITRO DA BAUNILHEIRA (ORCHIDACEAE)
Tese apresentada ao Centro de Cincias

Agrrias da Universidade Federal do Esprito
Santo, como parte das exigncias do
Programa de Ps-Graduao em Produo
Vegetal, para obteno do ttulo de Doutor
em Produo Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Edilson Romais
Schmildt.
ALEGRE
ESPRITO SANTO BRASIL
2013
2
Dados Internacionais de Catalogao-na-publicao (CIP)

(Biblioteca Setorial de Cincias Agrrias, Universidade Federal do Esprito Santo, ES, Brasil)
Nunes, Jos Arcanjo,

N972p Propagao in vitro da baunilheira (Orquidaceae) / Jos Arcanjo
Nunes. 2014.
99f.: il.
Orientador: Edilson Romais Schmildt.

Co-orientadores: Jos Augusto Teixeira do Amaral; Jos Carlos
Lopes.
Tese (Doutorado em Produo Vegetal) Universidade Federal
do Esprito Santo, Centro de Cincias Agrrias.
1. Vanilla planifolia. 2. Carboidrato. 3. Gema Axilar. 4. Substrato. I.

Schmildt, Edilson Romais. II. Amaral, Jos Augusto Teixeira do. III.
Lopes, Jos Carlos. IV. Universidade Federal do Esprito Santo.
Centro de Cincias Agrrias. V. Ttulo.
CDU: 63
i
JOS ARCANJO NUNES
PROPAGAO IN VITRO DA BAUNILHEIRA (ORCHIDACEAE)
Tese apresentada ao Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do

Esprito Santo, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao em
Produo Vegetal, para obteno do ttulo de Doutor em Produo Vegetal.
Aprovada em 17 de dezembro de 2013.
COMISSO EXAMINADORA:
_______________________________________________________________
Profa. Virginia Silva Carvalho
Universidade Estadual do Norte Fluminense
_______________________________________________________________
Prof. Paulo Cezar Cavatte
Universidade Federal do Esprito Santo
_______________________________________________________________
Prof. Jos Augusto Teixeira do Amaral
_______________________________________________________________
Prof. Jos Carlos Lopes
_______________________________________________________________
Prof. Edilson Romais Schmildt
Orientador
ii
DEDICO
memria dos meus pais, Edis e Rosa, e da minha irm Penha.
minha querida mulher, Regina, pelo apoio e companheirismo.
Aos meus filhos, Rafael e Fernanda, presentes de Deus na minha vida.
Aos meus irmos, Jos Maria, Jos Antnio, Maria de Ftima e Maria Madalena.
Nossa unio a fora que nos faz continuar a viver com alegria.
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, criador do sol, do ar, da gua, da terra, da semente, do homem e do
amor.
Ao povo brasileiro que com o pagamento de seus impostos me deu a

oportunidade de estudar um pouco mais. Espero retribu-lo com o meu trabalho.
Ao Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo,

pela oportunidade, acolhimento e contribuio para minha formao acadmica.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Edilson Romais Schmildt, pelo apoio, incentivo,
conselhos, amizade e, sobretudo, pela oportunidade que me proporcionou ao
realizar um dos meus maiores sonhos, o curso de doutorado.
Aos Professores Jos Augusto Teixeira do Amaral e Jos Carlos Lopes e

Paulo Cezar Cavatte, pela ateno, incentivo, aconselhamentos e companheirismo.
Aos professores do curso, pelas valiosas informaes passadas e por

sempre terem acreditado no meu potencial.
Aos meus colegas de curso, pelo apoio principalmente nas horas mais
difceis.
Ao casal, Maria Cristina Duchne-Veauvy e Jean-Marie Franois Pascal

Veauvy, da empresa Clonagri, pela enorme contribuio nas pesquisas e por terem
me mostrado que o mais importante no o tempo, mas o fazer bem feito.
Aos agricultores familiares da comunidade da Fortaleza, Muqui-ES, que me

deram a oportunidade de conhecer e divulgar a baunilha.
Aos companheiros e amigos, Dr. Omar Schmildt, Dr. Marcos Oliveira

Athayde, Rafael Fonsca Zanotti, Giuliano da Silva Ribeiro, Luciana Ferreira da
Silva, Camila Aparecida da Silva Martins, e aos meus filhos, Rafael Dalvi Nunes e
Fernanda Dalvi Nunes, pela amizade, companheirismo e apoio nos trabalhos de
campo e de laboratrio e pelos valiosssimos esclarecimentos.
iv
Aos funcionrios do CCA-UFES, Madalena Caetano Capucho, Paulo Cezar

de Oliveira e Silvio Rogrio Ferraz, pelo acolhimento, carinho, ateno e presteza
nas minhas necessidades.
Professora Virginia Silva Carvalho, pela amizade e pelas preciosas

informaes acerca da micropropagao de plantas.
Ao companheiro e amigo Jos Carlos Correa Cardoso, pelo apoio

incondicional para que minhas pesquisas pudessem ser realizadas.
Ao INCAPER, pela oportunidade de realizar um dos experimentos na

Fazenda Experimental BANANAL DO NORTE, em Cachoeiro de Itapemirim,
Esprito Santo.
Ao Prefeito Municipal de Cachoeiro de Itapemirim, Carlos Roberto

Casteglione Dias, pela amizade, companheirismo, apoio, confiana e pelas
oportunidades que tem me conferido.
Regina Celi Dalvi Nunes, minha eterna namorada. O apoio que me destes
foi mais uma prova do amor que sentes por mim.
v
A Baunilha
Vs como aquela baunilha
Do tronco rugoso e feio
Da palmeira - em doce enleio
Se prendeu!
Como as razes meteu
Da snea no musgo raro,
Como as folhas - verde-claro -
Espalmou!
Como as bagas pendurou
L de cima! como enleva
O rio, o arvoredo, a relva
Nos odores!
Que inspiram falas de amores!
D-lhe o tronco - apoio, abrigo.
D-lhe ela - perfume amigo,
Graa e olor!
E no consrcio de amor
- Nesse divino existir -
Que os prende, vai-lhes a vida
De uma s seiva nutrida,
Cada vez mais a subir!

vi
Se o verme a raiz lhe ataca,
Se o raio o cimo lhe ofende,
Cai a palmeira, e contudo
Inda a baunilha recende!
Um dia s! _ que mais tarde,
Exausta a fonte do amor,
Tambm a baunilha perde
Vida, graa, encanto, olor!
Antnio Gonalves Dias, 1861.

vii
SUMRIO
Pgina
LISTA DE TABELAS.................................................................................... viii

LISTA DE FIGURAS.................................................................................... x
RESUMO..................................................................................................... xii
ABSTRACT.................................................................................................. xiii
INTRODUO GERAL............................................................................... 1
CAPTULO I REVISO DE LITERATURA............................................... 4
1.1 Consideraes gerais (Vanilla planifolia).............................................. 5
1.2 Descrio botnica da Vanilla planifolia................................................ 7
1.3 Cultivo de Vanilla planifolia................................................................... 9
1.4 Propagao da Vanilla planifolia........................................................... 10
1.5 Importncia econmica......................................................................... 11
1.6 Condies do ambiente de cultivo in vitro............................................. 14
1.6.1 Carboidratos....................................................................................... 16
1.6.1.1 Destino dos carboidratos adicionados ao meio de cultura durante
o metabolismo de explantes de baunilheira................................................ 17
1.6.2 pH....................................................................................................... 20
1.6.3 Fluorescncia da clorofila a................................................................ 20
1.7 Substrato................................................................................................ 21
1.8 Referncias bibliogrficas...................................................................... 22
CAPTULO II Sacarose no crescimento in vitro de baunilheira
(Orchidaceae).............................................................................................. 33
Resumo....................................................................................................... 34
Abstract........................................................................................................ 35
2.1 Introduo.............................................................................................. 36
2.2 Material e mtodos................................................................................ 37
2.3 Resultados e discusso......................................................................... 42
2.4 Concluses............................................................................................ 55
CAPTULO III Crescimento de mudas de baunilheira (Orchidaceae):
recipiente, substrato e tipo de muda............................................................ 63
Resumo........................................................................................................ 64
Abstract........................................................................................................ 65
3.1 Introduo.............................................................................................. 66
3.2 Material e mtodos................................................................................ 69
3.3 Resultados e discusso......................................................................... 72
3.4 Concluses............................................................................................ 78
4. Concluses gerais................................................................................... 83
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Produo mundial de baunilha (ton)......................................... 12
Tabela 2 - Resumo da anlise de varincia para comprimento da parte

area (CPA), nmero de folhas (NF), nmero de razes (NR),
massa da matria fresca total da planta (MFTP), massa da
matria seca total da planta (MSTP), amido, eficincia
fotoqumica mxima (Fv/Fm), taxa de transferncia de
eltrons (TTE), rendimento fotoqumico do FSII (FSII),
rendimento no fotoqumico associado dissipao de
energia pelo ciclo das xantofilas (NPQ), outros mecanismos
de dissipao energtica (NO), clorofila a, clorofila b e
clorofila total, de mudas de Vanilla planifolia provenientes de
micropropagao, submetidas a diferentes concentraes de
sacarose no meio de cultura, e pH do meio de cultura, aos 60
dias de subcultivo, em Arthur Nogueira, SP, 2013................... 42
Tabela 3 - Resumo das anlises de varincia para comprimento da

parte area (CPA), nmero de folhas (NF), nmero de razes
(NR), comprimento da maior raiz (CMR), massa da matria
fresca do caule (MFC), massa da matria fresca da raiz
(MFR), massa da matria fresca da folha (MFF), massa da
matria fresca total da planta (MFTP), massa da matria
seca do caule (MSC), massa da matria seca da raiz (MSR),
massa da matria seca da folha (MSF), massa da matria
seca total da planta (MSTP) e relao parte area/raiz
(RPAR), de mudas de Vanilla planifolia, provenientes de
micropropagao de gema axilar e plntula, aos 90 dias aps
o plantio, em Cachoeiro de Itapemirim, ES, 2013..................... 73
Tabela 4 - Comprimento da parte area (CPA) de mudas de Vanilla

planifolia, em funo do substrato (S) e do tipo de muda (M),
em Cachoeiro de Itapemirim, ES, 2013.................................... 74
Tabela 5 - Nmero de folhas (NF) de mudas de Vanilla planifolia, em

funo do tipo de muda (M), em Cachoeiro de Itapemirim, ES,
2013............................................................................................ 75
Tabela 6 - Comprimento da maior raiz (CMR) de mudas de Vanilla

planifolia, em funo do recipiente (R), em Cachoeiro de
Itapemirim, ES, 2013................................................................. 75
Tabela 7 - Massa da matria fresca do caule (MFC), massa da matria

fresca da folha (MFF), massa da matria fresca total da
planta (MFTP), massa da matria seca do caule (MSC),
massa da matria seca da folha (MSF) e massa da matria
ix
seca total da planta (MSTP) de mudas de Vanilla planifolia,

em funo do recipiente (R), do substrato (S) e do tipo de
muda (M), em Cachoeiro de Itapemirim, ES............................. 77
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura qumica da vanilina.................................................... 7
Figura 2 - Distribuio da produo mundial de baunilha, em 2011......... 12
Figura 3 - Distribuio das importaes de baunilha, em 2011................ 13
Figura 4 - Mudas de Vanilla planifolia provenientes de

micropropagao, cultivadas em meio MS na concentrao
de 30 g L-1 de sacarose: (A) dia da inoculao; (B) aos 35
dias; e (C) aos 60 dias de subcultivo........................................ 39
Figura 5 - (A) - comprimento da parte area (CPA), (B) - nmero de

folhas (NF), (C) - nmero de razes (NR), (D) - massa da
matria fresca total da planta (MFTP) e (E) - massa da
matria seca total da planta (MSTP), de mudas de Vanilla
planifolia provenientes de micropropagao, submetidas a
diferentes concentraes de sacarose no meio de cultura,
aos 60 dias de subcultivo.......................................................... 44
Figura 6 - Mudas de Vanilla planifolia provenientes de

micropropagao, cultivadas em diferentes concentraes de
sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1), no meio de cultura, aos 60
dias de subcultivo...................................................................... 46
Figura 7 - (A) - Fv/Fm (eficincia fotoqumica mxima do FSII), (B) - qP

(coeficiente de extino fotoqumico), (C) - TTE (taxa de
transporte de eltrons), (D) - FSII (rendimento fotoqumico
do FSII), (E) - NPQ (rendimento no fotoqumico associado
dissipao de energia pelo ciclo das xantofilas) e (F) - NO
(outros mecanismos de dissipao energtica) de mudas de
Vanilla planifolia provenientes de micropropagao,
submetidas a diferentes concentraes de sacarose no meio
de cultura, aos 60 dias de subcultivo........................................ 49
Figura 8 - (A) - Clorofila a, (B) - clorofila b, (C) - clorofila total e (D) -

contedo de amido em mudas de Vanilla planifolia
provenientes de micropropagao, cultivadas em diferentes
concentraes de sacarose no meio de cultura, aos 60 dias
de subcultivo............................................................................. 52
Figura 9 - Taxa de perda de gua (TPA) de mudas de Vanilla planifolia

provenientes de micropropagao, cultivadas em diferentes
concentraes de sacarose no meio de cultura........................ 53
Figura 10 - pH do meio de cultivo de mudas de Vanilla planifolia, com

xi
diferentes concentraes de sacarose..................................... 54

xii
RESUMO
Foram realizados dois experimentos com os objetivos de avaliar os efeitos de

diferentes concentraes de sacarose no crescimento in vitro de mudas de Vanilla
planifolia, e analisar as variveis morfolgicas de mudas de V. planifolia cultivadas
em diferentes recipientes e diferentes substratos. Para isso, no experimento 1,
mudas provenientes da proliferao de gemas axilares foram cultivadas in vitro em
cinco concentraes de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1), com quatro repeties de
dez mudas, em delineamento inteiramente casualizado. Variveis morfolgicas,
fluorescncia da clorofila a, teor de amido, taxa de perda de gua e o pH do meio de
cultura foram avaliados 60 dias aps a inoculao das mudas. As diferentes
concentraes de sacarose influenciaram todas as caractersticas morfolgicas e os
parmetros fisiolgicos estudados. Os dados relativos aos aspectos
morfofisiolgicos de mudas de V. planifolia provenientes de micropropagao
sugerem a viabilidade tcnica para a propagao em larga escala de mudas dessa
espcie. No experimento 2, estudou-se as variveis morfolgicas de mudas de V.
planifolia provenientes da proliferao de gemas axilares e da propagao
seminfera in vitro, cultivadas em diferentes recipientes e diferentes substratos. O
experimento foi realizado em esquema de parcelas subsubdivididas, constitudas
pelas combinaes entre os fatores: recipiente (sacola e bandeja), substrato
(preparado I e preparado II) e muda (micropropagada e plntula), num delineamento
inteiramente casualizado, com quatro repeties de oito mudas. A combinao de
recipiente sacola, substrato II (solo, areia, esterco de galinha e serrapilheira de
mata) e muda micropropagada de gema axilar pode ser usada na produo de
mudas de V. planifolia.
Palavras-chave: Vanilla planifolia. Carboidrato. Gema axilar. Substrato.

xiii
ABSTRACT
Two experiments were used to evaluate the effects of different concentrations of

sucrose on in vitro growth of seedlings of Vanilla planifolia, and to analyze the
morphological variables of V. planifolia seedlings grown in different containers, with
different substrates. For such, in experiment 1, seedlings from the proliferation of
axillary buds were cultivated under in vitro conditions using five concentrations of
sucrose (0, 15, 30, 45 and 60 g L-1), with four replicates of ten seedlings in a
completely randomized design. Morphological variables, chlorophyll a fluorescence,
content of starch, rate of water loss and the pH of the culture medium were assessed
60 days after the inoculation of the seedlings. The different concentrations of sucrose
affected all morphological traits and physiological parameters studied. The data
related to the morphophysiological seedlings of V. planifolia obtained from
micropropagation suggest the technical feasibility for large-scale propagation of
seedlings of this species. In experiment 2, we studied the morphological variables of
V. planifolia seedlings from axillary bud proliferation and in vitro seminiferous
propagation, grown in different containers and different substrates. The experiment
was arranged in a split-plot design, formed by the combinations of the following
factors: container (bag and tray), substrate (preparation I and preparation II) and
seedling (micropropagated and seedling), in a completely randomized design with
four replications of eight seedlings. The combination of bag, substrate II (soil, sand,
chicken manure and litter from forest) and micropropagated seedling from axillary
buds can be used in the production of seedlings of V. planifolia.
Keywords: Vanilla planifolia. Carbohydrate. Axillary bud. Substrate.

1
INTRODUO GERAL
A baunilheira uma planta de clima tropical, pertencente famlia Orchidaceae, de

crescimento monopodial, cultivada sob a sombra das rvores, principalmente. Ela se
destaca entre as plantas aromticas, cujo aroma e sabor foram descobertos h
sculos pelos povos astecas e maias, habitantes da Amrica Central. A principal
espcie comercial a Vanilla planifolia, nativa do Mxico.
A baunilha uma importante especiaria utilizada na culinria, principalmente, na

fabricao de sorvetes, chocolates e produtos de confeitarias. Tambm tem uso na
produo de perfumes e frmacos. Possui alto valor comercial e gera mo de obra
constante, seja nas lavouras, ou no processo de cura das cpsulas.
Para se obter boas produes, torna-se necessrio realizar a polinizao manual,

devido taxa de polinizao natural ser de apenas 1%. As flores polinizadas
resultam em frutos do tipo cpsulas que, ao serem submetidos a um longo processo
de cura, produzem uma mistura de substncias aromticas, cujo principal
componente a vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldedo).
O Brasil possui condies edafoclimticas ideais para a produo de baunilha, mas

esse potencial ainda pouco explorado. Entre os anos de 1937 e 1941, algumas
exportaes brasileiras de baunilha foram realizadas para os Estados Unidos.
Infelizmente, hoje, nosso pas um importador dessa especiaria. A Mesorregio Sul
do Estado da Bahia, j estabalecida como rea de produo de diversas
especiarias, onde a cultura da baunilheira est sendo desenvolvida e fornecendo
ao mercado nacional cpsulas de excelente qualidade, tanto no que se refere ao
padro da cpsula como no aroma.
Tradicionalmente, a baunilheira propagada pelo mtodo da estaquia. Entretanto,

possvel produzir mudas por meio da micropropagao, utilizando-se pice
meristemtico ou gema axilar, e tambm pela via seminfera in vitro.
A micropropagao tem sido amplamente utilizada para a multiplicao rpida de

muitas espcies de plantas, bem como para estudos relacionados aos aspectos
fisiolgicos referentes ao desenvolvimento vegetal. uma alternativa que maximiza
2
a propagao de vrias espcies, tendo como vantagens a fixao de ganhos

genticos em populaes clonais e a obteno de grande nmero de plantas sadias
e de alta qualidade em pequeno espao fsico. A micropropagao a modalidade
dentro da cultura de tecidos que mais tem difundido e encontrado aplicaes
prticas comprovadas, que consiste em formar mudas com as mesmas
caractersticas da planta-matriz.
Em sistema convencional de micropropagao, as plantas so cultivadas in vitro em

condies de ambiente fechado, sem trocas gasosas, com alta umidade do ar, baixa
luminosidade e com a utilizao de acares no meio de cultura como fonte de
carbono e energia. Devido s condies de cultivo, as plantas apresentam
alteraes anatmicas e metablicas que as tornam organismos heterotrficos.
Essas alteraes impossibilitam que a maquinaria fotossinttica opere normalmente.
A micropropagao tradicional tem como premissa a presena de carboidrato no

meio de cultivo, uma vez que este composto eleva a produo de biomassa e pode
contribuir para aumentar o enraizamento de muitas espcies in vitro. Todavia,
quando a concentrao deste composto apresenta-se em excesso, ele pode
aumentar o grau de contaminao do meio de cultivo, promover alterao no estado
hdrico, inibir a sntese de clorofila, diminuir as atividades de algumas enzimas do
ciclo de Calvin e, desta maneira, comprometer significativamente a capacidade
fotoautotrfica dos explantes. Com base nessas informaes, o conhecimento da
concentrao adequada de sacarose no meio de cultivo fundamental para o
sucesso da micropropagao.
As condies especiais durante o cultivo in vitro ao promoverem um crescimento

rpido resultam na formao de plantas anormais. Essas plantas so
frequentemente caracterizadas pela pobre eficincia fotossinttica, mau
funcionamento dos estmatos e uma acentuada diminuio na cera epicuticular. O
cultivo de explantes em regime fotomixotrfico origina plantas com o contedo de
gua elevado, com grande risco de desidratao e morte durante a aclimatizao.
Neste contexto foram realizados dois experimentos com os objetivos de avaliar os

efeitos de diferentes concentraes de sacarose no crescimento in vitro de mudas
3
de Vanilla planifolia, e analisar as variveis morfolgicas de mudas de V. planifolia

cultivadas em diferentes recipientes e diferentes substratos.
4
CAPTULO I
REVISO DE LITERATURA
5
1 REVISO DE LITERATURA
1.1 Consideraes gerais (Vanilla planifolia)
A baunilha considerada como uma das principais especiarias. Seu sabor e aroma
remonta h sculos na histria da humanidade. Nas Amricas, os Astecas e os
Maias, utilizavam cpsulas da planta para aromatizar suas bebidas e tinham tambm
variado emprego na culinria, no preparo de certas iguarias, assim como na
elaborao dos primitivos cosmticos que as mulheres usavam, principalmente, em
ocasies de festas e de certos rituais religiosos. Com o domnio espanhol sobre
esses povos, cpsulas foram introduzidas na Europa, sendo muito utilizadas,
principalmente no preparo de doces finos e chocolates (FIGUEIREDO, 1957).
Os antecedentes histricos da baunilheira esto ligados a quatro etapas distintas,

que so: I - o descobrimento de sua utilizao pelos espanhis; II - a introduo da
planta na Europa; III - a descoberta da polinizao artificial; IV - e como
consequncia, a introduo da cultura em larga escala nas antigas possesses
europeias, na frica e Oceania (CHILDERS; CIBES, 1948; CORRELL, 1953;
BOURIQUET, 1954). A descoberta da polinizao manual e a facilidade da
multiplicao vegetativa levaram a Inglaterra, a Blgica e a Frana a incrementar a
cultura em suas possesses, como Bourbon (1822), Java (1819), Mauritius (1880),
Seychelles (1890), Ilhas Comores (1893) e outras da Costa Sudeste Africana
(BICALHO, 1969).
A primeira polinizao artificial registrada da baunilheira foi realizada em 1836 no

Jardim Botnico de Lige, pelo naturalista belga Charles Morren, por meio de uma
tcnica bastante complexa e de difcil aplicao em cultivos de grande escala. Foi
em 1841 que um jovem escravo de Reunio (Ilha), com doze anos de idade,
Edmond Albius, criou uma tcnica de polinizao manual (CHILDERS; CIBES;
HERNNDEZ-MEDINA, 1959; BICALHO, 1969), que utilizada at hoje.
Existem 110 espcies do gnero Vanilla distribudas em reas tropicais e

subtropicais da Amrica do Norte, Amrica Central, Amrica do Sul (algumas so
6
nativas do Brasil), frica e sia, sendo que as mais usadas para fins comerciais so
V. planifolia, V. pompona e V. tahitensis (CAMERON, 2011). Nos Estados Unidos
somente as espcies V. planifolia e V. tahitensis so permitidas para uso em
produtos alimentcios (BELANGER; HARVKIN-FRENKEL, 2011).
De acordo com a ASERCA (Apoyos y Servicios a la Comercializacin Agropecuria)

(2002), no mbito mundial, existe uma ampla variedade de Vanilla planifolia
cultivada em diversos pases. Todavia, do ponto de vista comercial, apenas trs so
consideradas importantes:
Bourbon-Madagascar: proveniente de Madagascar, na Costa Sudeste da frica,

a mais rica em acar, assim como a mais delgada das trs, sendo a mais produzida
no mundo, com 75% do total.
Mexicana: a grande maioria da produo desta variedade proveniente da regio

de Veracruz, no Mxico. Possui sabor mais suave e a sua disponibilidade no
mercado menor que a de Bourbon-Madagascar. Isso se deve ao fato de o cultivo
realizar-se em reas onde existem outros produtos, como plantaes de laranjeiras.
Thaitiana: esta variedade alcana um dimetro maior que a primeira, sendo a mais
escura das trs. Seu aroma intenso, porm, o sabor menos acentuado que das
outras duas. Seu odor no evapora muito facilmente, por isso muito utilizada para
aromatizar produtos alimentcios.
A baunilha destinada ao comrcio obtida basicamente a partir dos frutos curados e

desidratados de Vanilla planifolia e, em menor quantidade tambm V. tahitensis e V.
pompona. Outras 35 espcies de baunilhas americanas produzem frutos aromticos
(SOTO ARENAS, 2003). do interior do fruto da baunilheira que saem as
minsculas sementes que exalam um cheiro perfumado, doce e delicado. A
substncia qumica que exala o aroma a vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldedo),
(Figura 1), sendo que cpsulas em timas condies podem render de 2 a 2,5% de
vanilina (RANADIVE, 2011). Esse componente qumico foi isolado pela primeira vez
por Gobley em 1858 (HOFFMAN; ZAPF, 2011). Klimes e Lamparsky (1976)
identificaram, por meio de cromatogrfica, 196 constituintes qumicos na baunilha,
entre eles, hidrocarbonetos, alcois, aldedos, cetonas, steres, compostos alifticos
7
e aromticos, terpenos e fenis. Essa mistura de substncias aromticas que torna

to diferente a vanilina natural da vanilina artificial. Segundo Soto Arenas, 2006,
aparentemente, as baunilhas produzem frutos aromticos para atrair seus
dispersadores, os morcegos frugvoros.
Figura 1 - Estrutura qumica da vanilina.
A baunilha usada largamente na aromatizao de sorvetes, chocolate, bebidas e

produtos de confeitaria, alm de ser tambm utilizada em perfumaria e, em pequena
escala, como planta medicinal. Ela interfere de forma benfica no sabor final da
comida, alm de permitir a conservao dos alimentos (FIGUEIREDO, 1957), devido
as suas propriedades antimicrobianas e antioxidantes (PELCZAR; CHAN; KRIEG,
1997). Pesquisas realizadas por Menella e Beanchamp (1996) comprovam que
bebs passam mais tempo anexados ao mamilo e succinam mais leite, 25 e 20%,
respectivamente, durante as trs horas que se seguem a ingesto de sabor baunilha
pela me em comparao ao consumo do diluente sozinho.
A essncia de baunilha extrada dos frutos de algumas espcies do gnero Vanilla,

isto , so orqudeas que possuem interesse comercial fora do contexto ornamental
(HOFFMAN; ZAPF, 2011). Seu aroma um dos mais conhecidos e comercializados
do mundo (KAHANE et al., 2008). Depois do aafro, a baunilha a segunda
especiaria mais cara do mercado mundial, devido sua produo ser muito trabalhosa
(ASERCA, 2002; PARTHASARATHY; CHEMPAKAM; ZACHARIAH, 2008).
1.2 Descrio botnica da Vanilla planifolia
A baunilheira pertence ao Reino Plantae, Filo Magnoliophyta, Classe Liliopsida

(Monocotiledonae), Subclasse Liliidae, Ordem Orchidales, Famlia Orchidaceae,
8
Subfamlia Vanilloideae, Tribo Vanilleae, Subtribo Vanillineae, Gnero Vanilla e

Espcie Vanilla planifolia (BORY et al., 2008; CAMERON, 2011).
As espcies do gnero Vanilla so terrestres, epfitas ou hemiepfitas e trepadeiras

perenes. (KAHANE et al., 2008). Vanilla planifolia G. Jackes ex ANDREWS uma
planta herbcea, hemiepfita secundria, perene, de crescimento monopodial.
Possui sistema radicular terrestre, caule glabro, com at 2 cm de dimetro, podendo
atingir at 20 m de comprimento, entrens de aproximadamente 15 cm, e com uma
a duas razes adventcias em cada n; folhas curto-pecioladas ou ssseis, oblongo-
lanceoladas, longo-acuminadas, carnosas, coriceas, podendo atingir at 22 cm de
comprimento e 6 cm de largura. As flores so verde-amareladas, com trs spalas e
trs ptalas oblongo-lanceoladas e labelo de mais ou menos 5 cm, amarelado com
estrias alaranjadas, dispostas em racimos. Uma ptala, chamada de labelo,
moldada como uma corneta e ligada coluna ou gynandrium (estrutura em que os
estames esto ligados ao pistilo), tendo um estigma e um estame com dois sacos de
plen. Tal conformao requer insetos especficos como polinizadores, como
abelhas dos gneros Euglossa e Eulaema nativas da Amrica.
Aps a polinizao, o ovrio se desenvolve em uma fruta, botanicamente chamada

cpsula, e popularmente de feijo ou vagem, que contm milhares de sementes. O
fruto linear, aromtico, do mesmo comprimento das folhas e com 6 a 8 mm de
largura, com formato cilndrico e curvado nas extremidades. Estando maduros, os
frutos so cpsulas siliquiformes, de cor pardo-escura ou quase preta, polposas e
midas ao tato, contendo milhares de sementes pequeninas e pretas (HOENNE,
1945; CHILDERS; CIBES; HERNANDZ-MEDINA, 1959; CORRA, 1984; SOTO
ARENAS, 2003).
A baunilheira apresenta hbito de crescimento monopodial, caracterizado por

ausncia de ramificaes laterais ao longo do caule (CRIBB, 2001). Essa
caracterstica resultante da dominncia apical exercida pelo pice sobre as gemas
laterais (TAIZ; ZEIGER, 2009). Em seus experimentos iniciais, Arteca (1995)
mostrou que, quando a gema apical era removida, ocorria o desenvolvimento da
gema lateral. Entretanto, posteriormente, essa gema lateral tornava-se novamente
dominante inibindo o crescimento das gemas laterais subsequentes.
9
1.3 Cultivo de Vanilla planifolia
A baunilheira uma planta de clima tropical, vegetando bem em regies que

apresentam temperatura mdia superior a 21C e precipitao anual de 1.500-
2.500 mm. Um perodo seco de aproximadamente dois meses fundamental para
induzir um bom florescimento, que se inicia no terceiro ano aps o plantio e a
mxima produo de flores alcanada aos 7-8 anos (CEPLAC, 2013). Suas razes
areas ajudam na escalada dos troncos das rvores, onde se fixam, e contribuem
para absorver a gua (KAHANE et al., 2008).
Para o seu pleno desenvolvimento, a baunilheira necessita de sombreamento que

permita a entrada de 50% da luz solar (HERNNDEZ-HERNNDEZ, 2011). As
temperaturas mais elevadas, que podem ser alcanadas quando o sombreamento
no suficiente, so fatais para a planta. Sombra em excesso estimula o
crescimento vegetativo em detrimento da florao. Entretanto, radiao solar direta
induz a queima das folhas e caules (KAHANE et al., 2008).
Todo cultivo de baunilha no mundo localiza-se em regies situadas, no mximo, a

25 ao Norte e ao Sul da linha do Equador, regies essas de clima tropical. Grande
parte do Brasil encontra-se dentro desses limites (BICALHO, 1969).
A baunilha suporta a maioria dos tipos de solos, mas altamente dependente da

associao com fungos simbiontes do gnero Rhizoctonia, presentes nas camadas
superficiais do solo e na matria orgnica (KAHENE et al., 2008; McCORMICK et al.,
2012).
O cultivo da baunilha deve ser conduzido na sombra das copas de rvores

pereniflias, que podero servir tambm como tutores. Ressalta-se que a escolha de
tutores vivos deve ser bastante cuidadosa. Recomenda-se no utilizar rvores de
folhas e casca caducas, uma vez que o excesso de raios solares faz a planta entrar
em declnio vegetativo (FIGUEIREDO, 1957).
Bicalho (1969) sugere o uso de suportes vivos (rvores e arbustos) que possuam as
seguintes caractersticas: I - sistema radicular amplo e abundante; II - resistncia a
insetos-praga e doenas; III - no exigir muitos cuidados de poda; IV - no ser de
10
altura muito elevada; V - ser suficientemente forte para aguentar o desenvolvimento

da planta trepadeira; VI - ter folhagem ampla e bem distribuda, permitindo uma
insolao em torno de 50%; VII - ter um desenvolvimento rpido e no perder todas
as folhas em poca de seca; e VIII - no ser frutfera, ou permitir qualquer atividade
comercial, a no ser aquela de sustentao da baunilheira. Para o Brasil, ele prope
espcies nativas do gnero Erythrina.
A baunilheira tambm cultivada sob sombra artificial em pases como a Costa Rica
e o Mxico. Para tal, utiliza-se tela de sombreameno que permite a passagem de
50% de luz solar.
As flores da baunilheira so autofrteis. No entanto, a localizao do rostelo sobre o

estigma um entrave polinizao natural. Devido a isso, na produo comercial, a
polinizao feita manualmente, sendo executada com o auxlio de pequenos
palitos ou dedais de madeira prprios para esta operao, com os quais se liberta o
rostelo e se pressiona a antera contra o estigma. Deve ser realizada nas primeiras
horas da manh, assim que a flor estiver completamente aberta (FIGUEIREDO,
1957).
No Brasil, especialmente no sul da Bahia, a florao ocorre durante os meses de

setembro e outubro. Geralmente, em plantas vigorosas, so polinizadas de 8 a 10
flores em cada inflorescncia e 10 a 20 inflorescncias em cada planta. O
rendimento mdio dessa prtica varia de 800 a 900 polinizaes dirias (CEPLAC,
2013). Um ms e meio aps a polinizao, a cpsula da baunilheira atinge o
comprimento mximo; um total de 8 a 9 meses necessrio para alcanar a
maturidade. A mudana de cor do verde para o amarelo um sinal visual para
processar as cpsulas, ainda inodoras (KAHANE, 2008).
1.4 Propagao da Vanilla planifolia
Tradicionalmente, a baunilha propagada pelo mtodo da estaquia, a partir de

estacas caulinares. As estacas devem ser retiradas de plantas altamente produtivas
e vigorosas. Normalmente, as estacas possuem de 6 a 8 ns, 20 a 80 cm de
comprimento e 1 cm de dimetro (KAHANE et al., 2008; HERNNDEZ-
HERNNDEZ, 2011). No entanto, este mtodo de propagao no econmico
11
(devido ao corte de ramos produtivos da planta) e tambm tem a desvantagem de

ser lento (KALIMUTHU; SENTHILKUMAR; MURUGALATHA, 2006).
A germinao in vitro vem sendo utilizada com sucesso desde 1922, quando o
pesquisador Lewis Knudson obteve a germinao assimbitica de sementes de
orqudeas (FARIA; STANCATO, 1998). A germinao das sementes da baunilheira,
assim como da grande maioria das orquidceas, extremamente baixa ou quase
nula, em condies naturais. No obstante, podem ser obtidos altos ndices de
germinao quando se utiliza o cultivo in vitro, adaptando-se o meio de cultura para
a espcie que se deseja propagar. At 1937, quando Bouriquet e Boiteau
apresentaram um documento produzido por eles sobre a germinao assimbitica
de sementes de Vanilla planifolia, as sementes desta planta eram consideradas
inviveis (LUGO, 1955).
As tcnicas de cultura de tecidos, entre elas a micropropagao, representam uma

alternativa para contornar obstculos que limitam a propagao convencional de
algumas espcies (TORRES; CALDAS; BUSO, 1998). A micropropagao tem sido
amplamente utilizada para a multiplicao rpida de muitas espcies de plantas
(KAUR; ANAD; GOYAL, 2011), bem como para estudos relacionados aos aspectos
fisiolgicos relacionados ao desenvolvimento vegetal (SUZUKI et al., 2010). Na
Costa Rica h trs laboratrios privados que produzem mudas por meio de cultura
de tecidos. As mudas so doadas para o agricultor quando atingem 3 cm de
comprimento. Antes do plantio, as mudas so previamente aclimatizadas em uma
rea separada provida com 80% de sombra at que se tornem fortes o suficiente
para suportar chuva, sol, pragas e doenas (QUIRS, 2011).
1.5 Importncia econmica
De acordo com o banco de dados da Organizao das Naes Unidas para a

Alimentao e Agricultura (FAO), a rea global destinada ao cultivo de baunilheira,
em 2011, foi de 78.124 ha. Os principais pases produtores, conforme tabela 1 e
figura 2, em ordem de importncia so: Indonsia, Madagascar, China, Mxico e
Tonga, que em conjunto produzem aproximadamente 95% da baunilha do mundo
(FAO, 2013).
12
Tabela 1 Produo mundial de baunilha (ton)
PAS 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

Indonsia 3.600 3.700 3.894 4.146 3.341 2.600 3.500
Madagascar 2.613 2.534 2.800 3.055 2.800 2.900 3.000
China 1.000 1.200 1.350 1.400 1.658 1.300 1.385
Mxico 280 291 637 600 524 395 362
Tonga 133 140 150 199 263 202 202
Outros 362 411 444 403 486 487 262
Mundial 7.988 8.276 9.275 9.803 9.072 7.884 8.913
Fonte: FAO (2013).
A produo de baunilha da Indonsia representa quase 40% da produo mundial,

com mdia anual de 3.540 toneladas. Um elemento importante que justifica essa
produo a produtividade do cultivo, que bem superior em comparao
produtividade observada em Madagascar, que possui uma rea de cultivo trs vezes
superior da Indonsia.
Tonga Outros
Mxico 2,26% 5,21%
4,06%
China
15,54% Indonsia
39,27%
Madagascar
33,66%
Figura 2 Distribuio da produo mundial de baunilha (FAO, 2013).
Com relao s exportaes mundiais de baunilha, no ano de 2009, os principais

fornecedores foram Indonsia e Madagascar, seguidos por grandes importadores
como a Alemanha e Estados Unidos (FAO, 2013).
13
Segundo a ASERCA (2002), os principais consumidores de baunilha no so os

grandes produtores dessa especiaria e sim os pases industrializados com grandes
empresas dedicadas fabricao de produtos de confeitaria, bebidas e perfumes.
o caso de alguns pases da Europa, sia e Amrica do Norte.
Segundo dados da FAO (2013), no ano de 2011, Estados Unidos, Frana, Reino
Unido, Alemanha e Canad foram responsveis por quase 65% das importaes
mundiais de baunilha, conforme ilustra a figura 3.
Outros Estados Unidos

26,5% 24,65%
Azerbajo
2,45% Frana
Holanda 16,79%
2,82% Reino
Alemanha Unido
Blgica 7,83%
3,53% 10,36%
Canad
5,07%
Figura 3 Distribuio das importaes de baunilha (FAO, 2013).
A produo de baunilha no Brasil muito reduzida, tanto que no consta nas

estatsticas oficiais. As necessidades do pas de baunilha natural so supridas via
importao, cujo valor e quantidade retratam o mercado potencial que poderia ser
desenvolvido pela agricultura familiar na regio Amaznica e nas reas
remanescentes da Mata Atlntica (HOMMA; MENEZES; MATOS, 2006). Segundo
dados do MDIC (Ministrio do Desenvolvimento, Indstria e Comrcio Exterior),
entre os anos de 2007 e 2011, o Brasil importou 13.624 kg de cpsulas de baunilha,
em valor equivalente a US$403,884.00 (Aliceweb, 2013).
Apesar de possuir grande potencial e condies edafoclimticas favorveis para

produzir e exportar baunilha em larga escala, o Brasil figurava em 2008 como
14
importador da ordem de US$194,974.00, correspondentes a 7.973 kg, segundo

dados do Ministrio do Desenvolvimento, Indstria e Comrcio Exterior (Aliceweb,
2013).
Segundo Bicalho (1969), o Brasil fez algumas exportaes de baunilha para os

Estados Unidos, em quantidades muito pequenas, em 1937, 1940, 1941 e 1942,
sendo que o maior valor foi em 1941, de 9.652 libras, aproximadamente 4,3
toneladas. Ainda, de acordo com o autor, no foi possvel recolher dados a respeito
de produtores e localidades de cultivo.
A Mesorregio Sul do Estado da Bahia, j estabalecida como rea de produo de

diversas especiarias, onde a cultura da baunilheira vem se desenvolvendo e
fornecendo ao mercado nacional cpsulas de excelente qualidade, tanto no que se
refere ao padro do fruto como do aroma.
1.6 Condies do ambiente de cultivo in vitro
A micropropagao um mtodo de propagao vegetativa amplamente estudada

nas mais diversas espcies vegetais, sendo a modalidade dentro da cultura de
tecidos que mais tem difundido e encontrado aplicaes prticas comprovadas, que
consiste em formar mudas com as mesmas caractersticas da planta-matriz entre as
quais se destacam: obteno de mudas sadias, mesmo se provenientes de matrizes
infectadas, por meio de tecidos meristemticos; obteno de vrias plantas a partir
de um explante inicial, independentemente da estao do ano; a reduo do tempo
e da rea necessria propagao da espcie; maior vigor das mudas;
multiplicao de plantas difceis de serem propagadas por mtodos convencionais; e
auxlio em programas de melhoramento vegetal (KOZAI; KUBOTA; JEONG, 1997;
GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998; ERIG; SCHUCH, 2005).
Os explantes, na micropropagao convencional, so cultivados em frascos com alta

umidade relativa do ar (acima de 70%), acmulo de etileno, baixa disponibilidade de
gs carbnico (que decresce de 3.000 a 9.000 ppm no perodo escuro, para menos
de 100 ppm durante o fotoperodo), baixa densidade de fluxo de ftons
fotossinteticamente ativos, isto , baixa luminosidade (40 - 50 mol m-2s-1), e com
sacarose como maior fonte de energia metablica (ARIGITA; GONZLEZ; TAMS,
15
2002). A presena de sacarose nos meios de cultura de tecidos inibe

especificamente a sntese de clorofila, reduzindo a capacidade fotossinttica
potencial do explante, tornando o crescimento autotrfico menos provvel e o seu
excesso pode ser prejudicial ao crescimento das culturas in vitro (DESJARDINS;
HDIDER; De RIEK, 1995; KOZAI; NGUYEN, 2003; GEORGE; HALL; De KLERK,
2008). Os explantes cultivados neste ambiente podem desenvolver desordens
anatmicas, morfolgicas e fisiolgicas que faz com que a maquinaria fotossinttica
no opere normalmente (ARIGITA; GONZLEZ; TAMS, 2002; GEORGE; HALL; De
KLERK, 2008; RADOCHOV; TICH, 2009).
Plantas crescidas em ambientes considerados heterotrficos, normalmente,

apresentam parte area muito pequena, menor quantidade de cera cuticular e
epicuticular nas folhas, tecidos com reduzida resistncia mecnica (menos
colnquima e esclernquima), estmatos no funcionais, folhas finas e pequenas
com poucos tricomas e com baixa atividade fotoautotrfica (ZIV; SCHWARTZ;
FLEMINGER, 1987; POSPISILOV; SOLAROV; CATSKY, 1992; KITAYA et al.,
2005). Alm disso, pode ocorrer significativa perda de plantas causada pela
contaminao microbiana (KOZAI; KUBOTA, 2001), potencializada pela presena da
sacarose no meio de cultura. Segundo Kubota e Kozai (1992), mudas formadas no
sistema heterotrfico possuem elevado contedo de gua com grande risco de
desidratao e morte durante a aclimatizao.
O sucesso da tcnica de propagao in vitro requer que as plantas que se

desenvolvem heterotroficamente, sob condies de alta umidade, posteriormente se
adaptem, venham a ser autotrficas e cresam sob condies de moderada
umidade (ZIMMERMAN, 1988). A transferncia da condio in vitro para o ambiente
ex vitro a etapa mais crtica da micropropagao, podendo ser um fator limitante
para a produo de mudas de algumas espcies, pois as plantas so expostas a
mudanas sbitas nas condies ambientais, sendo a perda de gua o principal
problema (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
16
1.6.1 Carboidratos
Na micropropagao convencional, as mudas se desenvolvem como organismos

heterotrficos, utilizando a sacarose no meio de cultura como principal fonte de
carboidrato, uma vez que esse composto eleva a produo de biomassa in vitro
(KITAYA; SAKAMI; KOZAI, 1995; KOZAI, 1991). Os carboidratos fornecem energia
metablica e esqueletos carbnicos para a biossntese dos compostos orgnicos
necessrios para o crescimento das clulas, alm de atuarem como um componente
osmtico do meio de cultura (TORRES; CALDAS; BUSO, 1998).
Segundo Kozai (1991), a alta concentrao de sacarose no meio de cultura pode

promover alterao no status hdrico, inibir a sntese de clorofila, diminuir as
atividades de algumas enzimas do ciclo de Calvin e, consequentemente,
comprometer significativamente a capacidade fotoautotrfica dos explantes. De
acordo com George, Hall, De Klerk (2008), a quantidade elevada de carboidrato
adicionada ao meio de cultura pode elevar a presso osmtica do meio e, assim,
reduzir o crescimento das plantas, por meio de reduo na absoro de gua e de
nutrientes devido alterao de potencial hdrico entre o meio de cultivo e a planta,
desfavorecendo a absoro desses.
Langford e Wainright (1987) sugeriram que as alteraes anatmicas e fisiolgicas

que podem surgir nos explantes cultivados sob regime heterotrfico no possibilitam
que o aparato fotossinttico opere normalmente, porque a utilizao do dixido de
carbono reprimida pela presena de sacarose exgena. Grout e Donkin (1987) e
Hdider e Desjardins (1994), complementam afirmando que esta represso ocorre
devido ao acmulo de amido e inibio da enzima Rubisco. Os autores
esclarecem, porm, que em plantas cultivadas in vitro sob altas concentraes de
sacarose, a sntese reduzida dos acares favorece o acmulo de carboidratos no
tecido, o que reduz as taxas fotossintticas.
O amido o principal carboidrato de reservas nas plantas e se acumula em

diferentes tecidos fotossintticos ou no fotossintticos, sendo depositado
transitoriamente nos cloroplastos na forma de grnulos insolveis (ORZECHOWSKI,
2008; TAIZ; ZEIGER, 2009). Nos cloroplastos, o amido produzido durante o
17
perodo fotossinttico, sendo rapidamente metabolizado durante o perodo noturno

(WEISE; VAN WIJK; SHARKEY, 2011).
A micropropagao sem acar (fotoautotrfica), em relao aos sistemas de

micropropagao convencionais (heterotrficas ou fotomixotroficas), apresenta as
seguintes vantagens: o crescimento e o desenvolvimento de plantas in vitro so
mais rpidos e mais uniformes, as plantas in vitro tm menos distrbios morfolgicos
e fisiolgicos, a contaminao biolgica in vitro menor, as plntulas tm uma maior
percentagem de sobrevivncia durante a aclimatizao ex vitro, a reduo do risco
de contaminao microbiana, a melhoria das caractersticas fisiolgicas da planta e
a reduo do estresse da planta durante a aclimatizao Assim, os custos de
produo poderiam ser reduzidos e a qualidade da planta poderia ser melhorada
significativamente com a micropropagao fotoautotrfica (KOZAI; KUBOTA;
JEONG, 1997; AFREEN; ZOBAYED; KOZAI, 2002; KHAN et al., 2002).
1.6.1.1 Destino dos carboidratos adicionados ao meio de cultura durante o

metabolismo de explantes de baunilheira
As plantas na micropropagao convencional se desenvolvem como organismos

heterotrficos, isto , realizam pouca ou nenhuma fotossntese, utilizando a
sacarose no meio de cultura como principal fonte de carboidrato (KOZAI, 1991;
KITAYA; SAKAMI; KOZAI, 1995). A presena de acares exgenos limita a
fotossntese e impede o correto desenvolvimento do aparato fotossinttico (HDIDER;
DESJARDINS, 1994). As fontes de carbono (glicose, sacarose ou frutose) so
adicionadas ao meio de cultura, devido deficincia de energia luminosa e a baixa
concentrao de CO2 presente em condies in vitro (TOMBOLATO; COSTA, 1998).
Em culturas in vitro as plantas so expostas a condies divergentes das do

ambiente natural (GASPAR et al., 2002). Uma das diferenas mais importantes
encontra-se na composio dos meios nutritivos. Os hidratos de carbono so
biomolculas essenciais necessrios para o crescimento e o desenvolvimento das
plantas in vitro (LESAK; PRZYWARA, 2003). Os carboidratos fornecem energia
metablica e esqueletos carbnicos para a biossntese de aminocidos e protenas,
polissacardeos estruturais, como celulose, ou seja, todos os compostos orgnicos
18
para o crescimento das clulas, servem tambm como molculas de sinalizao

durante o desenvolvimento e influenciam os processos fisiolgicos e expresso
gnica (TORRES; CALDAS; BUSO, 1998).
Devido reduzida ou nula capacidade fotossinttica dos explantes cultivados in

vitro, os hidratos de carbono so a fonte de energia dos tecidos e funcionam ainda
como um regulador do potencial osmtico do meio de cultura. A sacarose
funcionando como um agente osmtico permite uma reduo gradual da presso
osmtica do meio nutritivo medida que os acares so consumidos (VASIL;
VASIL, 1980; GEORGE; HALL; De KLERK, 2008).
A sacarose o acar mais comum translocado em plantas e, muitas vezes,

representa mais de 95% da massa da matria seca de materiais translocados
(ZIMMERMANN; ZIEGLER, 1975). Nos meios nutritivos tambm o acar mais
utilizado, sendo que esse carboidrato suporta as mais altas taxas de crescimento na
maioria das espcies. A sacarose o carboidrato mais comum utilizado na cultura
de tecidos vegetais (TORRES; CALDAS; BUSO, 1998; GEORGE; HALL; De CLERK,
2008).
Segundo Vu, Niedz e Yelenosky (1995) e Sung et al. (1988), existem duas vias para
a clivagem enzimtica da sacarose. A primeira a chamada via clssica, em que a
reao da invertase produz glicose e frutose, com a perda da energia glicosdica.
Esses produtos so fosforilados por glucoquinase e frutoquinase antes da
metabolizao subsequente (HUBER; AKAZAWA, 1986); a segunda a chamada
via alternativa, em que a sacarose sintase cliva a sacarose em frutose e UDP-
glicose, por conseguinte, conservando a energia glicosdica. A UDP-glicose gerada
fornece glicose-1-fosfato diretamente na gliclise por meio da reao catalisada por
UDP-glicose pirofosforilase (SUNG et al., 1988).
Outro passo importante no metabolismo da sacarose definido como a

interconverso de frutose-6-fosfato formando a frutose 1,6-bisfosfato. Nesse caso,
duas vias alternativas tambm so conhecidas. Uma alternativa catalisada por
uma enzima irreversvel, a nucleotdeo-trifosfato, dependente da fosfofrutoquinase
(PFK) que descrito como uma reao de manuteno. A segunda catalisada por
19
uma enzima dependente de pirofosfato (PPi), a fosfofrutoquinase (PFK),

prontamente reversvel, que descrita como uma via adaptativa, na qual uma
reao de equilbrio conserva energia atravs da utilizao e sntese de pirofosfato
(BLACK et al., 1987). Logo, quando se trabalha em PFK a direo gliconeognica
poderia produzir PPi para dirigir a quebra de sacarose por meio da UDP-glicose
pirofosforilase (XU; SUNG; BLACK, 1989).
Ao estudarem a utilizao de carboidratos para culturas de clulas em suspenso de

Phaseolus vulgaris, Botha e OKennedy (1998) verificaram que a absoro de
acar pelas clulas em suspenso, a partir de meio suplementado com sacarose,
acontece predominantemente na forma de hexose. Esses autores concluram que a
glicose preferencialmente absorvida, levando a uma acumulao de frutose no
meio. No entanto, quando a glicose se esgota as clulas utilizam a frutose, a uma
taxa semelhante da glicose.
Quando a glicose ou a frutose fornecida individualmente a culturas de clulas,

ambas so utilizadas de forma muito eficiente, com um crescimento ligeiramente
melhor com o meio contendo frutose. Absoro de hexose em grande parte um
processo ativo, mesmo nas concentraes mais elevadas. O sistema de captao
de hexose das clulas tem uma maior afinidade para a glicose (Km = 240 M) do
que para a frutose (Km = 960 M), mas a absoro mxima (Vmax) semelhante.
As diferenas nas propriedades cinticas do sistema de captao para as duas
hexoses podem largamente explicar o padro observado de utilizao de hexose
quando a glicose e a frutose esto presentes no meio (BOTHA; OKENNEDY, 1998).
De Riek, Piqueras e Debergh (1997), ao investigarem a absoro e o metabolismo

da sacarose em rosas micropropagadas, utilizando a tcnica de camada dupla,
observaram que na multiplicao, bem como na fase de induo de razes, ocorreu
a hidrlise da sacarose no meio de cultura. Um modelo matemtico foi desenvolvido
para quantificar a hidrlise de sacarose e a absoro de glicose, sacarose e frutose,
com base na srie de tempo para os diferentes acares no meio de cultura. Um
gradiente decrescente de enzimas metabolizadoras de sacarose, a partir das razes
para com as folhas, deu uma boa indicao de como os diferentes tecidos
dependem da sacarose absorvida a partir do meio.
20
1.6.2 pH
Para um crescimento adequado da maioria das espcies, o melhor valor de pH deve

estar entre 5 e 6,5 e valores inferiores a 4,5 e superiores a 7 pode ocorrer
paralisao do crescimento e do desenvolvimento in vitro (MURASHIGE, 1974;
PIERIK, 1987). O pH considerado um fator crtico do meio de cultura
(MURASHIGE, 1974).
O pH do meio de cultura deve ser tal que no danifique o explante. Dentro dos
limites aceitveis, o pH determina se os sais permanecero na forma solvel,
influencia a absoro de reguladores de crescimento de plantas, tem efeito sobre as
reaes qumicas, especialmente aquelas catalizadas por enzimas, e afeta a
eficincia da geleificao do gar (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998; GEORGE;
HALL; De KLERK, 2008).
O pH do meio tem um efeito sobre a disponibilidade de muitos minerais

(SCHOLTEN; PIERIK, 1998). Em geral, a absoro de nions favorecida por um
pH cido, enquanto ctions melhor absorvido quando o pH tende neutralidade.
Devido absoro diferencial de nions e ctions pelos tecidos vegetais, o pH do
meio de cultura costuma no permanecer constante, mas mesmo com as mudanas,
ons e compostos so absorvidos pela planta. (GEORGE; HALL; De KLERK, 2008).
Durante o crescimento das clulas, o pH do meio se altera medida que diferentes

ons so absorvidos pelas clulas e os produtos metablicos so excretados para o
meio (CALDAS; HARIDASAN; FERREIRA, 1998).
1.6.3 Fluorescncia da clorofila a
As clorofilas localizam-se nos cloroplastos, sendo este o stio da fotossntese, onde

ocorrem duas reaes importantes: a fotoqumica, nas membranas dos tilacides, e
a bioqumica, no estroma do cloroplasto. Alm das clorofilas, tais organelas contm
outros pigmentos chamados acessrios, como os carotenides (carotenos e
xantofilas). Os pigmentos envolvidos na fotossntese so as clorofilas a e b, os
carotenides e as ficobilinas (STREIT, 2005).
21
As plantas desenvolveram mecanismos para suportar o excesso de energia no

aparato fotossinttico, com os quais pode dissipar a energia como calor (dissipao
no fotoqumica), ou reemiti-la como luz, mediante um processo conhecido como
fluorescncia da clorofila (MAXWELL; JOHNSON, 2000). Vrios estudos foram
realizados sobre a base terica e as aplicaes na ecofisiologia relacionados
fluorescncia (MOHAMMED; BINDER; GILLIES, 1995). Segundo Krause e Weis
(1991), a mensurao da fluorescncia pode ser considerada como uma medida de
complemento s medies do processo fotossinttico.
A fluorescncia emitida pela molcula de clorofila permite uma avaliao no

destrutiva da fotossntese in vivo, fornecendo dados sobre o rendimento e a
capacidade fotossinttica, por meio da quantificao da eficincia fotoqumica do
fotossistema II, da eficincia do transporte de eltrons (GENTY; BRIANTAIS;
BAKER, 1989), e dos coeficientes de extino fotoqumica (qP) e no fotoqumica
(NPQ) (BILGER; SCHREIBER, 1986), alm de ser utilizada como um indicador da
fotoinibio (BJRKMAN; DEMMIG, 1987). As variaes no contedo total de
clorofila e carotenides so bons indicadores do estresse em plantas (HENDRY;
PRICE, 1993).
1.7 Substrato
Durante a fase de aclimatizao e crescimento das mudas, necessrio o uso de

um meio de sustentao e fornecedor de nutrientes: o substrato. Ele pode facilitar ou
impedir o crescimento das plantas conforme suas propriedades fsico-qumicas. A
escolha e o manejo correto do substrato iro afetar a sobrevivncia, o crescimento e
o desenvolvimento das plantas, sendo de suma importncia o uso de um bom
substrato para a obteno final de mudas de qualidade (ALDRUFEU, 1987;
BACKES; KMPF, 1991).
Vrios so os trabalhos realizados com o objetivo de avaliar qual o melhor substrato

no processo de aclimatizao de plantas provenientes de micropropagao. Na
verdade o que se busca dar resposta s exigncias nutricionais e ambientais para
que essas plantas possam sobreviver e com consequente estabelecimento no
22
campo. Muitos desses trabalhos conjugam substrato e o ambiente de aclimatizao,

como por exemplo, se sombreado ou no.
Skrebsky, Nicoloso e Maldaner (2006), ao selecionarem substratos para a

aclimatizao de plantas de Pfaffia glomerata produzidas in vitro sob diferentes
concentraes de sacarose concluram que as combinaes dos substratos
vermiculita e solo (1:1), e substrato comercial e solo (1:1), proporcionaram maior
crescimento s plantas durante a ltima fase de aclimatizao, em cultivo sob
sombrite. Segundo os autores, o uso isolado do substrato comercial aumentou a
sobrevivncia das plantas cultivadas em campo, devido esse substrato possuir os
maiores valores de capacidade de reteno de gua, de gua facilmente disponvel
e de gua disponvel.
Seidel Jnior e Venturieri (2011), ao identificarem substratos alternativos ao xaxim,

que poderiam ser usados para o estabelecimento ex vitro de plntulas de Cattleya
forbesii e Laelia purpurata, concluram que xaxim o melhor substrato para Cattleya
forbesii, mas que pode ser substitudo, contudo com pequena reduo no
desempenho dessa espcie, pelo substrato formado por cascalho e mistura de turfa.
O cascalho com mistura de turfa foi o melhor substrato para Laelia purpurata.
Daz et al. (2010) desenvolveram um protocolo eficiente para a aclimatizao de

mudas de Phalaenopsis e Cattleya (Orchidaceae) obtidas de protocormides
provenientes de estacas florais, cultivadas em meio MS modificado, e concluram
que os substratos que deram melhor resposta ao crescimento foram uma mistura de
musgo, aparas de madeira e perlita, para Phalaenopsis, e, mistura de musgo e
perlita, para Cattleya.
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33
CAPTULO II
SACAROSE NO CRESCIMENTO IN VITRO DE BAUNILHEIRA

(ORCHIDACEAE)
34
RESUMO
O conhecimento da concentrao adequada de sacarose no meio de cultivo

fundamental para o sucesso da micropropagao. Nesse contexto, o objetivo deste
trabalho foi avaliar os efeitos de diferentes concentraes de sacarose no
crescimento in vitro de mudas de Vanilla planifolia provenientes de
micropropagao. Para isso, cinco concentraes de sacarose (0, 15, 30, 45 e
60 g L-1), com quatro repeties de dez mudas, foram utilizadas em delineamento
inteiramente casualizado. A unidade experimental foi constituda de um frasco com
capacidade de 500 ml, contendo 80 ml de meio MS completo. Variveis
morfolgicas, fluorescncia da clorofila a, teor de amido, taxa de perda de gua e o
pH do meio de cultura foram avaliados 60 dias aps a inoculao das mudas no
meio de cultura. Aps anlise de varincia, os dados foram analisados por meio da
anlise de regresso. As diferentes concentraes de sacarose no meio de cultura
influenciaram todas as caractersticas morfolgicas e parmetros fisiolgicos
estudados. A ausncia e a concentrao de 60 g L -1 de sacarose no meio so
prejudiciais ao crescimento das plantas. A ausncia de sacarose estimula o
comportamento autotrfico em mudas de baunilha. A maior mdia para eficincia
fotoqumica mxima do FSII ocorre na concentrao estimada de 19,72 g L-1 de
sacarose. Os dados relativos aos aspectos morfolgicos e fisiolgicos de mudas de
Vanilla planifolia provenientes de micropropagao sugerem a viabilidade tcnica
para a propagao em larga escala de mudas dessa espcie.
Palavras-chave: Vanilla planifolia. Cultivo in vitro. Carboidrato. Amido.

35
ABSTRACT
Knowledge of the appropriate concentration of sucrose in the culture medium is

critical to successful micropropagation. Therefore, this study aimed to evaluate the
effects of different concentrations of sucrose on in vitro growth of seedlings of Vanilla
planifolia derived from micropropagation. For such, five concentrations of sucrose (0,
15, 30, 45 and 60 g L-1) were used, with four replicates of ten seedlings, in a
completely randomized design. The experimental unit consisted of a bottle with a
capacity of 500 ml, containing 80 ml of complete medium MS. Morphological
variables, a chlorophyll fluorescence, content of starch, rate of water loss and the pH
of the culture medium were assessed 60 days after the inoculation of the seedlings in
the culture medium. After being submitted to the analysis of variance, the data were
analyzed by regression analysis. Different concentrations of sucrose in the culture
medium affected all the morphological traits and physiological parameters under
study. The absence and the concentration of 60 g L-1 of sucrose in the medium are
harmful to plant growth. The absence of sucrose favors the autotrophic behavior in
seedlings of vanilla. The highest mean for maximum photochemical efficiency of PSII
is found at the estimated concentration of 19.72 g L-1 of sucrose. The data related to
morphological and physiological aspects of seedlings of Vanilla planifolia derived
from micropropagation suggest that large-scale propagation of seedlings of this
species is technically feasible.
Keywords: Vanilla planifolia. In vitro cultivation. Carbohydrate. Starch.

36
2.1 INTRODUO
O mtodo de propagao mais utilizado para baunilheira a estaquia. Os

propgulos so estacas caulinares obtidas pelo seccionamento da haste da planta.
Todavia, esse mtodo de propagao no econmico e tambm tem a
desvantagem de ser moroso (KNORR et al., 1993; KALIMUTHU; SENTHILKUMAR;
MURUGALATHA, 2006).
A micropropagao tem sido amplamente utilizada para a multiplicao rpida de

muitas espcies de plantas (KAUR; ANAND; GOYAL, 2011), bem como para
estudos relacionados aos aspectos fisiolgicos relacionados ao desenvolvimento
vegetal (SUZUKI et al., 2010). uma alternativa que maximiza a propagao de
vrias espcies, tendo como vantagens a fixao de ganhos genticos em
populaes clonais e a obteno de grande nmero de plantas sadias e de alta
qualidade, em pequeno espao fsico (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
Na micropropagao convencional, as mudas se desenvolvem como organismos

heterotrficos, utilizando a sacarose no meio de cultura como principal fonte de
carboidrato, uma vez que esse composto eleva a produo de biomassa in vitro
(KITAYA; SAKAMI; KOZAI, 1995; KOZAI, 1991). Os carboidratos fornecem energia
metablica e esqueletos carbnicos para a biossntese dos compostos orgnicos
necessrios para o crescimento das clulas, alm de atuarem como um componente
osmtico do meio de cultura (TORRES; CALDAS; BUSO, 1998).
Plntulas cultivadas in vitro podem apresentar um metabolismo heterotrfico caso

essas cresam em condies especficas, como elevadas concentraes de
carboidratos, baixa irradincia, limitada troca de gases, alta umidade relativa do ar,
alta concentrao de etileno, baixa densidade de fluxo de ftons fotossinteticamente
ativos e baixa concentrao de CO2 (KUBOTA; KOZAI, 1992; MAJADA et al., 2000;
GEORGE; HALL; De KLERK, 2008). A presena de sacarose nos meios de cultura
de tecidos inibe especificamente a sntese de clorofila, reduzindo a capacidade
fotossinttica potencial do explante, tornando o crescimento autotrfico menos vivel
e o seu excesso pode ser prejudicial ao crescimento das culturas in vitro
(DESJARDINS; HDIDER; De RIEK, 1995; KOZAI; NGUYEN, 2003; GEORGE; HALL;
37
De KLERK, 2008). Os explantes cultivados em ambiente heterotrfico podem

desenvolver desordens anatmicas, morfolgicas e fisiolgicas que fazem com que
a maquinaria fotossinttica no opere normalmente (ARIGITA; GONZLEZ; TAMS,
2002; GEORGE; HALL; De KLERK, 2008; RADOCHOV; TICH, 2009).
Plantas crescidas em ambientes considerados heterotrficos, normalmente,

apresentam parte area muito pequena, menor quantidade de cera cuticular e
epicuticular nas folhas, tecidos com reduzida resistncia mecnica (menos
colnquima e esclernquima), estmatos no funcionais, folhas finas e pequenas
com poucos tricomas e com baixa atividade fotoautotrfica (ZIV; SCHWARTZ;
FLEMINGER, 1987; POSPISILOV; SOLAROV; CATSKY, 1992; KITAYA et al.,
2005). As plntulas formadas no sistema heterotrfico possuem elevado contedo
de gua com grande risco de desidratao e morte durante a aclimatizao
(KUBOTA; KOZAI, 1992). Alm disso, uma quantidade elevada de sacarose no meio
de cultura pode elevar a presso osmtica do meio e, assim, reduzir o crescimento
das plntulas, por meio de reduo na absoro de gua e de nutrientes devido
alterao de potencial hdrico entre o meio de cultivo e a plntula, desfavorecendo,
assim, a absoro desses (GEORGE; HALL; De KLERK, 2008).
Com base nessas informaes, torna-se necessrio utilizar no meio de cultivo uma
concentrao adequada de sacarose, evitando, assim, o comprometimento no
metabolismo fotossinttico do material micropropagado. O objetivo deste trabalho foi
avaliar os aspectos morfofisiolgicos do cultivo in vitro de mudas micropropagadas
de baunilheira, relacionados ao crescimento, fluorescncia, concentrao de amido
e taxa de perda de gua, em resposta a utilizao de diferentes concentraes de
sacarose no meio de cultivo.
2.2 MATERIAL E MTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratrio de Micropropagao de Plantas da

empresa Clonagri, localizada em Arthur Nogueira, So Paulo, em sala de
crescimento com temperatura variando entre 23 a 26C, umidade relativa em torno
38
de 50-60% e fotoperodo de 12 horas, sob lmpadas fluorescente tipo luz do dia e

intensidade luminosa de 50 mol m-2 s-1, e avaliado 60 dias aps a inoculao das
mudas nos meios de cultura. Foram utilizadas mudas de Vanilla planifolia G. Jacks
ex ANDREWS produzidas nesse mesmo laboratrio, provenientes da proliferao de
gemas axilares de planta adulta. A coleta dos dados foi realizada no Laboratrio de
Cultura de Tecidos do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do
Esprito Santo, em Alegre, Esprito Santo.
A metodologia utilizada para a produo de mudas provenientes da proliferao de

gemas axilares de planta adulta consistiu na retirada das gemas e posterior lavagem
em gua corrente, seguida de desinfestao com lcool 70% durante 3 minutos,
soluo comercial de hipoclorito a 0,6% com 5 gotas de Tween, para cada 100 mL
da soluo desinfestante por 25 minutos e 3 enxagues em gua destilada e estril.
Com auxlio de bisturi e lupa, as gemas foram isoladas nas dimenses de 0,2 a
0,5 mm de comprimento e 2,5 a 5,0 mm de dimetro, e procedeu-se a nova
desinfestao com soluo comercial de hipoclorito a 0,3% com 5 gotas de Tween,
por 10 minutos e 3 enxagues em gua destilada e estril. Terminada a
desinfestao, as gemas foram inoculadas em meio MS (MURASHIGE; SKOOG,
1962), suplementado com 30 g L-1 de sacarose, solidificado com 6 g L-1 de gar, pH
ajustado para 5,7 0,1 e esterilizado em autoclave com presso de 1,5 atm e
temperatura de 121C, por 20 minutos. No cultivo foram utilizados frascos de tampa
plstica transparente com capacidade de 100 ml, contendo 15 ml de meio de cultura.
Aps o estabelecimento da gema e o meio de cultura no apresentando

contaminao aparente, transferiu-se a gema para frasco com capacidade de 190 ml
contendo 30 ml de meio MS completo, com 2 g L-1 de carvo ativado. De cada gema
surgiu uma nica brotao, formando um nico ramo. Os ramos foram fracionados
em 1,5-2 cm e inoculados na posio deitada para multiplicao em frasco com
capacidade de 190 ml contendo 30 ml de meio MS completo, com 2 g L-1 de carvo
ativado.
Entre 4-6 semanas novos ramos foram formados a partir das gemas axilares. Seis
multiplicaes foram realizadas, a fim de se obter mudas em quantidade suficiente
para a montagem do experimento e para novos estudos. A temperatura da sala de
39
crescimento ficou entre 23 a 26C, com umidade relativa em torno de 50-60% e

fotoperodo de 12 horas, sob lmpadas fluorescente tipo luz do dia e intensidade
luminosa de 50 mol m-2 s-1. No foi utilizado nenhum tipo de fitorregulador em
nenhuma fase desde a inoculao das gemas at o final das multiplicaes. O
material vegetal utilizado para extrao das gemas consistiu de um nico ramo de
Vanilla planifolia de 2 m de comprimento, 1 cm de dimetro, e entrens de
aproximadamente 15 cm de comprimento, de cinco anos de idade, coletado em
Muqui, Esprito Santo.
O experimento foi constitudo de cinco tratamentos, com as variaes de 0, 15, 30,

45 e 60 g L-1 de sacarose e 100% de meio MS cada um. O delineamento
experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. Cada tratamento foi composto
por quatro frascos de tampa plstica transparente, com capacidade de 500 ml,
contendo 80 ml de meio MS, sendo que cada frasco continha dez mudas com
tamanho mdio de 1,5-2 cm de comprimento, oriundas do sexto subcultivo de mudas
provenientes de gemas axilares. Com auxlio de bisturi e pina, os explantes foram
obtidos aps separao das ponteiras de agrupamento de mudas. O pH do meio de
cultivo foi ajustado em 5,7 0,1. A figura 4 ilustra o crescimento de mudas de Vanilla
planifolia na concentrao de 30 g L-1.
Figura 4 Mudas de Vanilla planifolia provenientes de micropropagao, cultivadas em meio

MS completo na concentrao de 30 g L-1 de sacarose: (A) dia da inoculao; (B) aos 35
dias; e (C) aos 60 dias de subcultivo.
Os dados foram coletados da seguinte forma: sete mudas de cada frasco foram
utilizadas para as medidas morfolgicas, sendo que uma folha de cada planta foi
40
retirada para a medio da taxa de perda de gua. As outras trs mudas foram
utilizadas para as medidas dos parmetros fisiolgicos e teor de amido. Antes de se
iniciar a coleta dos dados, cada muda foi lavada com gua destilada para retirada do
meio de cultura ainda aderido s razes.
As variveis morfolgicas avaliadas foram: comprimento mdio da parte area

(CPA), nmero de folhas (NF), nmero de razes (NR), massa da matria fresca total
da planta (MFTP) e massa da matria seca total da planta (MSTP). Utilizou-se rgua
milimetrada para medio do comprimento de muda. Para determinao da massa
da matria fresca total foi utilizada balana analtica com quatro casas decimais. A
massa da matria seca total da planta foi obtida aps secagem das mudas em saco
de papel colocado em estufa com circulao forada de ar, temperatura de 65C,
at atingir massa constante. Assim que as mudas foram retiradas dos frascos
procedeu-se a medio do pH do meio de cultura com auxlio de um peagmetro de
bancada da marca MARCONI, modelo PA200. O eletrodo foi colocado diretamente
no meio de cultura para determinao do pH.
Os parmetros de fluorescncia foram medidos entre 9:00-11:00h, em sistema

aberto, sob radiao fotossinteticamente ativa (RFA) equivalente do ambiente
(500 mol m-2 s-1) e presso parcial de CO2 de 40 Pa, com um analisador de gases a
infravermelho (Li 6400XT, Li-Cor, Lincoln, EUA). Aps serem adaptados ao escuro,
por 30 minutos, tecidos foliares foram inicialmente expostos a um fraco pulso de luz
vermelho-distante (0,03 mol m-2 s-1) para a determinao da fluorescncia inicial
(F0). Em seguida, um pulso de luz saturante, com irradincia de
6000 mol (ftons) m-2 s-1 e durao de 0,8 s, foi aplicado para estimar-se a
fluorescncia mxima emitida (Fm). Procedeu-se, ainda, a determinao da
eficincia fotoqumica mxima do fotossistema II (FSII) (Fv/Fm) e dos coeficientes de
extino fotoqumica (qP) e no fotoqumica (NPQ) e da taxa de transporte de
eltrons (TTE). O rendimento das trs vias concorrentes de desexcitao de
clorofilas no FSII, isto , rendimento fotoqumico do FSII (FSII), rendimento no
fotoqumico associado dissipao de energia pelo ciclo das xantofilas (NPQ) e
outros mecanismos de dissipao energtica (NO) foram tambm calculados
41
(KRAMER et al., 2004). Clorofila a, clorofila b e clorofila total tambm foram

medidas.
As mesmas mudas utilizadas para medio dos parmetros fisiolgicos foram

usadas para determinao do teor de amido, segundo metodologia desenvolvida por
Yemm e Willis (1954). As mudas foram secadas em estufa a 65C, durante 48 horas,
e maceradas em cadinho. Em seguida, pesou-se aproximadamente 100 mg de cada
amostra, sendo colocadas em tubos eppendorf de 2000 L. Adicionou-se 1000 L de
lcool etlico, 92,8 INPM, agitando-se em agitador de tubos, e logo aps,
centrifugados durante cinco minutos a 4000 g, eliminando-se o sobrenadante em
seguida. Esse procedimento foi realizado por duas vezes e teve como objetivo a
lavagem das amostras. Imediatamente adicionou-se 1000 L de HCl a 3% em cada
amostra que foram colocadas em banho-maria a 95C durante quatro horas.
Procedeu-se a nova centrifugao durante cinco minutos a 4000 g. O lquido
sobrenadante foi coletado e disposto em tubos eppendorf de 2000 L. Coletou-se
10 L dessa soluo, colocando-a em novos tubos eppendorf de 2000 L, e em
seguida foi feita a diluio em 490L de gua destilada. Dessa diluio coletou-se
10 L, sendo depositados em tubos eppendorf de 2000 L. A essa diluio,
adicionou-se 1000 L de soluo de antrona (H2SO4 a 76% + reagente de antrona).
Os tubos foram colocados em banho-maria a 95C por 10 minutos. Aps esfriamento
foi feita a leitura dos acares solveis em espectrofotmetro FEMTO 700 PLUS, a
620 nm.
De cada muda utilizada para as medidas morfolgicas, retirou-se uma folha para a
medida da taxa de perda de gua, segundo metodologia proposta por Eliasson, Beyl
e Barker (1994), em que a massa da matria fresca (MF) de cada folha foi
determinada em uma balana analtica, em intervalos de 30 minutos, at que a
massa se estabilizasse. As medidas foram realizadas na bancada do laboratrio em
temperatura de 25,2C e 78% de umidade relativa. Finalizadas as determinaes da
massa da matria fresca das folhas, estas foram colocadas em estufa a 70C por
48 h para determinao da massa da matria seca (MS). A taxa de perda de gua
foi calculada segundo a equao: TPA = {[(MF MX) (MF MS)-1] 100}, em que MF
corresponde massa da matria fresca inicial, MX corresponde massa fresca a
cada trinta minutos entre as medies, e MS corresponde massa da matria seca.
42
Os dados referentes s variveis morfolgicas, parmetros fisiolgicos, teor de

amido e pH foram submetidos anlise de varincia e regresso polinomial. As
anlises estatsticas foram feitas com o auxlio do programa Genes (CRUZ, 2013).
2.3 RESULTADOS E DISCUSSO
A anlise de varincia demonstrou diferena significativa entre as doses de sacarose

para as mdias de todas as variveis estudadas. A anlise foi desmembrada para
estudo das respostas de cada varivel diante das doses por meio de regresso
polinomial at grau 3, conforme ilustra a tabela 2. Os resultados dessa anlise para
as variveis morfolgicas e parmetros fisiolgicos, ao final de 60 dias de cultivo de
mudas de baunilheira, provenientes de micropropagao, demonstram que houve
diferenas significativas para todas as variveis e parmetros analisados, obtendo-
se respostas lineares ou quadrticas.
Tabela 2 Resumo da anlise de varincia para comprimento da parte area

(CPA), nmero de folhas (NF), nmero de razes (NR), massa da matria fresca
total da planta (MFTP), massa da matria seca total da planta (MSTP), amido,
eficincia fotoqumica mxima (Fv/Fm), taxa de transferncia de eltrons (TTE),
rendimento fotoqumico do FSII (FSII), rendimento no fotoqumico associado
dissipao de energia pelo ciclo das xantofilas (NPQ), outros mecanismos de
dissipao energtica (NO), clorofila a, clorofila b e clorofila total, de mudas de
Vanilla planifolia provenientes de micropropagao, submetidas a diferentes
concentraes de sacarose no meio de cultura, e pH do meio de cultura, aos 60
dias de subcultivo, em Arthur Nogueira, SP, 2013
Quadrado Mdio
Fontes de Variao GL
CPA (cm) NF NRA MFTP (g) MSTP (g) Amido pH
Sacarose 4 9,3052 5,2127 10,5024 0,4783 0,0048 440,6907 0,1938
Regresso Linear 1 4,5368 0,4292 26,765 1,0154 0,0161 1580,049** 0,2341
Regresso Quadrtica 1 30,0799** 19,4469** 13,0564** 0,7009** 0,0023** 146,5778 0,5363**
Regresso Cbica 1 2,263 0,3718 0,0048 0,1793 0,0006 5,776 0,0018
Resduo 15 1,4707 1,2153 1,4482 0,068 0,0002 42,77 0,0326
Mdias 8,2 7,13 6,07 1,11 0,08 6,16 3,90
C.V. (%) 14,78 15,44 19,82 23,41 17,58 10,57 4,63
Quadrado Mdio
Fontes de Variao GL
Fv/Fm TTE FSII NPQ (NO)
Sacarose 4 0,0634 1758,7585 0,0369 0,0779 0,02
43
Tabela 2 Continuao........
Regresso Linear 1 0,1217 1566,9 0,0334 0,1537 0,0548

Regresso Quadrtica 1 0,0918** 2713,3978** 0,0565** 0,1126** 0,0126**
Regresso Cbica 1 0,0227 2,5735 0,00007 0,015 0,0048
Resduo 21 0,0015 33,0732 0,0007 0,0018 0,0015
Mdias 0,71 35,31 0,16 0,4 0,43
C.V. (%) 5,51 16,29 16,76 10,45 8,79
Quadrado Mdio
Fontes de Variao GL
Clorofila a Clorofila b Clorofila Total
Sacarose 4 11853,7124 719,1632 18054,2737
Regresso Linear 1 59913,6** 3058,776** 90047,256**
Regresso Quadrtica 1 4099,2171 461,0743 7287,5
Regresso Cbica 1 11179,35 722,454 17585,664
Resduo 20 2765,7 242,2153 4225,6573
Mdias 216,5 71,04 287,52
C.V. (%) 24,29 21,91 22,61
** Significativo pelo teste F a 1%; GL = Grau de liberdade.
Nenhuma das variveis morfolgicas apresentou relao direta com o aumento dos
nveis de sacarose, e sim resposta quadrtica (Tabela 2; Figura 5). Os pontos de
mxima eficincia tcnica em g L-1 de sacarose foram: 33,02 para comprimento da
parte area, correspondente a 9,66 cm (Figura 5A); 28,88 para nmero de folhas,
correspondente a 8,33 folhas (Figura 5B); 43,64 para nmero de razes,
correspondente a 7,47 razes (Figura 5C); 40,5 para massa da matria fresca total,
correspondente a 1,3911 g (Figura 5D); e, 53,57 para massa da matria seca total,
correspondente a 0,1118 g (Figura 5E).
44
10 9
9
A 8
B
CPA (cm)
8 7
NF
7 6
6 5
5 4
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60
Sacarose (g L-1) Sacarose (g L-1)
9 1,6
8 C 1,4 D
1,2
MFTP (g)
7
6 1
NR
5 0,8
4 0,6
3 0,4
2 0,2
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60
0,14
0,12
E
0,1
MSTP (g)
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 15 30 45 60
Sacarose (g L-1)
Figura 5 (A) - comprimento da parte area (CPA), (B) - nmero de folhas (NF), (C) -
nmero de razes (NR), (D) - massa da matria fresca total da planta (MFTP) e (E) - massa
da matria seca total da planta (MSTP), de mudas de Vanilla planifolia provenientes de
micropropagao, submetidas a diferentes concentraes de sacarose no meio de cultura,
aos 60 dias de subcultivo.
Diversos trabalhos foram realizados com o objetivo de identificar as melhores

respostas de plantas de orqudeas cultivadas em diferentes concentraes de
sacarose no meio de cultura. Ao cultivarem Miltonia flavescens Lindl in vitro, Besson
et al. (2010) identificaram que a concentrao de 30 g L -1 de sacarose resultou em
maior comprimento da parte area. Galdiano Jnior et al. (2013a e 2013b)
concluram que a concentrao de 20 g L-1 de sacarose no meio de cultura foi a de
maior eficincia entre as concentraes estudadas, tanto para o crescimento in vitro
para Cattleya violacea, como para o crescimento in vitro quanto ao estabelecimento
45
ex vitro de Cattleya loddigesii. Pivetta et al. (2010) encontraram nas concentraes

estimadas de 13 a 29 g L-1 de sacarose os maiores valores mdios para nmero de
razes, comprimento de razes e comprimento da parte area em plntulas de
Caularthron bicornutum. Frgas et al. (2003) tambm identificaram que a
concentrao de 20 g L-1 de sacarose proporcionou crescimento satisfatrio de
plntulas em hbridos de Cattleya labiata e Laelia itambana.
No presente estudo a maior concentrao estimada, 53,57 g L-1, proporcionou o

melhor resultado para massa da matria seca total. Isso pode ser devido a uma
maior concentrao de amido nesse nvel.
O tratamento contendo 40 g L-1 de sacarose foi o mais eficiente para o

desenvolvimento vegetativo e a concentrao de 30 g L-1 promoveu maior massa da
matria seca de plntulas da orqudea Oncidium baueri (SORACE et al. 2008).
Entretanto, Correia et al. (2012), estudando o efeito da sacarose no crescimento de
Cattleya labiata cultivada in vitro, em sala de crescimento temperatura de 27 2C
e fotoperodo de 12 horas com radiao ativa fotossinttica de 30 mol m -2s-1
fornecida por lmpadas fluorescentes de 40 W, observaram que plntulas
desenvolvidas em meio de cultura sem adio de sacarose mostraram ganhos de
crescimento significativos quando comparadas quelas crescidas em meio de
cultura contendo 30 g L-1 de sacarose.
O valor mais elevado, 60 g L-1, reduziu todas as variveis morfolgicas avaliadas,

provavelmente pelo decrscimo do potencial osmtico do meio, dificultando a
absoro de sais e gua pelas mudas. Entretanto, Faria et al. (2004) relataram que o
maior comprimento da parte area de plntulas de Dendrobium nobile foi obtido na
concentrao de 60g L-1. Brown, Leung e Thorpe (1979) demonstraram o efeito
osmtico da sacarose na cultura de calos de tabaco. Verificaram que as taxas de
crescimento e regenerao era ideal na concentrao de 3% de sacarose no meio
de cultura, em que o potencial osmtico variou entre -0.4 e -0.6 MPa. Contudo, com
o aumento dos nveis de sacarose acima de 3% ocorreu uma diminuio progressiva
na regenerao de brotos.
46
Segundo Arigita, Gonzlez e Tams (2002), os explantes cultivados em ambiente

heterotrfico desenvolvem desordens anatmicas, morfolgicas e fisiolgicas que
fazem com que a maquinaria fotossinttica no opere normalmente.
Verifica-se na figura 6 que a concentrao de 60 g L-1 de sacarose, proporcionou

pequeno crescimento de rea foliar da planta, apenas fololos, e as razes menos
desenvolvidas em comparao s plantas que cresceram nas demais
concentraes. Uma analogia tambm pode ser feita em relao a esse aspecto
entre as figuras 5B e 5C, em que h um decrscimo do nmero de razes e de
folhas, de 45 g L-1 para 60 g L-1 de sacarose, da ordem de 14,32% e 29,88%,
respectivamente. Ou seja, na dosagem de 60 g L -1, ocorre alterao morfolgica, em
que a muda desenvolve menos folha e raiz. Isso pode ser devido alta
concentrao de sacarose no meio de cultura, que pode levar a um aumento do
potencial osmtico do meio, dificultando a absoro de gua e sais, promovendo
limitaes no crescimento de folhas e razes.
Figura 6 Mudas de Vanilla planifolia provenientes de micropropagao, submetidas a

diferentes concentraes de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1), no meio de cultura, aos 60
dias de subcultivo.
O alto teor de acar no meio diminui a absoro de gua, causando dficit hdrico.
Em folhas pequenas, e ainda com dficit hdrico, no h turgescncia,
47
consequentemente, no h crescimento celular. Em compensao, em mudas com

poucas folhas h perda mnima de gua. Segundo George, Hall e De Klerk (2008),
os acares so responsveis por grande parte do potencial osmtico do meio de
cultura e quando a concentrao de sacarose em um meio, como MS, aumentada
acima de 4-5%, comea a haver uma inibio progressiva do crescimento da clula,
e isso pode estar relacionado a um efeito osmtico do meio.
Embora a maior concentrao de sacarose, 60 g L-1, tenha promovido maior

crescimento de raiz, plntulas hbridas de Calanthe (Orchidaceae) foram induzidas a
anormalidades (BAQUE et al., 2011). Ao estudarem a produo in vitro de biomassa
e fenis em razes adventcias de Echinacea angustifolia, Wu et al. (2006)
verificaram que a maior quantidade de fenis e flavonoides foi acumulada com 5%
de sacarose. Concluram que a adio de sacarose no meio de cultura uma
importante fonte de carbono para cultura de razes adventcias e que sua
concentrao inicial pode afetar vrios parmetros in vitro, como por exemplo, o
crescimento e a produo de metablicos secundrios. Ldo et al. (2007)
constataram que o aumento da concentrao de sacarose de 60 g L -1 para 80 g L-1,
no meio de cultura para o coqueiro-ano, provavelmente tenha promovido um efeito
depressivo no metabolismo das plntulas, o que resultou em maior porcentagem de
plntulas anormais.
O nvel de sacarose no meio pode ter um efeito direto sobre o tipo da morfognese.
Assim, 87 mM de sacarose favoreceu a organognese, enquanto que um nvel mais
elevado, 350 mM, favoreceu a embriognese somtica a partir de embries zigticos
imaturos de girassol (JEANNIN; BRONNER; HAHNE, 1995).
No houve relao direta para nenhum dos parmetros fisiolgicos com o aumento
dos nveis de sacarose, mas sim uma resposta quadrtica, com exceo para
clorofila a, clorofila b e clorofila total que apresentaram resposta linear (Tabela 2;
Figura 7). Os pontos de mxima eficincia em g L -1 foram: 19,72 para eficincia
fotoqumica mxima do FSII, correspondente a 0,8 (Figura 7A); 23,89 para
coeficiente de extino fotoqumico, correspondente a 0,31 (Figura 7B); 23,28 para
taxa de transporte de eltrons, correspondente a 47,93 mol m -2 s-1 (Figura 7C);
23,21 para rendimento fotoqumico do FSII, correspondente a 0,22 (Figura 7D); e
48
10,17 para outros mecanismos de dissipao energtica, correspondente a 0,48

(Figura 7F). O ponto de mnima eficincia em g L-1 foi de 19,5 para rendimento no
fotoqumico associado dissipao de energia pelo ciclo das xantofilas,
correspondente a 0,31 (Figura 7E).
Os valores de Fv/Fm de 0 a 45 g L-1 de sacarose foram muito prximos, variando de

0,74 a 0,76, mas apresentou forte reduo em 60 g L-1, ficando bem abaixo da faixa
considerada tima (0,75 a 0,85), em plantas no submetidas a estresses (BOLHAR-
NORDENKAMPF et al., 1989), o que causou comprometimento da eficincia
fotoqumica mxima do FSII. Valores inferiores a esses indicam uma diminuio na
eficincia fotoqumica do FSII e um distrbio ou danificao no aparato
fotossinttico, bem como de um aumento no processo de fotoinibio (MAXWELL;
JOHNSON, 2000; LICHTENTHALER et al. 2005), o qual atribudo degradao
da protena D1 (ESTELLE, 2001). Ao cultivarem batata-doce in vitro, sob duas
concentraes de sacarose (20 e 40 g L-1) e duas densidades diferentes de fluxos de
ftons (21 e 60 mol m-2 s-1), Cassana et al. (2010) observaram que as folhas tanto
in vitro como ex vitro apresentaram alta eficincia fotoqumica mxima (Fv/Fm),
indicando um bom desenvolvimento do aparato fotossinttico.
O coeficiente de extino fotoqumico (qP) representa a proporo da energia dos

ftons capturada pelos centros de reao do FS II abertos e dissipada via transporte
de eltrons (JUNEAU; GREEN; HARRISON, 2005). Zanandrea et al. (2007), ao
estudarem caractersticas fotossintticas em macieira, verificaram que a
concentrao de sacarose em relao a esse parmetro foi significativamente maior
no meio contendo 30 g L-1. Altas concentraes de sacarose diminuem a eficincia
fotoqumica mxima, que por consequncia reduz o coeficiente de extino
fotoqumico (qP) e a taxa de transporte de eltrons (TTE).
49
0,9 0,5
0,8
A B
0,4
0,7
Fv/Fm
0,3
qP
0,6
0,5 0,2
0,4 0,1
0,3 0
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60
60 0,3
C D
TTE (mol m-2 s-1)
50 0,25
40 0,2
FSII
30 0,15
20 0,1
10 0,05
0 0
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60
0,7 0,6
E F
0,6 0,5
0,5
NPQ
NO
0,4
0,4
0,3
0,3
0,2 0,2
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60
Figura 7 (A) - Fv/Fm (eficincia fotoqumica mxima do FSII), (B) - qP (coeficiente de

extino fotoqumico), (C) - TTE (taxa de transporte de eltrons), (D) - FSII (rendimento
fotoqumico do FSII), (E) - NPQ (rendimento no fotoqumico associado dissipao de
energia pelo ciclo das xantofilas) e (F) - NO (outros mecanismos de dissipao energtica),
de mudas de Vanilla planifolia provenientes de micropropagao, submetidas a diferentes
concentraes de sacarose no meio de cultura, aos 60 dias de subcultivo.
Moth et al. (2008), ao avaliarem a eficincia fotoqumica e caractersticas de

crescimento da cana-de-acar (Saccharum officinarum L.) cultivada in vitro em
diferentes concentraes de sacarose observaram que no houve comprometimento
da sacarose no meio sobre as caractersticas relacionadas fotossntese, entre elas
o rendimento quntico mximo do FSII (Fv/Fm), e que isso pode estar relacionado
com a alta capacidade dessa espcie em armazenar sacarose nos tecidos.
50
Houve relao direta para clorofila a, b e totais e para concentrao de amido com o
aumento dos nveis de sacarose (Tabela 2; Figura 8). Nas figuras 8A, 8B e 8C
verifica-se que o maior ndice ICF (ndice de Clorofila Falker) ocorreu na ausncia de
sacarose. Isso uma evidncia de que mudas de Vanilla planifolia cultivadas in vitro,
na ausncia de carboidrato, exercem comportamento autotrfico. Nesse ambiente as
mudas tiveram menor crescimento em relao s concentraes de 15, 30 e
45 g L-1, mas a possibilidade de sucesso no processo de aclimatizao das mesmas
tende a ser menos traumtico. Resultado diferente foi encontrado por Dignart et al.
(2009) ao constatarem que a ausncia de sacarose resultou em menores teores de
clorofila em plntulas de Cattleya walkeriana.
Diversos trabalhos tm reportado que, para muitas espcies, a presena de

sacarose no meio de cultivo tem sido considerada a principal causa da reduo nos
teores de clorofila e, consequentemente, na fotossntese (YAMADA; SATO, 1978;
DESJARDINS; HDIDER; De RIEK, 1995; KOZAI; NGUYEN, 2003; GEORGE; HALL;
De KLERK, 2008). Segundo Campostrini e Otoni (1996), vrios autores tm sugerido
que a fonte de carboidrato no meio de cultura impede o metabolismo fotossinttico
do carbono, como a inibio da fotossntese potencial in vitro, reduo da atividade
da Rubisco, inibio do acmulo de clorofila, diminuio da fixao do carbono
inorgnico por meio da inibio da atividade da carboxilase do fosfoenolpiruvato e do
Ciclo de Calvin, e ainda, a reduo da eficincia fotoqumica do fotossistema II
quando avaliada pela fluorescncia da clorofila a. Todavia, a reduo ou at mesmo
a eliminao da sacarose do meio deve ser utilizada com a finalidade de facilitar a
passagem das mudas para o estdio fotoautotrfico na fase de aclimatizao
(DEBERGH, 1991). De acordo com Kozai et al. (1991), na presena de acares as
mudas no desenvolvem a capacidade fotoautotrfica, podendo causar crescimento
reduzido e morte de mudas durante a fase de aclimatizao, uma vez que tais
plantas necessitam de um metabolismo fotoautotrfico quando so postas no
ambiente ex vitro.
Observa-se tambm que na maior concentrao de sacarose a quantidade de

clorofila a e clorofila b foram baixas. Isso pode ser devido alta concentrao de
amido no nvel de 60 g L-1 de sacarose, o que fez com que o sistema fotossinttico
no funcionasse bem, provocando o crescimento diminuto de folha.
51
Na figura 8D, verifica-se que as concentraes crescentes de sacarose promoveram

um acrscimo de amido, com valor mximo na maior concentrao. O amido em alta
concentrao nos cloroplastos leva a retroinibio da eficincia fotoqumica mxima,
culminando com a fotoinibio, como pode ser visto pelo baixo valor de Fv/Fm na
concentrao de 60 g L-1 (Figura 7A). Com a reduo da eficincia fotoqumica
mxima ocorre tambm a queda do rendimento fotoqumico do fotossistema II.
Capellades, Lemeur e Debergh (1991) relataram que a elevada concentrao de

sacarose no meio poderia ter promovido uma maior concentrao de amido no
cloroplasto. Uma explicao para a inibio da fotossntese pode ser a baixa taxa de
regenerao da carboxilao RuBP substrato, devido acumulao de acares
solveis nas folhas (AZCN-BIETO, 1986). A outra explicao para a baixa taxa de
fotossntese lquida poderia ser a inibio da atividade e, ou sntese da Rubisco
(CAPELLADES; LEMEUR; DERBERGH, 1991).
Hdider e Desjardins (1994) encontraram resultados semelhantes ao verificarem uma

reduo de 50% na fotossntese potencial mxima quando a concentrao de
sacarose passou de 0% para 5%, ao estudarem o efeito de diferentes concentraes
de sacarose sobre a fotossntese em plntulas de morango. La Rosa, Hasegawa e
Bressan (1984) relataram que aparentemente a presena da sacarose no meio de
cultivo inibe a fotossntese, independente do acmulo de clorofila.
52
300 A 100 B
250
Clorofila a (ICF)
Clorofila b (ICF)
80
200
60
150
40
100
50 20
0 0
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60
7,5
400 C 7 D
Clorofila total (IFC)
300 6,5
Amido (%)
6
200 5,5
i 49 ,27 0 ,419 i
5
100 2
4,5 R 89 ,63 %
0 4
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60
Figura 8 (A) - Clorofila a, (B) - clorofila b, (C) - clorofila total e (D) - contedo de amido, de
mudas de Vanilla planifolia provenientes de micropropagao, submetidas a diferentes
concentraes de sacarose no meio de cultura, aos 60 dias de subcultivo.
No intervalo de 0 a 150 minutos as menores taxas de perda de gua ocorreram nas

concentraes de 15 g L-1 e 30 g L-1 de sacarose (Figura 9), o que pode ser um dado
importante para a aclimatao dessas mudas quando forem transferidas para
condies ex vitro. A concentrao de 45 g L-1 foi a que apresentou a maior taxa de
perda de gua. Isso pode ser devido a um maior acmulo de massa de matria
seca, possivelmente associado maior fotossntese e abertura estomtica.
Entretanto, Crespo (2007), ao cultivar cana-de-acar in vitro verificou nos
tratamentos em que se utilizou a menor concentrao (1,5%) de sacarose no meio
de cultivo, uma taxa de perda de gua (TPA) superior em comparao com os de
3% e 4,5%.
53
40
30
TPA (%)
20

S 0 g L-1 i 5,0984 0,5549 i 0,0021 i 2 R 2 99,24%

S 15 g L-1 i 8,097 0,3008 i 0,0012 i 2 R 2 98,97%

10 S 30 g L-1 i 4,6487 0,3499 i 0,0014 i 2 R 2 99,31%

S 45 g L-1 i 18,23 0,311 i 0,0013 i 2 R 2 98,68%

S 60 g L-1 i 16,28 0,3083 i 0,0013 i 2 R 2 98,30%
0
30 60 90 120 150
Tempo (minutos)
Figura 9 Taxa de perda de gua (TPA) de mudas de Vanilla planifolia provenientes de

micropropagao, submetidas a diferentes concentraes de sacarose no meio de cultura,
aos 60 dias de subcultivo.
Explantes cultivados sob regime heterotrfico originam plantas com elevado

contedo de gua, com grande risco de desidratao e morte durante a
aclimatizao (KUBOTA; KOZAI, 1992). Plantas cultivadas in vitro perdem gua
rapidamente pela transpirao, quando so transferidas para a condio ex vitro
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998; GROUT, 1988; SUTTER, 1988).
Na ltima fase da cultura de tecidos ocorre a transferncia das mudas produzidas

para meio de enraizamento e subsequente transplantio das plantas obtidas para um
substrato adequado (MURASHIGE, 1974). De acordo com Grattapaglia e Machado
(1990), nessa fase a planta passa de uma situao de reduzido fluxo transpiratrio,
devido baixa irradincia e elevada umidade relativa, para um ambiente que
demanda um incremento na taxa de transpirao, ficando muito suscetvel ao
estresse hdrico.
Alm do aparelho fotossinttico ineficiente, as folhas das plantas in vitro tambm

possuem menor quantidade de cera epicuticular do que as plantas crescidas em
casa de vegetao ou cmaras de crescimento (BAKER, 1974; SUTTER;
LANGHANS, 1980). Segundo Campostrini e Otoni (1996), tal fato responsvel pela
transpirao excessiva que, aliada reduo no nmero de estmatos, ao mau
54
funcionamento no mecanismo de abertura e fechamento estomtico e m

estruturao do clornquima, levam ao dessecamento e murchamento das folhas.
Quanto aos valores de pH do meio de cultura, observa-se que no ocorreu uma

relao direta com o aumento dos nveis de sacarose, e sim uma resposta
quadrtica (Tabela 2, Figura 10). O ponto de mnima eficincia em g L-1 foi 39,
correspondente a um pH de 4,37. Em todos os tratamentos, mesmo no que no se
adicionou sacarose ao meio, os valores do pH variaram entre 4,42 e 4,97, 30 e
0 g L-1 de sacarose, respectivamente. Isso pode ser devido eliminao de
compostos cidos pelas razes no meio de cultura. Em se tratando de uma planta
hemiepfita isso perfeitamente possvel.
5,1
4,9
2
4,8 i 4,9827 0,0312 i 0,0004 i
R2 99,33%
pH
4,7
P min : 39 g L-1
4,6
4,5
4,4
4,3
0 15 30 45 60
Sacarose (g L-1)
Figura 10 pH do meio de cultura de mudas de Vanilla planifolia, com diferentes

concentraes de sacarose.
Segundo Pasqual (2002), durante o crescimento das clulas, o pH do meio de

cultura se altera medida que diferentes ons so absorvidos e os produtos
metablicos so excretados para o meio. Esse mesmo autor obteve melhor
desenvolvimento de embries de tangerineira Ponc, em pH cido, entre 3,7 e 5,7.
55
2.4 CONCLUSES
- Com base nos resultados obtidos nesta pesquisa, observa-se que as

concentraes de sacarose utilizadas so suficientes para os estudos dos aspectos
morfofisiolgicos analisados e que as concentraes estimadas de 28,88 a
53,57 g L-1 de sacarose no meio de cultura proporcionam as maiores mdias para
comprimento da parte area, nmero de folhas, nmero de razes, massa da matria
fresca total e massa da matria seca total das mudas de Vanilla planifolia.
- A concentrao de 60 g L-1 de sacarose no meio de cultura prejudicial ao

crescimento de mudas de baunilha e a sua ausncia no meio induz a planta a ter
comportamento autotrfico.
- As menores taxas de perda de gua ocorreram nas concentraes de 15 g L-1 e 30

g L-1 de sacarose. As mudas podem ter melhor adaptao quando forem cultivadas
sob condio ex vitro.
- O pH no um fator limitante direto para o crescimento das mudas visto que os

melhores resultados dos aspectos morfofisiolgicos tambm ocorreram em pH cido.
- Os dados relativos aos aspectos morfolgicos e fisiolgicos de mudas de Vanilla

planifolia provenientes de micropropagao sugerem a viabilidade tcnica para a
propagao de mudas em larga escala.
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63
CAPTULO III
CRESCIMENTO DE MUDAS DE BAUNILHA (ORCHIDACEAE):

RECIPIENTE, SUBSTRATO E TIPO DE MUDA
64
RESUMO
Tradicionalmente, a baunilha propagada pelo mtodo da estaquia. No entanto, a

sua propagao tambm possvel por meio da proliferao de gemas axilares in
vitro e propagao seminfera in vitro. Com base nesse contexto, este estudo
objetivou avaliar o crescimento de mudas de Vanilla planifolia provenientes da
proliferao de gemas axilares e da propagao seminfera in vitro, cultivadas em
diferentes recipientes e substratos, por meio de variveis morfolgicas.O
experimento foi realizado em esquema de parcelas subsubdivididas, constitudo
pelas combinaes entre os fatores recipiente (2 nveis: sacola e bandeja, nas
parcelas), substrato (2 nveis: preparado I e preparado II, nas subparcelas) e tipo de
muda (2 nveis: proliferao de gemas axilares e propagao seminfera in vitro, nas
subsubparcelas), num delineamento inteiramente casualizado, com quatro
repeties de oito mudas. As avaliaes foram realizadas aos 90 dias aps o plantio
e os dados foram submetidos anlise de varincia. Quando significativos, foi
utilizado o teste de Tukey (p0,05). Ocorreu interao tripla significativa para massa
da matria fresca do caule (MFC), massa da matria fresca da folha (MFF), massa
da matria fresca total da planta (MFTP), massa da matria seca do caule (MSC),
massa da matria seca da folha (MSF) e massa da matria seca total da planta
(MSTP). A combinao de recipiente sacola de polietileno (30x15 cm), substrato II
(solo, areia, esterco de galinha e serrapilheira de mata) e muda micropropagada de
gema axilar pode ser utilizada na produo de mudas de V. planifolia.
Palavras-chave: Vanilla planifolia. Propagao. Embalagem. Serrapilheira de mata.

65
ABSTRACT
Vanilla has traditionally been propagated from cuttings. However, it can also be
propagated through in vitro axillary bud proliferation and in vitro seminiferous
propagation. Therefore, this study aimed to evaluate the growth of seedlings of
Vanilla planifolia from axillary bud proliferation and in vitro seminiferous propagation,
grown in different containers and substrates, through morphological variables. The
experiment was arranged in a split-plot design, consisting of combinations of the
following factors: container (2 levels: bag and tray, in the plots), substrate (2 levels:
preparation I and prparation II, in the subplots) and type of seedling (2 levels:
proliferation of axillary bud and in vitro seminiferous propagation, in subsubplots) in a
completely randomized design with four replications of eight seedlings. Evaluations
were performed at 90 days after planting and the data were subjected to the analysis
of variance. The significant data were submitted to the Tukey test (p 0.05).
Significant triple interaction was verified for fresh weight of stem (MFC), fresh weight
of leaf (MFF), total fresh wheight of plant (MFTP), dry weight of the stem (MSC), dry
weight of the leaf (MSF) and total dry weight of the plant (MSTP). The combination of
polyethylene bags (30x15 cm), substrate II (soil, sand, chicken manure and litter from
forest) and seedling micropropagated from axillary buds can be used in the
production of seedlings of V. planifolia.
Keywords: Vanilla planifolia. Propagation. Packaging. Forest litter.

66
3.1 INTRODUO
A propagao vegetativa, pelo processo convencional de estaquia ou pela tcnica

da micropropagao, facilita a multiplicao de gentipos desejados. O processo da
propagao vegetativa no inclui meiose, portanto, as brotaes originrias so
geneticamente idnticas planta matriz (HIGASHI; SILVEIRA; GONALVES, 2000).
Entretanto, a propagao sexuada gera maior variabilidade entre os indivduos o que
possibilita maior distribuio e adaptao do material em condies de solo e clima
diferentes (SILVA, 2005).
Tradicionalmente, a baunilha propagada pelo mtodo da estaquia a partir do

seccionamento do caule da planta. No entanto, esse mtodo de propagao no
econmico e tambm tem a desvantagem de ser moroso (KALIMUTHU;
SENTHILKUMAR; MURUGALATHA, 2006).
Para Chandra et al. (2010), o sucesso de micropropagao em escala comercial

depende da capacidade de transferncia em larga escala de plntulas, a baixo custo
e com altas taxas de sobrevivncia. Todavia, o cultivo in vitro pode promover
alteraes anatmicas, morfolgicas, fisiolgicas e variaes somaclonais nas
plantas, o que dificulta o desenvolvimento das mesmas (GEORGE; HALL; De
KLERK, 2008; RADOCHOV; TICH, 2009), levando, algumas vezes,
consequncias negativas ao crescimento e ao desenvolvimento das culturas,
comprometendo assim a obteno de taxas de estabelecimento e de multiplicao
satisfatrias (CAMPOSTRINI; OTONI, 1996).
As condies do ambiente de cultivo in vitro ao promoverem um crescimento rpido

resultam na formao de plantas anormais. Essas plantas so frequentemente
caracterizadas pela pobre eficincia fotossinttica, mau funcionamento dos
estmatos e uma acentuada diminuio na cera epicuticular (HAZARIKA, 2006). O
cultivo de explantes em regime fotomixotrfico origina plantas com o contedo de
gua elevado, com grande risco de desidratao e morte durante a aclimatizao
(KUBOTA; KOZAI, 1992; GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
67
A etapa da aclimatizao das mudas a ltima fase da micropropagao, sendo

uma fase crtica e limitante no processo da micropropagao e essencial para a
sobrevivncia e o sucesso do estabelecimento das plantas. Esse processo deve ser
progressivo de forma que as plntulas no sofram estresse ou venham morte
devido s mudanas de ambiente (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998; DEB;
IMCHEN, 2010).
Durante a fase de aclimatizao e crescimento das plantas, necessrio o uso de

um meio de sustentao e fornecedor de nutrientes: o substrato. Ele pode facilitar ou
impedir o crescimento das mudas conforme suas propriedades fsico-qumicas. A
escolha e o manejo correto do substrato iro afetar a sobrevivncia, o crescimento e
o desenvolvimento das plantas (CALVETE, 2004).
Caractersticas fsicas e qumicas relacionadas espcie a ser cultivada, alm de

aspectos econmicos, devem ser observadas ao se escolher um substrato. Tais
caractersticas esto relacionadas homogeneidade, baixa densidade, alta
porosidade, boa capacidade de reteno de gua, alta capacidade de troca
catinica, boa agregao das partculas nas razes, nutrientes em quantidades
suficientes para o bom desenvolvimento das mudas, iseno de pragas, agentes
fitopatognicos e sementes indesejveis, de fcil manipulao a qualquer tempo,
disponibilidade e baixo custo por unidade (MINAMI, 1995; CALVETE, 2004;
GOMES; SILVA, 2004). Essas caractersticas definem o xito ou o fracasso da
utilizao do substrato (CALVETE, 2004).
O substrato deve ser suficientemente poroso, a fim de permitir trocas gasosas

eficientes, evitando falta de ar para a respirao das razes e para a atividade dos
microrganismos no meio (KMPF, 2000). O pH, a capacidade de troca de ctions
(CTC), a salinidade e o percentual de matria orgnica presentes so utilizados para
qualificar e quantificar as propriedades qumicas do substrato (SHMITZ; SOUZA;
KMPF, 2002).
Entre os substratos mais utilizados, pode-se citar vermiculita, perlita, areia, turfa,
casca de eucalipto ou de pinus curtida, casca de arroz carbonizada e p de carvo,
cujas propores variam conforme a espcie (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
68
Entre as propriedades fsicas utilizadas para caracterizao de um substrato,

destacam-se: a densidade, a porosidade, o espao de aerao e a economia hdrica
(SHMITZ; SOUZA; KMPF, 2002).
A produo de mudas em recipientes o sistema mais utilizado, principalmente por

permitir a melhor qualidade, devido ao melhor controle da nutrio e proteo das
razes contra os danos mecnicos e a desidratao, alm de propiciar o manejo
mais adequado no viveiro, no transporte, na distribuio e no plantio (GOMES et al.,
2003). O recipiente, alm de suporte, proporciona melhores condies para a
nutrio das mudas, alm de permitir maior proteo das razes contra injrias
mecnicas e dessecao e oferece conformao vantajosa para as razes das
mudas (CALVETE, 2004). Deve-se ressaltar que o maior volume promove a melhor
arquitetura do sistema radicular (PARVIAINEN, 1976), apesar de grandes
dimenses acarretarem maiores custos de produo, de transporte, de distribuio e
de plantio. Em geral, a altura da embalagem mais importante do que o seu
dimetro para o crescimento de mudas de vrias espcies (GOMES et al., 2003).
Em geral os produtores de baunilha estabelecem a cultura plantando as estacas

diretamente no campo. Essa prtica apresenta baixo ndice de pegamento e
ocasiona grandes perdas de material propagativo, gerando prejuzos financeiros
(SILVA, 2005). Uma boa alternativa a produo de mudas provenientes de
micropropagao, em recipiente plstico, devido ao baixo custo desse material e
fcil manuseio, e em substrato com teor adequado de nutrientes, boa capacidade de
reteno de gua, suficiente aerao e fcil drenagem.
No foram identificados trabalhos cientficos que tenham avaliado os aspectos

morfolgicos de diferentes tipos de mudas de Vanilla planifolia cultivadas em
diferentes recipientes e substratos. Com base nessa informao, este estudo
objetivou verificar qual a melhor combinao entre tipo de muda, tipo de recipiente e
tipo de substrato, por meio de avaliaes das variveis morfolgicas.
69
3.2 MATERIAL E MTODOS
O experimento foi realizado em Cachoeiro de Itapemirim-ES, na Fazenda

Experimental do INCAPER (Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistncia Tcnica e
Extenso Rural), em casa de vegetao revestida lateralmente com filme de
poliolefina transparente e coberta com tela de sombreamento preta capaz de
interceptar 50% da radiao. Mudas de Vanilla planifolia G. Jacks ex ANDREWS, de
4-5 cm de comprimento, obtidas por meio de proliferao de gemas axilares e
propagao de plntulas in vitro, produzidas no Laboratrio de Micropropagao de
Plantas da Empresa Clonagri, em Arthur Nogueira, So Paulo, foram plantadas em
diferentes recipientes e diferentes substratos para avaliao do crescimento.
A metodologia utilizada para a produo de mudas provenientes da proliferao de

gemas axilares de planta adulta consistiu na retirada das gemas e posterior lavagem
em gua corrente, seguida de desinfestao com lcool 70% durante 3 minutos,
soluo comercial de hipoclorito a 0,6% com 5 gotas de Tween,para cada 100 mL da
soluo desinfestante por 25 minutos e 3 enxagues em gua destilada e estril.
Com auxlio de bisturi e lupa, as gemas foram isoladas nas dimenses de 0,2 a 0,5
mm de comprimento e 2,5 a 5,0 mm de dimetro, e procedeu-se a nova
desinfestao com soluo comercial de hipoclorito a 0,3% com 5 gotas de Tween,
por 10 minutos e 3 enxagues em gua destilada e estril. Terminada a
desinfestao, as gemas foram inoculadas em meio MS (MURASHIGE; SKOOG,
1962), suplementado com 30 g L-1 de sacarose, solidificado com 6 g L-1 de gar, pH
ajustado para 5,7 0,1 e esterilizado em autoclave com presso de 1,5 atm e
temperatura de 121C, por 20 minutos. No cultivo foram utilizados frascos de tampa
plstica transparente com capacidade de 100 ml, contendo 15 ml de meio de cultura.
Aps o estabelecimento da gema e o meio de cultura no apresentando

contaminao aparente, transferiu-se a gema para frasco com capacidade de 190 ml
contendo 30 ml de meio MS completo, com 2 g L-1 de carvo ativado. De cada gema
surgiu uma nica brotao, formando um nico ramo. Os ramos foram fracionados
em 1,5-2 cm e inoculados na posio deitada para multiplicao em frasco com
capacidade de 190 ml contendo 30 ml de meio MS completo, com 2 g L-1 de carvo
ativado.
70
Entre 4-6 semanas novos ramos foram formados a partir das gemas axilares. Seis
multiplicaes foram realizadas, a fim de se obter mudas em quantidade suficiente
para a montagem do experimento e para novos estudos. A temperatura da sala de
crescimento ficou entre 23 a 26C, com umidade relativa em torno de 50-60% e
fotoperodo de 12 horas, sob lmpadas fluorescente tipo luz do dia e intensidade
luminosa de 50 mol m-2 s-1. No foi utilizado nenhum tipo de fitorregulador em
nenhuma fase desde a inoculao das gemas at o final das multiplicaes. O
material vegetal utilizado para extrao das gemas consistiu de um nico ramo de
Vanilla planifolia de 2 m de comprimento, 1 cm de dimetro, e entrens de
aproximadamente 15 cm, de cinco anos de idade, coletado em Muqui, Esprito
Santo.
Para a produo de mudas originrias de plntulas de V. planifolia, utilizou-se da

seguinte metodologia: lavagem de cpsulas com gua corrente e desinfestao com
lcool 70% durante 1 minuto, soluo comercial de hipoclorito a 0,6% com 5 gotas
de Tween, para cada 100 mL da soluo desinfestante por 15 minutos e 3 enxagues
em gua destilada e estril. Aps desinfestao, as cpsulas foram abertas e as
sementes foram coletadas sob lupa. Em seguida, sementes foram inoculadas em
meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com 30 g L-1 de sacarose,
solidificado com 6 g L-1 de gar, pH ajustado para 5,7 0,1 e esterilizado em
autoclave com presso de 1,5 atm e temperatura de 121C, por 20 minutos. No
cultivo foram utilizados frascos de tampa plstica transparente com capacidade de
190 ml contendo 30 ml de meio de cultura. Foram utilizados 10 frascos para
inoculao.
Transcorridos 270 dias aps a inoculao, as sementes comearam a germinar.

Uma vez germinadas, foram transferidas para frascos de tampa plstica
transparente com capacidade de 190 ml contendo 30 ml de meio MS (MURASHIGE;
SKOOG, 1962), com 2g L-1 de carvo ativo,suplementado com 30 g L-1 de sacarose
e com 2 g L-1 de carvo ativo, solidificado com 6 g L-1 de gar, pH ajustado para
5,7 0,1 e esterilizado em autoclave com presso de 1,5 atm e temperatura de
121C, por 20 minutos. Entre 4-6 semanas foi selecionada, de cada frasco, a
plntula que apresentou o maior desenvolvimento. As plntulas foram fracionadas
em tamanho de 1,5-2 cm e inoculadas na posio deitada para multiplicao em
71
frasco com capacidade de 190 ml contendo 30 ml de meio MS completo, com 2 g L-1

de carvo ativado.
Entre 4-6 semanas, ramos foram formados a partir da gema axilar presente em cada
explante. Seis multiplicaes foram realizadas, a fim de se obter mudas em
quantidade suficiente para a montagem do experimento e para novos estudos. A
temperatura da sala de crescimento permaneceu entre 23 a 26C, com umidade
relativa em torno de 50-60% e fotoperodo de 12 horas, sob lmpadas fluorescente
tipo luz do dia e intensidade luminosa de 50 mol m-2 s-1. No foi utilizado nenhum
tipo de fitorregulador em nenhuma fase desde a germinao das sementes at o
final das multiplicaes. O material vegetal utilizado constituiu-se de duas cpsulas
de V. planifolia de aproximadamente 20 cm, em incio de maturao, coletadas em
Muqui, Esprito Santo.
O experimento foi realizado em esquema de parcelas subsubdivididas, constitudo

pelas combinaes entre os fatores recipiente (2 nveis: sacola e bandeja, nas
parcelas), substrato (2 nveis: preparado I e preparado II, nas subparcelas) e tipo de
muda (2 nveis: proliferao de gemas axilares e propagao de plntulas in vitro,
nas subsubparcelas), num delineamento inteiramente casualizado, com quatro
repeties de oito plantas.
No fator recipiente foram testados sacola de polietileno preta, apresentando 15 cm

de dimetro e 30 cm de altura, com capacidade volumtrica de 2,8 L e com orifcios
de 5 mm de dimetro, distribudos regularmente no fundo e at a 1/3 da altura,
visando o arejamento e a drenagem do excesso de umidade, e bandeja com 32
clulas, de polipropileno rgido, apresentando 7,0 cm de dimetro de boca, 16 cm de
altura, capacidade volumtrica de 0,28 L e um orifcio de 1 cm de dimetro, no
fundo, para o arejamento e a drenagem do excesso de umidade.
Para o fator substrato foram testados o substrato preparado I, constitudo de uma

mistura de substrato comercial Vivatto Slin Pro-20, musgo e p de xaxim, na
proporo de 3:0,5:0,5 (v/v), e substrato preparado II, feito da mistura de solo, areia
fina lavada, esterco de galinha e serrapilheira de mata, na proporo de 1:1:1:1 (v/v).
As anlises qumicas desses substratos apresentaram os seguintes resultados:
72
substrato preparado I (8,7 dag dm-3 de matria orgnica, pH 6,0, 349,3 mg dm-3 de
P, 560 mg dm-3 de K, 9,0 cmol dm-3 de Ca, 4,5 cmol dm-3 de Mg, 54 mg dm-3 de S,
0,86 mg dm-3 de B, 19,3 mg dm-3 de Zn, 38,4 mg dm-3 de Mn, 3,5 mg dm-3 de Cu e
113 mg dm-3 de Fe) e substrato preparado II (4,1 dag dm-3 de matria orgnica, pH
5,90, 132,6 mg dm-3 de P, 810 mg dm- de K, 3,5 cmol dm-3 de Ca, 1,7 cmol dm-3 de
Mg, 53 mg dm-3 de S, 0,39 mg dm-3 de B, 11,7 mg dm-3 de Zn, 44,1 mg dm-3 de Mn,
4,3 mg dm-3 de Cu e 23 mg dm-3 de Fe). Dois nveis foram utilizados para tipo de
muda de V. planifolia: mudas produzidas a partir de proliferao de gemas axilares
de planta adulta e mudas produzidas por meio de multiplicao de plntulas in vitro.
As variveis morfolgicas avaliadas, aos 90 dias aps o plantio, foram comprimento

total mdio da parte area (CPA), nmero de folhas (NF), nmero de razes (NR),
comprimento mdio da maior raiz (CMR), massa da matria fresca do caule (MFC),
massa da matria fresca da raiz (MFR), massa da matria fresca da folha (MFF),
massa da matria fresca total da planta (MFTP), massa da matria seca do caule
(MSC), massa da matria seca da raiz (MSR), massa da matria seca da folha
(MSF) e massa da matria seca total da planta (MSTP) e relao parte area/raiz
(RPAR). Utilizou-se rgua milimetrada para medio do comprimento da parte area
e comprimento da maior raiz. Para determinao da massa da matria fresca do
caule, da raiz e da folha foi utilizada balana analtica. A massa da matria seca do
caule, da raiz e da folha foi obtida aps secagem individual em saco de papel
colocado em estufa com circulao forada de ar, temperatura de 65C, at atingir
massa constante.
Os dados referentes s variveis analisadas foram submetidos anlise de

varincia. Quando significativos foi utilizado o teste de Tukey (p0,05). As anlises
estatsticas foram feitas com o auxlio do programa Assistat (SILVA; AZEVEDO,
2002).
3.3 RESULTADOS E DICUSSO
Os resultados obtidos na anlise de varincia para as caractersticas avaliadas ao

final de 90 dias aps o plantio das mudas so apresentados na tabela 3.
73
Tabela 3 Resumo das anlises de varincia para comprimento da parte area (CPA),
nmero de folhas (NF), nmero de razes (NR), comprimento da maior raiz (CMR),
massa da matria fresca do caule (MFC), massa da matria fresca da raiz (MFR),
massa da matria fresca da folha (MFF), massa da matria fresca total da planta
(MFTP), massa da matria seca do caule (MSC), massa da matria seca da raiz (MSR),
massa da matria seca da folha (MSF), massa da matria seca total da planta (MSTP) e
relao parte area/raiz (RPAR), de mudas de Vanilla planifolia, provenientes de
micropropagao de gema axilar e plntula, aos 90 dias aps o plantio, em Cachoeiro
de Itapemirim, ES, 2013
Quadrado Mdio
Fontes de variao GL
CPA (cm) NF NR CMR (cm)
ns ns
Recipiente (R) 1 7,54661* 3,11875 0,37845 11,64453**
Resduo a 6 1,1968 2,61205 2,17549 0,59491
ns ns ns ns
Substrato (S) 1 0,89111 0,72903 11,02151 0,23917
ns ns ns ns
RxS 1 2,94031 0,83528 10,3968 0,00185
Resduo b 6 1,28845 3,78834 2,28983 1,95167
ns ns ns
Muda (M) 1 0,02645 6,41715* 2,67961 0,10391
ns ns ns ns
RxM 1 0,26645 0,0034 8,28245 2,79277
ns ns ns
SxM 1 19,845** 0,0075 4,48501 1,7877
ns ns ns ns
RxSxM 1 2,95245 0,10695 10,44245 0,43396
Resduo c 12 1,05285 1,31139 2,86692 1,18016
CV (%) R 15,52 28,01 34,76 35,78
CV (%) S 16,10 33,73 35,66 64,81
CV (%) M 14,56 19,85 39,90 50,40
Quadrado Mdio
Fontes de variao GL
MFC (g) MFR (g) MFF (g) MFTP (g)
ns ns ns ns
Recipiente (R) 1 0,04333 0,00006 0,29313 0,55535
Resduo a 6 0,01127 0,00071 0,05494 0,11476
ns ns ns ns
Substrato (S) 1 0,01937 0,00005 0,06164 0,1376
ns ns ns ns
RxS 1 0,03233 0,00008 0,08011 0,22234
Resduo b 6 0,00642 0,00141 0,05253 0,10289
ns ns
Muda (M) 1 0,00017 0,00003 0,32114** 0,30961*
ns ns ns ns
RxM 1 0,00052 0,00537 0,05545 0,08568
ns ns
SxM 1 0,03123* 0,00776 0,12806 0,39139*
ns
RxSxM 1 0,03984* 0,00195 0,2567* 0,57256*
Resduo c 12 0,00601 0,00113 0,02919 0,0639
CV (%) R 27,76 37,73 55,55 38,60
CV (%) S 20,95 53,09 54,31 36,55
CV (%) M 20,28 47,39 40,49 28,81
Quadrado Mdio
Fontes de variao GL
MSC (g) MSR (g) MSF (g) MSTP (g) RPAR
ns ns ns
Recipiente (R) 1 0,0001 0,00096 0,00117* 0,00249* 0,1301
Resduo a 6 0,00004 0,00075 0,00012 0,00034 3,1552
ns ns ns ns ns
Substrato (S) 1 0,00003 0,00115 0,00005 0,00001 19,8135
ns ns ns
RxS 1 0,00029* 0,00109 0,00026 0,00169* 0,0378
Resduo b 6 0,00003 0,00079 0,00015 0,00026 9,4298
ns ns ns ns
Muda (M) 1 0,00000 0,00058 0,00072* 0,00067 0,3121
ns ns ns ns ns
RxM 1 0,00000 0,00029 0,00013 0,00015 5,2813
ns ns ns
SxM 1 0,00023** 0,00186 0,00038 0,00274** 3,934
ns ns
RxSxM 1 0,00016* 0,0003 0,0008* 0,00188* 12,8271
Resduo c 12 0,00002 0,00073 0,0001 0,00024 4,4788
CV (%) R 26,00 174,37 46,78 30,27 35,01
CV (%) S 22,16 180,04 51,77 26,76 60,52
CV (%) M 17,31 172,74 42,06 25,67 41,71
ns
no significativo a 5% pelo teste F; * Significativo pelo teste F (p<0,05); ** Significativo
pelo teste F (p<0,01); e GL = Grau de liberdade.
74
No houve diferena significativa para as mdias do nmero de raiz (NR), massa da

matria fresca da raiz (MFR), massa da matria seca da raiz (MSR) e relao parte
area/raiz (RPAR), para nenhum dos fatores ou interao entre os fatores
estudados. Entretanto, Lone et al. (2008) constataram que para a varivel nmero
de razes, os substratos fibra de coco e casca de pinus + fibra de coco foram
superiores ao esfagno e casca de arroz carbonizada, no diferindo dos substratos
xaxim e casca de pinus. Assis et al (2011), ao cultivarem orqudea em substratos
base de casca de caf verificaram que no houve diferena entre a casca de caf e
as suas misturas com relao massa seca de razes. Sorace et al. (2013), ao
avaliarem o crescimento de Cattleya (Orchidaceae) em diferentes tipos de
recipientes, observaram que as mudas aclimatizadas em bandeja de plstico com
120 clulas apresentaram maior nmero de razes quando comparado com bandeja
de plstico transparente com tampa.
Para a varivel comprimento da parte area (CPA), houve interao significativa

entre substrato (S) e tipo de muda (M), ao nvel de 1%, em que mudas provenientes
de micropropagao de gema axilar desenvolveram melhor no substrato I e mudas
de micropropagao de plntula apresentaram melhor desempenho no substrato II
(Tabela 4).
Tabela 4 Comprimento da parte area (CPA) de mudas de Vanilla planifolia, em

funo do substrato (S) e do tipo de muda (M), em Cachoeiro de Itapemirim, ES,
2013
CPA (cm)
Muda
Substrato
Gema Axilar Plntula
Substrato I 7,975 aA 6,4575 bB
Substrato II 6,0663 bB 7,6988 aA
Mdias seguidas de letras diferentes minsculas nas colunas e maisculas nas linhas
diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey, em nvel de 1% de probabilidade.
[Substrato I: mistura de substrato comercial Vivatto Slin Pro-20, musgo e p de xaxim, na
proporo de 3:0,5:0,5 (v/v); e Substrato II, feito da mistura de solo, areia fina lavada,
esterco de galinha e serrapilheira de mata, na proporo de 1:1:1:1 (v/v)].
Assis et al. (2005), ao avaliarem a eficincia dos substratos base de coco no

cultivo de Dendrobium nobile, verificaram que nenhum dos substratos diferiram
75
estatisticamente do xaxim em relao altura de planta. Da mesma forma, o

trabalho desenvolvido por Colombo et al. (2005), mostrou no haver diferena
significativa entre xaxim e os demais substratos compostos por p de coco, fibra de
coco e esfagno na aclimatao de hbridos de Cattleya sp. Souza e Jasmim (2004)
concluram que a mistura de mesocarpo de coco triturado e substrato comercial
proporcionou maior desenvolvimento em altura, nmero de folhas e rea foliar, ao
avaliarem o crescimento de singnio em diferentes substratos.
Mudas provenientes de micropropagao de gema axilar apresentaram maior

nmero de folhas (NF), do que mudas oriundas de plntula (Tabela 5).
Tabela 5 Nmero de folhas (NF) de mudas de Vanilla planifolia, em funo do tipo

de muda (M), em Cachoeiro de Itapemirim, ES, 2013
Varivel analisada
Muda
NF
Gema Axilar 6,2181 a
Plntula 5,3225 b
Mdias seguidas de letras diferentes na coluna diferem estatisticamente entre si pelo teste
de Tukey, em nvel de 5% de probabilidade.
Para a varivel comprimento da maior raiz (CMR), houve diferena significativa para
tipo de recipiente (Tabela 6). Isso explicado pelo maior volume de substrato
presente em sacola em comparao com o volume de substrato presente na clula
da bandeja.
Tabela 6 Comprimento da maior raiz (CMR) de mudas de Vanilla planifolia, em

funo do recipiente (R), em Cachoeiro de Itapemirim, ES, 2013
Varivel analisada
Recipiente
CMR (cm)
Sacola 2,7587 a
Bandeja 1,5522 b
Mdias seguidas de letras diferentes na coluna diferem estatisticamente entre si pelo teste
de Tukey, em nvel de 5% de probabilidade.
76
As dimenses do recipiente trazem implicaes de ordem tcnica e econmica,

sendo timas as que harmonizam o custo de produo e a possibilidade de obter
maior nmero de mudas de qualidade. Observa-se, na literatura, que mudas de
espcies perenes cultivadas em recipientes de maior dimenso possuem maior
qualidade (PEREIRA et al., 2010). Esses autores, ao estudarem o efeito de
substratos e tamanho de recipiente no desenvolvimento de mudas de tamarindeiro,
constataram que o substrato composto com esterco de gado, o composto com cama
de frango e o composto com hmus de minhoca proporcionaram mudas de melhor
qualidade em relao ao substrato composto Plantmax, e que o recipiente de maior
tamanho (18 x 30 cm) proporcionou maior produo de matria seca do sistema
radicular.
Silva et al. (2010), trabalhando com diferentes substratos e recipientes na produo

de mudas, verificaram que o maior comprimento de raiz de maracujazeiro amarelo
ocorreu na combinao substrato comercial e recipiente de maior volume. Os
autores acreditam que isso se deva a uma maior estabilidade fsica do substrato.
Santos et al. (2012), tambm trabalhando com o desenvolvimento inicial de mudas
de maracujazeiro, verificaram que o desenvolvimento vegetativo, avaliado por meio
do comprimento das brotaes e nmero de folhas, foi maior em saco de polietileno
em comparao com tubete.
O crescimento em recipiente de maior volume geralmente mais expressivo

(GOMES et al., 2003). Entretanto, Cunha et al. (2005) recomendam o uso de
recipientes de maiores volumes somente para espcies que apresentam
desenvolvimento lento, necessitando permanecer no viveiro por um longo tempo, ou
quando se deseja mudas bem desenvolvidas. Carvalho Filho et al. (2003) indicam
para produo de mudas de jatob, uma mistura de substrato contendo solo, areia e
esterco (1:2:1) em sacos de polietileno (15 x 20 cm) e a pleno sol.
Ocorreu interao tripla significativa para massa da matria fresca do caule (MFC),
massa da matria fresca da folha (MFF), massa da matria fresca total da planta
(MFTP), massa da matria seca do caule (MSC), massa da matria seca da folha
(MSF) e massa da matria seca total da planta (MSTP), conforme tabela 5.
77
Para a interao sacola, substrato I e tipo de muda no houve diferena significativa

para nenhuma das variveis. Na interao sacola, substrato II e tipo de muda
ocorreu diferena significativa para massa da matria fresca da folha (MFF), massa
da matria fresca total da planta (MFTP) e massa da matria seca da folha (MSF).
Na interao bandeja, substrato I e tipo de muda houve diferena significativa para

todas as variveis, com maiores valores mdios para mudas provenientes de
proliferao de gema axilar. J para a interao bandeja, substrato II e tipo de muda
ocorreu diferena significativa para massa da matria fresca do caule (MFC), massa
da matria fresca total da planta (MFTP), massa da matria seca do caule (MSC) e
massa da matria seca total da planta (MSTP), em que mudas provenientes de
micropropagao de plntula apresentaram maiores valores mdios.
Tabela 7 Massa da matria fresca do caule (MFC), massa da matria fresca da

folha (MFF), massa da matria fresca total da planta (MFTP), massa da matria
seca do caule (MSC), massa da matria seca da folha (MSF) e massa da matria
seca total da planta (MSTP), de mudas de Vanilla planifolia, em funo do
recipiente (R), do substrato (S) e tipo de muda (M), em Cachoeiro de Itapemirim,
ES, 2013
M
RxS MFC (g) MFF (g) MFTP (g)
Gema Axilar Plntula Gema Axilar Plntula Gema Axilar Plntula
Sacola x Substrato I 0,4017 A 0,4224 A 0,627 A 0,396 A 1.1184 A 0,8646 A
Sacola x Substrato II 0,4241 A 0,4287 A 0,6919 A 0,3557 B 1,2003 A 0,8538 B
Bandeja x Substrato I 0,4703 A 0,3337 B 0,6316 A 0,2088 B 1,1857 A 0,6038 B
Bandeja x Substrato II 0,2245 B 0,354 A 0,1381 A 0,3266 A 0,3991 B 0,7946 A
MSC (g) MSF (g) MSTP (g)
RxS
Gema Axilar Plntula Gema Axilar Plntula Gema Axilar Plntula
Sacola x Substrato I 0,0242 A 0,0244 A 0,0335 A 0,023 A 0,0700 A 0,0534 A
Sacola x Substrato II 0,0274 A 0,0295 A 0,0398 A 0,0232 B 0,0823 A 0,0721 A
Bandeja x Substrato I 0,0315 A 0,0219 B 0,033 A 0,0106 B 0,0779 A 0,0392 B
Bandeja x Substrato II 0,0138 B 0,0239 A 0,008 A 0,0194 A 0,0306 B 0,0595 A
Mdias seguidas de mesmas letras nas linhas no diferem estatisticamente entre si pelo
Teste de Tukey, em nvel de 5% de probabilidade.
Muitos so os substratos utilizados na produo e, ou aclimatizao de mudas de

orqudeas. O p de xaxim feito com samambaiau (Dicksonia sellowiana Hook)
atende a todos os requisitos fsicos e qumicos de um bom substrato para a
produo de mudas. Entretanto, seu uso est proibido desde o ano de 2001, por
meio da resoluo N. 278, do CONAMA (SANTOS; TEIXEIRA, 2010). Diante desse
78
contexto muitos trabalhos tm sido realizados na tentativa de se buscar alternativas

aos substratos comerciais e ao p de xaxim.
Casca do fruto da mamoneira e fibra de coco foram usadas como substrato na

aclimatizao de mudas micropropagadas de bromlia (COUTO; JASMIM;
CARVALHO, 2012). Casca de caf foi utilizada com o objetivo de avaliar o
desenvolvimento de orqudea hbrida (C. forbesii x C. labiata) x C. labiata (ASSIS et
al., 2011). Diferentes substratos, tais como: fibra de coco, carvo vegetal e casca de
pinus foram utilizados para avaliar o desenvolvimento de clones de BLC Nan Chang
Silk Olimpic Torch, obtidos do cruzamento entre BLC. Bryce Canyon x BLC.
Pamela Hetherington, em que todos foram eficientes para o cultivo de BLC Nan
Chang Silk Olimpic Torch (DRONK et al., 2012).
O substrato preparado II proporcionou os melhores resultados para a maioria das

variveis morfolgicas avaliadas, tornando-se dessa forma uma alternativa ao uso
de outros substratos.
3.4 CONCLUSES
- A combinao de recipiente tipo sacola de polietileno (30 x 15 cm), substrato II

gema axilar pode ser utilizada na produo de mudas de Vanilla planifolia.
- O substrato II, composto de elementos naturais, pode ser utilizado como alternativa
ao uso de outros substratos.
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83
CONCLUSES GERAIS
- Com base nos estudos realizados foi observado que a sacarose influencia todas as
variveis morfolgicas e parmetros fisiolgicos estudados em relao ao
crescimento in vitro de mudas micropropagadas de baunilheira. Observa-se, ainda,
que as concentraes de sacarose utilizadas so suficientes para os estudos dos
aspectos morfofisiolgicos analisados e que as concentraes estimadas de 28,88 a
53,57 g L-1 de sacarose no meio de cultura proporcionam as maiores mdias para
comprimento da parte area, nmero de folhas, nmero de razes, massa da matria
fresca total e massa da matria seca total das mudas de Vanilla planifolia. Tal
estudo pode contribuir para a produo de mudas em larga escala, visto que no
Brasil no h disponibilidade de mudas de Vanilla planifolia e a importao
onerosa e burocrtica.
- A concentrao de 60 g L-1 de sacarose no meio de cultura prejudicial ao

crescimento de mudas de baunilha e a sua ausncia no meio induz a planta a ter
comportamento autotrfico.
- A menor taxa de perda de gua ocorre na concentrao de 15 g L-1 de sacarose.

As mudas podem ter melhor adaptao quando forem cultivadas sob condio ex
vitro.
- O pH no um fator limitante direto para o crescimento das mudas visto que os

melhores resultados dos aspectos morfofisiolgicos tambm ocorreram em pH cido.
- Os dados relativos aos aspectos morfolgicos e fisiolgicos de mudas de Vanilla

planifolia provenientes de micropropagao sugerem a viabilidade tcnica para a
propagao de mudas em larga escala.
- A combinao de recipiente tipo sacola de polietileno (30 x 15 cm), substrato II

gema axilar pode ser utilizada na produo de mudas de Vanilla planifolia.
- O substrato II, composto de elementos naturais, pode ser utilizado como alternativa
ao uso de outros substratos.
84
- Em vista da escassez de estudos comparativos entre mudas provenientes de

gemas axilares e propagao seminfera in vitro de Vanilla planifolia, torna-se
necessria a realizao de novos estudos que busquem avaliar comparativamente o
desenvolvimento das mudas em campo bem como suas produtividades. Ressalta-se
que nesses estudos deve-se levar em conta a metodologia de produo das mudas,
a idade das gemas axilares utilizadas e a qualidade das cpsulas.

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1

JOS ARCANJO NUNES

PROPAGAO IN VITRO DA BAUNILHEIRA (ORCHIDACEAE)

Tese apresentada ao Centro de Cincias

Dados Internacionais de Catalogao-na-publicao (CIP)

Nunes, Jos Arcanjo,

Orientador: Edilson Romais Schmildt.

1. Vanilla planifolia. 2. Carboidrato. 3. Gema Axilar. 4. Substrato. I.

JOS ARCANJO NUNES

PROPAGAO IN VITRO DA BAUNILHEIRA (ORCHIDACEAE)

Tese apresentada ao Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do

Aprovada em 17 de dezembro de 2013.

memria dos meus pais, Edis e Rosa, e da minha irm Penha.

minha querida mulher, Regina, pelo apoio e companheirismo.

Aos meus filhos, Rafael e Fernanda, presentes de Deus na minha vida.

Ao povo brasileiro que com o pagamento de seus impostos me deu a

Ao Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo,

Aos Professores Jos Augusto Teixeira do Amaral e Jos Carlos Lopes e

Aos professores do curso, pelas valiosas informaes passadas e por

Ao casal, Maria Cristina Duchne-Veauvy e Jean-Marie Franois Pascal

Aos agricultores familiares da comunidade da Fortaleza, Muqui-ES, que me

Aos companheiros e amigos, Dr. Omar Schmildt, Dr. Marcos Oliveira

Aos funcionrios do CCA-UFES, Madalena Caetano Capucho, Paulo Cezar

Professora Virginia Silva Carvalho, pela amizade e pelas preciosas

Ao companheiro e amigo Jos Carlos Correa Cardoso, pelo apoio

Ao INCAPER, pela oportunidade de realizar um dos experimentos na

Ao Prefeito Municipal de Cachoeiro de Itapemirim, Carlos Roberto

Vs como aquela baunilha

Do tronco rugoso e feio

Da palmeira - em doce enleio

Como as razes meteu

Da snea no musgo raro,

Como as folhas - verde-claro -

Como as bagas pendurou

L de cima! como enleva

O rio, o arvoredo, a relva

Que inspiram falas de amores!

D-lhe o tronco - apoio, abrigo.

D-lhe ela - perfume amigo,

- Nesse divino existir -

Que os prende, vai-lhes a vida

De uma s seiva nutrida,

Cada vez mais a subir!

Se o verme a raiz lhe ataca,

Se o raio o cimo lhe ofende,

Cai a palmeira, e contudo

Inda a baunilha recende!

Um dia s! _ que mais tarde,

Exausta a fonte do amor,

Tambm a baunilha perde

Vida, graa, encanto, olor!

Antnio Gonalves Dias, 1861.

LISTA DE TABELAS.................................................................................... viii

Tabela 1 - Produo mundial de baunilha (ton)......................................... 12

Tabela 2 - Resumo da anlise de varincia para comprimento da parte

Tabela 3 - Resumo das anlises de varincia para comprimento da

Tabela 4 - Comprimento da parte area (CPA) de mudas de Vanilla

Tabela 5 - Nmero de folhas (NF) de mudas de Vanilla planifolia, em

Tabela 6 - Comprimento da maior raiz (CMR) de mudas de Vanilla

Tabela 7 - Massa da matria fresca do caule (MFC), massa da matria

seca total da planta (MSTP) de mudas de Vanilla planifolia,

Figura 1 - Estrutura qumica da vanilina.................................................... 7

Figura 2 - Distribuio da produo mundial de baunilha, em 2011......... 12