UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ZONA CENTRO BOGOT CUNDINAMARCA

CEAD JOS ACEVEDO y GMEZ

INFORME DE PRCTICA # 1
EXTRACCION DE ADN DE TEJIDOS VEGETALES Y ANIMALES

David Arturo Lpez Nio Cd.: 74084457. Ana Mile Robayo. Cod:. Patricia Bautista. Laura
Martnez. Cod: 1030649608
Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Escuela de Ciencias Bsicas, Tecnologa e
Ingeniera - ECBTI. Reacciones qumica Naturales.
.

OBJETIVOS
Aplicar la teora en el proceso de extraccin de ADN de tejidos animal y vegetal y
en la determinacin de la calidad del mismo.

Observar experimentalmente la estabilidad del ADN con la temperatura y

relacionarla con los procesos biolgicos y sintticos que se han desarrollado.

Comprender las aplicaciones y el impacto que el desarrollo del ADN ha tenido para
el desarrollo de la vida e investigacin.

MARCO TEORICO

xxxxxxxxxxxxxxx

PROCEDIMIENTO

EXTRACCION DE ADN

CARACTERIZACION DE ADN
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BAO DE MARIA

HCL

REACTIVO BIURET

ANALISIS

Extraccin de ADN de tejidos

vegetales y animales

Al tomar muestras de 5cm3 de tejidos

vegetales (cebolla y banano) y animales
(Hgado), y licuarlo en intervalos intermitentes
se busca realizar una homogenizacin del
tejido consistente en romper la uniones
ayudando a liberar el material gentico

Con el fin de precipitar el ADN se adiciona

Etanol permitiendo que se unan los grupos
fosfatos, permitiendo que el ADN se pliegue
sobre si mismos hacindolo insoluble. El
paso sobre la centrifugacin permite que el
ADN, permanezca en el fondo en el tubo
mientras que el etanol es desechado ya sea
por evaporacin.
Caracterizacin del ADN
Reaccin de Biuret con el ADN
La reaccin de Biuret es una reaccin
coloreada (violeta) debida a la formacin de
un complejo de Cu en un medio alcalino en
compuestos que poseen ms de un enlace
peptdico, como las protenas
Para nuestra prctica se logros observar un
anillo violenta en la fase superior para las
muestras de hgado y banano siendo positivo
la presencia pptidos y protenas.
DESNATURALIZACIN
La desnaturalizacin la pudimos observar
cuando pusimos los ADN a un cambio de
temperatura en el bao de mara. La
desnaturalizacin sucede cuando la protena
pierdes las estructuras de orden superior
(secundaria, terciaria y cuaternaria),
quedando la cadena polipeptdica reducida a
un polmero estadstico sin ninguna
estructura tridimensional fija. Producida por
un agente fsico como es el calor.

PREGUNTAS Y EJERCICIOS

1. Por qu se emplea detergente accin del detergente mediante un

lquido para lavar loza en la solucin dibujo
buffer carbonatada?, explique la

Para provocar una lisis celular o rompimiento
que implica la inactivacin de las nucleasas
celulares y la separacin de los cidos
nucleicos de los restos de clula. Es posible
romper la membrana celular e inactivar las
nucleasas intracelulares al mismo tiempo
utilizando soluciones que contengan
detergentes que solubilicen las membranas
celulares y sales caotrpicas fuertes que
inactiven las enzimas intracelulares. En el
caso de este laboratorio se utiliz una
solucin buffer carbonatada, que se prepar
disolviendo 0.75 gramos de NaCl, 2.5 gramos
de NaHCO3 y 1 mL de detergente lquido de
lavar la loza en 60 mL de agua destilada (pH
8). Tras la lisis celular y la inactivacin de las
nucleasas, los restos de clulas se eliminan
fcilmente por filtracin o precipitacin
Figura 2. Accin del detergente
Figura 3. Ruptura de la membrana celular y extraccin
del ADN
2. Para qu licua los tejidos y que
sucede si los licua por mucho tiempo?
Para romper la mayora de las membranas
celulares (membrana plasmtica y positivos presentes en la solucin se vuelven
membranas del retculo endoplasmtico) en
fragmentos que se cierran inmediatamente
formando vesculas pequeas, cerradas. El
objetivo es realizar el procedimiento
cuidadosamente de tal forma que los
orgnulos que se liberan del interior celular
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permanezcan intactos y mantengan la
mayora de las propiedades bioqumicas
originales, lo cual depende en gran parte del
tiempo de licuado ya que si no es suficiente
no se rompen las membranas celulares, pero
si se realiza durante un tiempo prolongado,
se daan estas pequeas vesculas y se
rompe el ADN5. Los mtodos fsicos ms
utilizados son el choque osmtico,
ultrasonidos y homogenizacin (trituracin
mecnica), que en nuestro caso fue la
utilizacin de la licuadora.
3. Por qu se sugiere un mayor tiempo
de licuado para la cebolla que para el
hgado?, Explquelo estructuralmente.
Tanto la clula vegetal como la animal
poseen membrana celular, pero la clula
vegetal cuenta, adems, con una pared
celular de celulosa, que le da rigidez. La
clula vegetal presenta esta pared que est
formada por celulosa rgida, en cambio la
clula animal no la posee, slo tiene la
membrana citoplasmtica que la separa del
medio6 , por esta razn el licuado debe ser
ms prolongado con los tejidos vegetales, ya
que se requiere romper dicha pared celular.
4. Por qu el etanol precipita el ADN?
El etanol limpia el ADN de otras biomolculas
por un proceso llamado "precipitacin", en el
cual el etanol hace que el ADN se deshidrate,
es decir, pierda contacto con las molculas
de agua que lo rodean, aislndolo de la
solucin acuosa para dejarlo libre de
impurezas, esto sucede debido a la atraccin
elctrica entre los grupos fosfato y los iones
lo suficientemente fuertes como para formar
enlaces inicos estables y por tanto la
precipitacin del ADN.
5. Qu tan puro se obtiene el ADN en esta
prctica?, explique qu impurezas puede

tener y que procedimiento podra seguir para
obtenerlo ms puro.
De acuerdo a las pruebas de caracterizacin
el ADN obtenido fue de buena calidad porque
no se detectaron protenas que son una de
las principales impurezas que se, pueden
encontrar sin embargo la cantidad de ADN es
muy bajo. Por ello para mejorar tanto la
cantidad como la calidad del ADN extrado se
puede lograr con modificaciones en:
Tcnicas de homogenizacin de las
muestras
Temperaturas
Cantidad de muestra
Tiempo de centrifugacin.
6. Qu mtodos podra emplear para
cuantificar el ADN obtenido? Nombre por lo
menos dos y explique su fundamento.
Espectrofotomtrica de absorcin UV:
debido a que los nucletidos poseen
mximos de absorcin alrededor de 260 nm.
El mtodo requiere pureza de la muestra, sin
contaminacin significativa de protenas o
solventes orgnicos que absorben a
longitudes de onda cercanas. La desventaja
est en que se generan interferencias por
contaminantes o en la inhabilidad para
distinguir entre ADN y ARN y la insensibilidad
relativa del ensayo.
El ensayo Quant-It PicoGreen dsDNA, un
colorante ultra-sensible, para teir cidos
nucleicos y cuantificar DNA de doble cadena
en solucin. La deteccin y cuantificacin de
pequeas cantidades de DNA es
extremadamente importante en una amplia
variedad de aplicaciones biolgicas. Aquellas
incluye tcnicas de biologa molecular
estndar, tales como sntesis de ADNc (ADN
copia), para la produccin de libreras y
purificacin de fragmentos de ADN para sub-
clonaje, as como tcnicas de diagnstico
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tales como cuantificacin de productos de
ADN implicados y deteccin de molculas de
ADN en preparaciones que contienen
drogas..
7. Por qu el tubo que contiene el ADN
tratado con calor se ve translcido, mientras
que el tubo que contiene la clara de huevo se
ve blanco?
En el tubo con clara de huevo se observa la
desnaturalizacin de protenas, ya que al
encontrarse la albmina en agua, cuando es
sometida al calor se torna opaca y blanca,
formando una masa slida. As, en el tubo
que contiene el ADN, debido a la ausencia de
protena, que finalmente era lo que se
comprobaba, el tubo se observa translucido
porque aun cuando el ADN se desnaturaliza
este no contena protenas
8. Qu diferencias observ entre el tubo que
contiene el ADN tratado con 1 ml de HCL
0.1M y el tubo que contiene la clara de
huevo? explique a que se deben estas
diferencias.
El tubo con clara de huevo adquiere un color
blanco, en forma de un gran granulo, debido
a la desnaturalizacin que sufre la protena
albumina. Nuevamente se comprueba que en
el tubo que contiene ADN no hay protena por
la coloracin que mantuvo la solucin.
9. Qu diferencias observo entre el ADN y la
clara de huevo al reaccionar con el reactivo
de Biuret?, Desde el punto de vista qumico,
a qu se debe esta diferencia?
El Reactivo de Biuret detecta la presencia de
protenas, pptidos cortos y otros
compuestos con enlaces peptdicos con el
cambio de coloracin a violeta o coloracin
rosada cuando hay polipptidos de cadena
corta, por ello la solucin del tubo de ensayo
que contiene la clara de huevo se torn
violeta mientras que la del tubo de ensayo

con el extracto de ADN se mantuvo de tono
azul.
Se usa normalmente como un mtodo
colorimtrico que permite determinar la
concentracin de protenas de una muestra
mediante espectroscopia ultravioleta-visible a
una longitud de onda de 560 nm (Para
detectar el ion Cu2+).
Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y
sulfato cprico (CuSO4), junto con tartrato de
sodio y potasio (KNaC4H4O6*4H2O). El
reactivo, de color azul, cambia a violeta en
presencia de protenas, y vira a rosa cuando
se combina con poli pptidos de cadena
corta. El hidrxido de potasio no participa en
la reaccin, pero proporciona el medio
alcalino necesario para que tenga lugar.
CONCLUSIONES
A pesar de que el ADN se encuentra en todas
las clulas de los seres vivos, un correcto
proceso de extraccin consiste en separar
suavemente el ADN de sustancias no
deseadas que se encuentran en las clulas,
evitando que el ADN se desnaturalice o se
rompa y es considerado el primer paso para
muchos procedimientos que estn
relacionados con la biologa y la bioqumica.
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Existen varias forma de provocar una lisis en
la membrana celular de las clulas
eucariotas, en forma mecnica o en forma
qumica y cuyo objetivo es exponer los
contenidos del ncleo en los que se
encuentran lo cidos nucleicos.
La temperatura y el pH son factores
fundamentales a tener en cuenta al aislar el
ADN ya que al someterlo al pH muy bajos y
altas temperaturas se provoca una
desnaturalizacin o rompimiento de los
enlaces entre los nucletidos.
La reaccin de Biuret es un procedimiento
utilizado para evaluar la concentracin de
protenas y se facilita gracias a los enlaces
peptdicos que se producen con la misma
frecuencia por cada aminocido en el
pptido.
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INFORME DE PRCTICA # 2

EFECTO HIPERCROMICO

David Arturo Lpez Nio COD: 74084457, xxxxxx

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ECBTI. Reacciones qumica Naturales.

OBJETIVOS

Observar el comportamiento del ADN con la temperatura y relacionar el mismo con la

estabilidad.
Relacionar la estabilidad del ADN directamente con la variacin en la temperatura.

Mediante la prctica observar el comportamiento del ADN con la temperatura.

Lograr relacionar de manera dinmica y prctica el desarrollo de la practica con los conceptos
asimilados en procesos biolgicos y sintticos.

MARCO TEORICO

xxxxxx

ANALISIS Y RESULTADOS

PREGUNTAS Y EJERCICIOS 2. Cmo es el comportamiento del

1. Qu le sucede al ADN cuando se
calienta?
Cuando se calienta al ADN de doble hebra se
rompen las fuerzas los puentes de hidrogeno
que mantienen apareadas a las bases
nitrogenadas y por ende unidas las hebras,
por tanto el ADN esta desnaturalizado, similar
resultado se da cuando la disoluciones de
ADN es sometido a pH cido o alcalino, cuyo
resultado es la prdida de viscosidad,
aumento de la absorbancia a 280 nm y de la
alteracin de las interacciones hidrofbicas.
ADN con el calor? Explquelo
mediante una grfica
La grafica muestra el estado nativo de color
azul y rosado en forma de doble hebra,
seguidamente por accin del calor se obtiene
las hebras separadas.
La desnaturalizacin trmica del ADN, se
puede observar experimentalmente por
absorcin de luz ultravioleta debido a que las
bases nitrogenadas absorben luz de longitud
de onda cercana a 280 nm y a medida que se
calienta el ADN y las cadenas se separan,
aumenta la cantidad de luz absorbida, es

efecto se conoce como hipercromicidad. Un
par de bases G-C tiene tres puentes de
hidrgeno, mientras que un par A-T slo tiene
dos. Cuanto mayor sea el porcentaje de
pares de bases G-C, ms alta ser la
temperatura de fusin de la molcula de ADN
Figura 2. Curva de desnaturalizacin del ADN
3. A qu hace referencia
temperatura de fusin del ADN?
La temperatura de fusin (Tm) se define
como la temperatura a la que se ha
desnaturalizado la mitad del ADN de la
muestra que estamos calentando. Por tanto,
cuanto mayor es la densidad del ADN, mayor
es su contenido en G-C y mayor es su
temperatura de fusin (Tm). No todas las
molculas de ADN experimentan el fenmeno
de la desnaturalizacin de igual manera
La temperatura de fusin del ADN, en la
mayora de las especies, vara linealmente
entre 70-100, cuando la proporcin de G-C
sobre el total de nucletidos aumenta entre el
20%-80%. La explicacin a este
comportamiento se encuentra en la mayor
estabilidad de las uniones G-C con tres
puentes de hidrgeno, frente a las de A-T que
poseen dos. De ello se deduce que las
regiones en la cadena de ADN, ricas en
pares A-T, son las primeras en
desnaturalizarse.
Las dobles cadenas de ARN o hbridas ADN-
ARN experimentan el fenmeno de la
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desnaturalizacin, pero muestran una mayor
estabilidad frente a la variacin de la
temperatura. La temperatura de fusin de una
cadena de ARN a pH=7 difiere en ms de 20
con respecto a las de ADN, siendo
intermedias las de los dplex de ADNARN
La estabilidad de la doble hlice del ADN, y
por consiguiente su Tm, dependen de varios
factores, como por ejemplo, la naturaleza del
solvente, las identidades y las
concentraciones de los iones en solucin y el
pH. El Tm tambin aumenta de manera lineal
con la fraccin molar de los apareamientos
de bases G-C, aunque esto no se debe,
como podra esperarse exclusivamente a que
los apareamientos G-C contienen un enlace
de hidrgeno ms que los apareamientos A-T
la
4. Prediga el impacto que tendran las
siguientes condiciones sobre la
temperatura de fusin de una
muestra de ADN nativo
Buffer pH 13 permitira alcanzar la tm
con mayor velocidad
Agua destilada por la fuerza inica
reducida, se produce la separacin de
las hebras que se debe a que la fuerte
repulsin entre las cargas negativas
de los grupos fosfato no es
contrarrestada por los
correspondientes contraiones (Na+ ,
Mg+2).
SDS 10% tanto los puentes de
hidrgeno como las interacciones
hidrofbicas cooperan para formar
una estructura estable. Si se reduce o
elimina cualquiera de estas
interacciones, la estabilidad disminuye
y la Tm es menor
5. A qu se debe la diferencia en
absorcin a 280 nm de las
muestras de ADN tratadas?

La diferencia en los niveles de
absorbancia de luz ultravioleta por parte
del ADN se debe a las bases
nitrogenadas. La absorcin aumenta
cerca del 40% al desnaturalizarse como
consecuencia de la desestabilizacin de
las interacciones electrnicas, para el
caso por exceso de temperatura, lo cual
indica que es un fenmeno cooperativo
en el que el colapso de una parte de la
estructura desestabiliza al resto.
6. En qu muestra se debe presentar
la mayor absorcin a 280 nm y por
qu?
El menor grado de absorcin se produce en
estado de doble hlice, pero cuando se
produce la desnaturalizacin pasando a
estado de hlice sencilla (efecto
hipercrmico) que implica aumento de la
absorbancia. Este proceso de
desnaturalizacin es hasta cierto punto
reversible, para el caso de la
desnaturalizacin por temperatura el efecto
se revierte dejando que la solucin se enfre
a temperatura ambiente, sin embargo este
efecto reversible se perturba si el
enfriamiento se lleva a cabo por un choque
termino. Los resultados de la tabla 2 permiten
observar que la absorcin UV de la solucin
del tubo enfriado en bao de hielo es mayor
que la del tubo que se enfra a temperatura
ambiente y como era de esperarse la
absorcin de ambos es mayor que la
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absorcin de la solucin a temperatura
ambiente
7. Qu impacto tiene el
descubrimiento del
comportamiento del ADN con la
temperatura en el desarrollo de la
investigacin en el campo de la
gentica?
El estudio de dicho comportamiento ha
permitido ampliar las aplicaciones frente a La
manipulacin y uso del ADN en diversas
aplicaciones relacionadas con la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) que permite
amplificar ms de un milln de veces un ADN
obtenido a partir de una regin seleccionada
del genoma, siempre y cuando se conozca
una parte de su secuencia de nucletidos.
Para la PCR se utilizan dos oligonucletidos
sintticos de unos 15-20 nucletidos, estos
oligonucletidos actan como cebadores para
la sntesis in vitro de ADN la cual est
habitualmente catalizada por una enzima
llamada Taq polimerasa, enzima a que en
altas temperaturas es capaz de mantener una
media de extensin de ms de 60 nucletidos
por segundo en regiones ricas en uniones G-
C.
Esta tcnica se utiliza en aplicaciones como
la medicina forense el estudio de material
bilgico.
CONCLUSIONES
Existe una relacin muy estrecha entre la
temperatura y la absorbancia en el ADN,
presentndose una mayor absorbancia al
trabajar a una mayor temperatura, en este
caso 90C, en la cual se desnaturaliza el
ADN rompindose la doble hlice.
BIBLIOGRAFIA
1. M. Somma. Anlisis de la Presencia
de Organismos Genticamente
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Modificados en Muestras de PDF. C Consultado el 30 Octubre

Alimentos Sesin n 4: Extraccin y
Purificacin de ADN. Consultado el 30
Octubre 2017. Disponible en
http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacity
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2. Cuantificacin de ADN y electroforesis
en gel de agarosa. Universidad
nacional de Quilmes. Introduccin a la
Biologa Celular y Molecular. Formato
2017. Disponible en
http://ibcmunq.files.wordpress.com/20
10/03/tp5.pdf Universidad tcnica de
Loja.
3. Cuantificacin de muestras de ADN
mediante el kit Quant. Consultado el
30 Octubre 2017.. Disponible en
http://www.slideshare.net/andrec392/c
uantificacion-demuestras-de-dna-
mediante-el-kit-quant.
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