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Interaes secundrias
Avaliam alteraes que o anticorpo induz no
estado fsico do antignio.
Reao de precipitao
Reao indicada pela formao de um precipitado visvel quando
antignio e anticorpo, ambos solveis, se ligam.
O precipitado constitudo por agregados de antignio em rede com
anticorpos (complexos Ag:Ac ou imunocomplexos).
A mistura de anticorpos tem
que reconhecer diferentes
epitopos do antignio.
PRECIPITADO
Reao de precipitao
Os anticorpos monoclonais tm
especificidade para um nico eptopo, de
modo que, nesse caso, o antignio ser
monovalente, sendo difcil a precipitao.
1
Os anticorpos monoclonais tm
especificidade para um nico epitopo, 15
de modo que, nesse caso, o antignio
ser monovalente, sendo difcil a
precipitao.
15
Reaco de precipitao
afectada por:
Reao
Reaco de precipitao
de precipitao
Valncia do anticorpo (nmero de locais de ligao que cada anticorpo
afectadatempara
por: afetada pela:o que depende da sua classe estrutural)
o antignio,
Valncia do anticorpo (nmero de locais de ligao que cada anticorpo tem
Valncia do anticorpo (nmero de locais de ligao que cada anticorpo
para o antignio,
tem para o antignio, IgM
o que depende da sua classe estrutural)
IgD
o que depende da sua classe estrutural)
2 eptopos 6 eptopos
2 epitopos
2 epitopos Valncia do Ag= 2 6 epitopos
Valncia do Ag= 4
6 epitopos
Valncia
Valncia Ag =2 Ag = 2 Valncia Ag = 4 Valncia Ag = 4
Ambas as valncias tm de ser 2 para que ocorra precipitao.
Ambas as valncias tm de ser 2 para que ocorra precipitao.
Ambas as valncias tm de ser 2 para que ocorra precipitao.
16
16
8
Precipitao em gel
Mtodo que permite observar reaes de precipitao atravs da difuso do
antignio e/ou do anticorpo um em direo ao outro em meio semi-slido (agar
ou agarose)
IMUNODIFUSO
Simples Dupla
Um dos componentes (o Ag ou o Ac) permanece fixo ao suporte Tanto o Ag como o Ac so mveis, difundem-se
(agar) enquanto o outro se difunde at haver precipitao do um em direo ao outro at ocorrer precipitao
complexo.
2
2. IMUNODIFUSO LINEAR DUPLA
(Oakley e Fulthorpe, 1953)
(Mancini e Fahey,
(Mancini 1965) 1965)
e Fahey,
Colocam-se concentraes definidas de antignio (ou anticorpo) em pequenos poos abertos numa placa de
agar que contm fixo o anticorpo respectivo (ou antignio); o antignio difunde-se de forma radial e precipita
aps reaco com o anticorpo formando-se um anel de precipitao cuja rea pode ser determinada. O
Mtodo
quadrado doque permite
dimetro quantificar
do anel de precipitao antignio
proporcionalou anticorpo.
concentrao do antignio.
Mtodo que permite quantificar Ag ou Ac. Colocam-se concentraes definidas de antignio (ou anticorpo) em pequenos poos abertos numa placa de
agar que contm fixo o anticorpo respectivo (ou antignio); o antignio difunde-se de forma radial e precipita
aps reaco com o anticorpo formando-se um anel de precipitao cuja rea pode ser determinada. O
Imunodifuso
Colocam-se concentraes definidas de Ag(ou radial simples quadrado do dimetro do anel de precipitao proporcional concentrao do antignio.
determinada.
Colocando em simultneo amostras com 21
21
Imunologia Oral TP
Imunodifuso radial simples
Aula 5 e 6 MaroAnel
2012de
precipitao
Poos onde so
colocados
Agarose
IgG anti-IgG padres e
Utilizao: dosagem de IgG, IgAcontendo
e IgM e protenas sricas. amostras a
anticorpos serem doseadas.
anti-IgG humana Poos onde so
Agarose
contendo
IDR colocados
padres e
amostras a
anticorpos serem doseadas.
Anel de anti-IgG humana
Imunodifuso radial simples precipitao
Medio dos halos de precipitao
Medio dos anis de precipitao
IgG anti-IgG
22
Poos onde so
colocados
Agarose padres e
contendo amostras a 22
anticorpos serem doseadas.
anti-IgG humana
11
22
11
Determinao da concentrao da 23
Determinao da concentrao
da protena com auxlio da
curva de calibrao feita com
os padres (de concentrao
conhecida).
24
3
IDR
IDR
Padres Amostras
Aneis de
Precipitao A B C a b c
Curva Padro
4
Imunologia Oral TP Aula 5 e 6 Maro 2012
1 2
25
Ag Ag
Ac
26
13
5
Reao de identidade
Antignios com eptopo 1
1 1
1 1
Precipitado
Anti-1-1
Antisoro anti-1
Reao de no identidade
Anti2-2 Anti1-1
Ag 1 2 Ag
com com
Eptopo 1 Eptopo 2
1 2
pp Anti1-1
pp Anti2-2
Anti2 Anti1
Ag com 1 2 2 Ag com
eptopos eptopo 2
1e2 2
2 1
1 1/2
Precipitado
Anti2-2
Precipitado
Anti1-1,2 e
Anti2-1,2
Anti2 Anti1
6
Imunologia Oral TP Aula 5 e 6 Maro 2012
Imunologia Oral TP Aula 5 e 6 Maro 2012
[b] <
[b] > [b] <
[b] >
33
33
Imunodifusoradial
Imunodifuso radialdupla
dupla
Aplicao: Evoluo dos passos de purificao de uma protena
Aplicao: Evoluo dos passos de purificao de uma protena
Poo1-
Poo 1-material
materialaapurificar
purificar
Poo2-
Poo 2-apresenta
apresentauma
umabanda
bandaa amenos
menosquequeo o
11(2(2 mais
mais puro
puro que
que 1).1).
Poos33ee44 apresenta
Poos apresentasomente
somentea abanda
bandacontnua
contnua correpondente
correpondente albumina
albumina
(Protena pura).
(Protena pura).
34 34
1717
Anti-soro 1
Antignio
(concentrao
Anti-soro 2 constante)
1 1
Ttulo do anti-soro 1 = =8 Ttulo do anti-soro 2 = =4
1 1
8 4
35
7
Para pensar ...
Antignio
(concentrao
Anti-soro 2 constante)
1 1
Ttulo do anti-soro 1 = =8 Ttulo do anti-soro 2 = =4
1 1
8 4
35
Anti-1,4 Anti-3,4
36
18
IDR- simples vs dupla
Difuso simples
O meio de suporte (gel) contm um reativo
em concentrao uniforme
Apenas os desconhecidos se movem atravs
do gel
Difuso dupla
O gel inerte (no contm reativos)
Quer o Ag, quer o Ac difundem-se atravs do
gel.
2. ELETROIMUNOENSAIOS
Contra-imunoeletroforese (CIE)
Imunoeletroforese (IEF)
8
a. CONTRA-IMUNOELETROFORESE
ou
IMUNOELETROFORESE DUPLA, UNIDIRE-
CIONAL (CIE)
+ +
- -
c. IMUNOELETROFORESE SIMPLES
UNIDIRECIONAL DE LAURELL (rocket)
9
d. IMUNOELETROFORESE (IEF)
1. Electroforese separao dos AGs 3. Imunodifuso com o anti-soro e pp
Protenas individualizadas
Amostra
Linhas de pp
finais obtidas
Soro padro
2. Colocao do anti-soro
Anti-soro
d. IMUNOELETROFORESE (IEF)
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IMUNOFIXAO
AMOSTRAS POSSVEIS: soro, urina, LCR (lquido cefalorraquidiano)
REAES DE PRECIPITAO
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