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Tcnicas serolgicas
com base na deteco de reaces antignio-anticorpo
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Isolamento de PBMC
(Peripheral blood mononuclear cells)
cells)
Sangue Plasma
Por centrifugao em gradiente de Ficoll-Hypaque
Definio: Substncia
Constituio: coloidal com colorao
amarela plida
Componente Lquida (55%) : Plasma
Plasma
Componente Slida (45%) : PBMC91%
contm
Elementos Figurados (PBMC) gua
Ficoll
linfcitos e
moncitos
9%
Plaquetas Protenas
Leuccitos Ies
Eritrcitos Substncias nutritivas
Gases
1. Diluio do sangue em PBS (phosphate Produtos de degradao
buffer saline).
2. Adio do sangue diludo no topo do ficoll (cuja densidade maior do que a
dos linfcitos, mas inferior dos eritrcitos e granulcitos).
3. Aps centrifugao, os eritrcitos e granulcitos descem atravs do ficoll
formando um pellet no fundo do tubo.
4. As clulas mononucleadas do sangue perifrico (linfcitos+moncitos) ficam
na interface (anel) entre o plasma e o ficoll. 20
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Fraccionamento de PBMC
(Peripheral blood mononuclear cells)
Centrifugao
Separao magntica
Cromatografia de afinidade
Citometria de fluxo
FACS
1
1. Centrifugao
A centrifugao uma operao
unitria para separao de duas
fases (camadas separadas) duma
mistura, por aco da fora
centrfuga a que fica sujeita,
quando em movimento de rotao .
Centrifugao Diferencial
Tcnica introduzida por Albert Claude, em 1940
Definio:
Partculas so separadas de acordo com a forma, densidade e
tamanho e segundo passos com aumentos gradativos no tempo e
na velocidade de centrifugao.
Aplicaes:
Utilizada na separao das clulas sanguneas do plasma (o
plasma fica no cimo do tubo e as clulas sanguneas, devido sua
maior densidade, depositam-se no fundo do tubo centrfuga).
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Centrifugao de Gradiente
Tcnica introduzida (1950) por N. G. Anderson e M. K. Brake
Definio:
Separao de partculas com base na sua massa e forma
numa soluo de densidade (de sacarose) e/ou concentrao (de
sais) crescente.
Princpio:
A amostra colocada no cimo do tubo e durante a centrifugao
migra de acordo com a sua velocidade e sedimentao.
Ficoll
Polmero de hidratos de carbono e metrizamida
Gradiente de Ficoll-Hypaque
Mistura de solues de concentraes
progressivamente crescentes que se distribuem
ao longo do tubo de centrfuga, ficando as
solues de maior densidade no fundo.
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Centrifugao em
Gradiente de Ficoll-Hypaque
PBMC
contm
linfcitos e
moncitos
4
Contagem das clulas no hemocitmetro
N de clulas contadas: 48
Volume de suspenso celular: 10 ml
A suspenso celular inicial foi diluda 1:1 (0,1ml suspenso + 0,1 ml de meio)
antes da contagem
Determinao de n clulas/ml
Utilizando o n obtido (482), multiplicamos por 1x104 factor do hemocitometro e
por 2 (factor de diluio):
2. Separao magntica
Mtodo de isolamento de populaes celulares pela
utilizao de anticorpos monoclonais contra molculas da
superfcie das clulas conjugados com beads magnticas.
5
2.2 Separao magntica indirecta
Usada quando no existem
microbeads directas.
Vantagens:
rapidez
excelente pureza
enriquecimento de clulas raras
viabilidade e funo das clulas no
so afectadas.
Clulas no desejadas so
marcadas magneticamente e
eliminadas da mistura celular.
Utilizao:
remoo de clulas indesejadas
se no desejvel ligao do AC
s clulas-alvo
subsequente isolamento de uma
subpopulao celular atravs de
seleco positiva.
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3. Cromatografia
Cromatografia de Afinidade
4. Citometria de fluxo
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CITOMETRIA DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
I-
II-
III-
CITOMETRIA DE FLUXO
I- Fludos:
Injeco da amostra no lquido de envolvimento (sheath
fluid), passando por um orifcio central do fluxo (50-300
Rm).
As partculas flem no centro no se misturando com o
restante liquido de envolvimento.
A amostra injectada em fluxo laminar.
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CITOMETRIA DE FLUXO
II- ptica:
Lmpadas de mercrio
CITOMETRIA DE FLUXO
Sistemas de deteco:
Medem a luz que vm dos componentes das clulas
CITOMETRIA DE FLUXO
Sistemas de deteco:
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CITOMETRIA DE FLUXO
1 2
CITOMETRIA DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
10
CITOMETRIA DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
FLUORESCNCIA
CITOMETRIA DE FLUXO
FLUORESCNCIA
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CITOMETRIA DE FLUXO
FLUORESCNCIA
CITOMETRIA DE FLUXO
III- Electrnica:
Processamento electrnico do sinal gerado nos sensores
que traduzido num histograma ou dot plot.
CITOMETRIA DE FLUXO
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CITOMETRIA DE FLUXO
Um fluorocromo encontra-
se ligado a um AC que vai
reconhecer o receptor
celular, para o qual
especfico, aps incubao
das clulas com esse AC.
A intensidade de
fluorescncia representa a
quantidade desse compo-
nente (receptor da superf-
cie celular, molculas intra-
celulares, DNA, RNA)
CITOMETRIA DE FLUXO
Dot Blot
CITOMETRIA DE FLUXO
Histograma
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CITOMETRIA DE FLUXO
Anlise segundo
disperso de fluorescncia:
Histograma:
- intensidade de fluorescncia
- percentagem de clulas que
expressam um marcador
Dot plot:
- percentagem de clulas que
expressam um ou dois
marcadores.
- Correlao com 2 marcadores.
> Intensidade
de fluorescncia
CITOMETRIA DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
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CITOMETRIA DE FLUXO
reas de aplicao
Imunologia
Hematologia
Anatomia patologica
Biologia celular
Oncologia
CITOMETRIA DE FLUXO
Aplicaes na Imunologia
Citometria deCITOMETRIA
Fluxo DE FLUXO
Aplicaes na Imunologia
APLICAES NA IMUNOLOGIA
55
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Citometria de Fluxo
Aplicaes na Imunologia
55
CITOMETRIA DE FLUXO
Citometria de Fluxo
Aplicaes na Imunologia
APLICAES NA IMUNOLOGIA
Anlise de moncitos
Anlise de moncitos
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28
CITOMETRIA DE FLUXO
Citometria
APLICAES NA de Fluxo
IMUNOLOGIA
Aplicaes na Imunologia
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CITOMETRIA DE FLUXO
Citometria
Citometria dede fluxo
fluxo
Mede propriedades de clulas num fluxo.
Mede propriedades de clulas num fluxo.
Fluorescence-Activated Cell Sorter
(FACS)
Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS)
Separa as clulas com base nas propriedades
Instrumento
medidas emque permite separar clulas com base na
fluxo.
citometria de fluxo.
58
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29
FACS
Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS)
Permite separar subpopulaes de linfcitos com base nas diferentes protenas
expressas a superfcie (ex: clulas B, clulas T CD4+, clulas T CD8+)
Cada tipo celular e marcado com um AC especifico que se encontra acoplado a
um fluorocromo.
O citmetro de fluxo detecta e conta individualmente as clulas que passam
atravs do laser.
Os sinais gerados pelos detectores criam uma carga elctrica (+ ou -) no fluxo de
clulas que, entretanto, quebrado, gerando gotas constitudas por uma nica
clula.
As gotas, por terem uma carga elctrica, vo ser desviadas ao passarem por
placas carregadas: as gotas carregadas positivamente so atradas pela placa
negativa e vice-versa, sendo assim separadas e conduzidas para os tubos de
colheita respectivos. As gotas no carregadas (que no contm clulas ou
aquelas cujas clulas no cumprem os critrios pr-seleccionados de
fluorescncia e tamanho) so transferidas para um outro tubo de colheita.
FACS
FACS
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Componentes da Resposta Imunolgia
Adaptativa (especfica de AGs)
Caracterizao da
especificidade, frequncia e
funo dos linfcitos
MTODOS
Deteco da activao das clulas de modo a exercerem
uma funo em particular (secreo de citoquinas,
citotoxicidade).
Deteco directa das clulas atravs do seu receptor.
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Determinao da frequncia dos linfcitos
especficos de antignio
PROLIFERAO de LINFCITOS
em RESPOSTA a MITOGNIOS
Antignios
Induzem a mitose somente em
linfcitos especficos para esse
Ag.
Mitognios policlonais
Substncias que induzem a
mitose em linfcitos de diferentes
especificidades e origens clonais.
So estmulos no especficos.
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MTODOS PARA AVALIAR A PROLIFERAO
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Resposta proliferativa linfocitria avaliada por incorporao de
5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) no ADN de clulas em diviso
Imunologia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011
Clulas CD8+
que proliferaram
Resposta proliferativa linfocitria avaliada por
incorporao de 5-
5-bromo
bromo--2-deoxiuridina (BrdU)
no DNA de clulas em diviso
Resposta
Clulas CD8+ proliferativa linfocitria avaliada por
que no proliferam Clulas CD8-
incorporao de 5- 5-bromo
bromo- -2-deoxiuridina (BrdU)
que proliferaram
no DNA de clulas em diviso
Clulas CD8+
que no proliferam Clulas CD8+
que proliferam
Clulas pancreticas em
Clulas pancreticas
proliferao
9 em
9
proliferao
5
Imunologia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011
Ensaio ELISPOT
(Frequncia de clulas T especficas)
Variante do ELISA em que anticorpos imobilizados em placas so usados para
capturar citocinas secretadas por clulas T individuais. 21
1. Estimulao das clulas T com o antignio
de interesse.
Ensaio
Ensaio ELISPOT
ELISPOT
ELISPOT
(Frequncia dede
(Frequncia clulas T(Freq.
clulas de clulas T especficas)
especficas)
T especficas)
Variante dodo
Variante ELISA emem
ELISA que anticorpos
que imobilizados
anticorpos emem
imobilizados placas soso
placas usados para
usados para
capturar citocinas
capturar secretadas
citocinas porpor
secretadas clulas T individuais.
clulas T individuais.
1. 1.Estimulao
Estimulaodasdas
clulas T com
clulas o antignio
T com o antignio
de interesse.
de interesse.
2. 2.Adio dasdas
Adio clulas T estimuladas
clulas a poos
T estimuladas de de
a poos
microplacas
microplacasrevestidos comcom
revestidos anticorpos parapara
anticorpos
a citocina a ser
a citocina medida.
a ser medida.
As Asclulas T activadas secretam
clulas T activadas secretam
citocinas que sero capturadas pelos
citocinas que sero capturadas pelos
anticorpos imobilizados.
anticorpos imobilizados.
3. Remoo das clulas aps um perodo de
3. Remoo das clulas aps um perodo de
tempo.
tempo.
4. Adio de um segundo anticorpo anti-
4.citocina
Adio marcado
de um segundo com anticorpo e,
enzima anti-
citocina
posteriormente, marcado compara enzima
do substrato, revelar o e,
posteriormente,
crculo de citocinas doemsubstrato, para revelar
volta da posio de o
cada clula T activada (correspondente de
crculo de citocinas em volta da posio
cada clula
formao de um T activada
ponto -spot(correspondente
- colorido). Cada clula
formao de um ponto -spot - colorido). Cada clula
secretora de
5. O clculo da frequncia de clulas T que secretora
citocinas d de
5.secretam
O clculo
umadadeterminada
frequncia citocina
de clulas T que
feito citocinas
origem a umd
secretamcada
contando uma spot
determinada citocina ofeito
e considerando
contando cada T inicialmente
spot e considerando origem
nico a um
spot.
nmero de clulas adicionado o
nmero de clulas T inicialmente adicionado
placa. nico spot.
placa. 12
12
6
6
Desvantagens
Desvantagens das
dastcnicas
tcnicasde
de
Cultura
Culturadede
diluio limitante
diluio e ELISPOT
limitante e
ELISPOT
No avaliam o fentipo das clulas.
SOLUO:
Tcnica com base na citometria de fluxo que
permite SOLUO:
detectar citocinas marcadas com
Tcnica com base na
fluorescncia citometria
dentro de fluxo
de clulas que permite detectar
T activadas.
citocinas marcadas com fluorescncia dentro de clulas T
activadas.
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2. As clulas so fixadas para manter as protenas no interior das clulas e nas membranas celulares
aquando da subsequente permeabilizao.
3. As clulas so permeabilizadas para que anticorpos anti-citocinas marcados com fluorocromos tenham
acesso ao interior da clula.
4. As clulas podem tambm ser incubadas com anticorpos (marcados com outros fluorocromos) que se
ligam a protenas da superfcie, o que permite avaliar que subpopulaes de clulas T produzem uma
ou mais citocinas.
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munologia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011
R2
Definir a % de clulas
R1
produtoras de citocinas
numa populao.
CD3
Clulas CD8-
Produtoras de IL-2
Clulas CD8+
Produtoras de IL-2
Caracterizar
fenotipicamente a clula
produtora da citocina.
IL2
IL2
Estudar a produo
simultnea de vrias
citocinas.
Clulas CD8- no Clulas CD8+ no
Produtoras de IL-2
IFN CD8 Produtoras de IL-2
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SOLUO:
Tcnica de captura, na superfcie de clulas T vivas, de
citocinas secretadas marcadas.
SOLUO:
Tcnica de captura, na superfcie de clulas T
vivas, de citocinas secretadas marcadas.
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Captura de citocinas
CAPTURA DE CITOCINAS
(Ensaio de secreo de citocinas)
(Ensaio de secreo de citocinas)
Permite analisar as clulas produtoras de citocinas sem as matar nesse
Permite analisar as clulas produtoras de citocinas sem as matar nesse
processo.
processo.
Clulas T activadas so incubadas com anticorpos hbridos (em que os dois stios
de ligao ao antignio reconhecem diferentes ligandos um marcador especfico da 8
clula T e a citocina em questo).
Se a clula T produz uma determinada citocina, esta capturada antes de se difundir para fora
da superfcie da clula.
Captura de citocinas
(Ensaio de secreo de citocinas) 23
Possibilidade de isolar as clulas secretoras das citocinas
CAPTURA DE CITOCINAS
Captura de citocinas
(Ensaio de secreo de citocinas)
(Ensaio de secreo de citocinas)
Possibilidade
Possibilidade de isolar
de isolar asas clulassecretoras
clulas secretoras de
dascitocinas.
citocinas
Separao magntica
das clulas secretoras
das citocinas.
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ENSAIOS DE CITOXICIDADE
Ensaios de citotoxicidade
Ensaios com base na morte de clulas-alvo causada por clulas T
Ensaios com base na morte de clulas-alvo causada por clulas Tc
citotxicas (clulas T CD8+ activadas).
(clulas T CD8+ activadas).
Ensaio de libertao de 51Cr
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Permite quantificar a
frequncia de clulas T
CD8 especficas para
um dado pptido.
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