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T4 Replicao
Problema Topolgico
Este problema surgiu da necessidade de
desenrolar a dupla hlice para que pudesse ser
replicada. Contudo, desenrolar a dupla hlice era
criada uma grande tenso sendo que esta chegava a
um limite onde no permitia desenrolar mais a
hlice.
Esta tenso poderia ser aliviada se a outra extremidade rodasse mas para
isso seria necessrio cerca de 25 milhes de volta o que se tornaria complicado
num espao to limitado como o ncleo.
Alm disso, o DNA circular no conseguia rodar para aliviar a tenso uma
vez que nem continha pontas livres.
Biologia Molecular 1
Licenciatura em Bioqumica 2 ano
a) Proposto por Watson e Crick, onde uma cadeira parental replicada com
DNA novo, formando uma cadeia hibrida.
b) Segundo este mecanismo a dupla hlice nova foi totalmente copiada de uma
velha.
c) Proposto por Delbruck onde a cadeia desenrola, copiada e volta a enrolar
sendo que a nova cadeia tem fragmentos do DNA parental e outros da nova
cadeia.
Biologia Molecular 2
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Topoisomerases
Enzimas que cortam as cadeias para serem transcritas, resolvendo o problema
topolgico impedindo assim a tenso de toro que se pensava existir. Sendo assim
a replicao pode ocorrer sem desenrolar a cadeia.
Topoisomerase tipo IA (ssDNA): Corta numa volta e a cadeia transcrita sendo
que depois ligada novamente pela DNA ligase. Exemplos: E. coli Topoisomerases I
and III, Topoisomerase III de humanos e leveduras, girase reversa das
arqueobacterias
Topoisomerase tipo IB (ssDNA): Semelhante ao IA e acontece na Topoisomerase
I dos eucariotas
Topoisomerase tipo II (dsDNA): Girases. Quebram duas cadeias da dupla hlice
criando um porto atravs do qual passada um segundo segmento
Biologia Molecular 3
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A B
Replicao
Envolve 3 fases:
- Iniciao: envolve identificao da posio na molcula de DNA
onde se inicia a replicao
- Elongao: eventos que acontecem na forquilha de replicao
em que se copia a cadeia me
- Terminao: vagamente conhecida uma vez que ocorre quando
a molcula me j foi replicada
Iniciao
A replicao comea sempre no
mesmo local sendo ele designado por
origem da replicao. Uma vez iniciada
forma-se as forquilhas de replicao e a
replicao feita de um modo
bidirecional. No DNA linear existem
simultaneamente duas forquilhas de
replicao, sendo que uma para quando
se depara com a outra, e no DNA circular
h apenas uma. No entanto, essas
forquilhas percorrem pequenas
distncias podendo haver 20 000 origens
em todo o cromossoma humano (1 por
150kb).
Biologia Molecular 4
Licenciatura em Bioqumica 2 ano
Biologia Molecular 5
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Elongao
Existem duas complicaes
- As DNA polimerases apenas so capazes de sintetizar no
sentido 5 -> 3 (leading strand) o que significa que tem de
haver um processo diferente para a lagging strand (modo
descontnuo), so replicadas por pequenos fragmentos os
fragmentos de okazaki.
- DNA polimerase no se pode ligar a uma parte qualquer
da molcula para replicar, tem de haver uma parte que
proporcione uma extremidade 3, tem de existir primers.
DNA polimerases
Sintetizam polinucletidos no sentido 5-3. Algumas atuam com o auxlio de
nucleases que degradam polinucletidos hidrolisando a ponte ditiol entre 2
nucletidos. Estas nucleases atrasam o processo mas ajudam a corrigir erros,
havendo um equilbrio entre as duas funes, a da DNA pol e a da nuclease.
Endonucleases destri polinucletidos dentro da cadeia e as exonucleases
destri nas extremidades.
Exonuclease no sentido 3-5 existe em muitos organismos procariotas e
eucariotas o que permite que a enzima remova nucletidos a partir da
extremidade 3 que acabou de ser sintetizada podendo assim corrigir eventuais
erros durante a sntese.
Exonuclease no sentido 5-3 menos comum e devem remover de um
polinucletido que j est ligado cadeia molde, uma vez que esta atividade
Biologia Molecular 6
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Em bactrias
- DNA pol I um polipptido nico que tem como funo a reparao do
DNA e replicao
- DNA pol III tem mltiplas subunidades
Em eucariotas
,, so subunidades principais da DNA polimerase III, sendo que a
primeira relacionada com a atividade da prpria polimerase tratando dos
primers, a segunda uma exonuclease 3-5 e a terceira pensa-se ter um
papel estrutural.
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Primming
Biologia Molecular 8
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Fragmentos de Okazaki
Aps a dio de primer, o DNA pol alfa
adiciona novo DNA isto porque as 2
enzimas esto muito ligadas e depois
entra em ao a DNA pol . Nas
bactrias mais simples porque a
primase no est ligada a nenhuma
enzima.
Ocorre sempre iniciao dentro da
elongao
Apos a formao do complexo
preprimming vem a primase para
formar o primossoma(helicase +
primase).
Primming
A atividade de reviso requer que a polimerizao ocorra apenas quando o
nucletido do terminal 3 est bem emparelhado.
Se tal no acontece, a atividade da 3-5 exonuclease prevalece sobre a 5-3
polimerase.
A polimerizao de um nucletido do terminal 3 bem emparelhado assegura a
fidelidade da cpia. Sntese de ssDNA considerada como um nucletido terminal 5
no emparelhado ento a polimerizao no ocorre.
RNA pol no requer polimerizao o que pode explicar o porque de os primers serem
de RNA e no de DNA.
Helicases
Quebra os pares de bases em ambas as direes para que se d a replicao
necessitando para tal da hidrlise de ATP.
A principal helicase da E.coli a DnaB que percorre a lagging strand quebrando as
ponte de H e gerando a forquilha de replicao enquanto a Topoisomerase vai ativando
a toro.
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Biologia Molecular 10
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Em eucariotas o progresso da
forquilha de replicao realizado
pela helicase e os polinucletidos
separados so impedidos de se
voltarem a ligar pelo RPA.
A sntese do primer diferente nos
eucariotas. Nestes seres a DNA pol
coopera com a primase fazendo
primer de RNA sendo que a DNA pol
alfa prolonga + 20 nucletidos. No
entanto no pode continuar a
replicao porque esta polimerase no
tem PCNA e deste modo a restante
replicao feia pela DNA pol .
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Terminao da replicao
o Terminao em E coli
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Telomerase
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A telomerase uma ribonuclease uma vez que constituda por RNA e protenas
sendo que essa sequencia de RNA que vai expandir os telmeros agindo assim como
transcriptase reversa.
Na sua sequencia de RNA a telomesare tem complemento do microssatlite
existente nos telmeros dos humanos assim sendo a teloresase liga-se a e faz a
extenso
Depois de completar com o DNA que
faltava a telomerase desloca-se e ainda aumenta
mais a cadeia , um aumento rico em Gs.
Para compensar esse aumento por parte
da telomerase na leading strand a DNA primase
alfa sintetiza a cadeia em faltra. Isto requer um
novo primer e por isso o leading fica mais curta
mas no entanto o comportamento total da
molcula de DNA foi mantida. Esta cadeia rica
em C Crich strand .
A telomerase est presente em clulas
embrionrias e reprodutoras e estaminais e no
est presente nas clulas somticas.
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Regulao da replicao
Coordenam o ciclo celular sempre que este muda de etapa, essencialmente
detetam mutaes
- A reputao regulada nas fases G1,S, G2, M
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- Cisplatina: liga-se a guaninas eperde os seus cloros. Isto faz parar a forquilha de
replicao
- Topotecan: inibem a topoisomerase I e a replicao para
- Guanazole: inibe a ribonucleotido redutase no havendo nucleotidos para ser
possvel fazer a replicao.
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T5 Transcrio
Transcrio o primeiro passo da regulao de expresso
A transcrio inicia-se pela interao entre a RNA pol e o promotor que se localiza
imediatamente antes do inicio da transcrio e que onde as protenas se ligam.
Ao avaliar as regies antes dos genes (upstream) pode-se verificar que h regies
muito semelhantes, h uma grande homologia na sequncias regies consenso. Estas
regies so os promotores de transcrio e variam de espcie para espcie embora a
homologia entre eles seja bastante elevada.
Quanto mais estas sequencias forem semelhantes maior a interaao da RNA pol
e do promotor e consequentemente maior a taxa de transcrio o promotor regula
a transcrio (fora do promotor)
H 3 regies consenso:
o +1: um nucletido, normalmente uma purina, G ou A que por vezes
encaixada nas sequncias CAT
o -10 : Pribnow box- TATAAT (TATA box) a regio de inicio da transcrio e
esta presente em todos os promotores
o -35: TTGACA regio de reconhecimento da RNA pol
O espaamento entre estas regies importante, pode haver a insero ou
deleo de nucletidos o que afeta o espaamento. Por exemplo, o espaamento
entre -10 e -35 de 16-18bp em 90% dos promotores.
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Mutaes no promotor
- Mutaes up: aumentam a taxa de transcrio por aumento da homologia da
sequncia ou diminuio do espaamento entre as regies -10/-35.
- Mutaes down: Diminuem a taxa de transcrio por diminuio de homologia da
sequncia ou aumento do espaamento entre as regies -10/-35
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RNA polimerase
o Complexo enzimtico responsvel pela transcrio
o A iniciao e a terminao da sntese de RNA requerem protenas
adicionais
o Procariotas: 1 tipo de RNA pol para sintetiza todos os RNAs
o Eucariotas: RNA pol l: sintetiza rRNA ; RNA pol ll: sintetiza pr-mRNA; RNA
pol lll: sintetiza RNAs mais pequenos (tRNA,rRNA 5s e miRNA)
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Etapas da transcrio
o Iniciao
Inicialmente a holoenzima liga-se ao promotor e a cadeia dupla aberta. Apenas
uma das cadeias copiada.
Se o fator no se desligar temos uma iniciao absortiva: se continuar ligado a
RNA pol vai iniciar a transcrio mas vai haver uma fora que a vai puxar para trs, a
tenso energtica da ligao ao promotor. Ao fim de nucletidos o complexo desliga-
se e no ocorre transcrio
Numa situao normal o fator desliga-se do complexo e gera-se uma tenso
nas cadeias que aliviada por Topoisomerases e girases
Os ribonucletidos so adicionados na forma trifosfatada havendo um ataque
nucleoflico do OH do C3 ao fosfato, promove a sada do pirofosfato e
consequentemente a ligao ditiol.
o Elongao
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o Terminao
1)Terminao intrnseca
H uma sequncia que faz com que a RNA pol deixe de trabalhar. O mRNA adquire
uma conformao tridimensional, forma uma estrutura em loop e a RNA pol desagrega-
se. uma sequncia consenso rica em G-C seguida de 7 ou 8 nucleotdeos U. Quando
chega ao uracilo, ela enrola-se e as sequncias ricas em G-C emparelham-se.
2)Terminao dependente de p
p uma protena em forma de barril com 6 subunidades que se liga ao mRNA e tem
atividade de helicase. Esta protena percorre o mRNA e quando chega RNA pol
reconhece o RNA ligado ao DNA e desagrega-se o complexo.
Estes dois mecanismos podem ocorrer simultaneamente o RNA pol mais rpida
que a protena p. Contudo, quando se forma a estrutura em loop a RNA pol para e d
tempo para a protena p chegar l.
NOTA: a protena p liga-se a uma zona rica em C
T6 Regulao em procariotas
Regulao da transcrio
Feita por fatores proteicos que interagem com a sequencia e pela RNA polimerase.
A transcrio regulada de um gene implica a existncia de cis acting elements. O
elemento cis uma sequncia reguladora que est antes do operados ao qual se pode
ligar uma molcula trans que est codificada noutro local do genoma. O trans liga-se ao
cis e promove a regulao da transcrio.
Essa regulao pode ativar a expresso do gene (regulao positiva por parte dos
ativadores) ou ento pode inativar a expresso (regulao negativa por parte dos
repressores).
Eucariotas tem RNA monocistrnico pois s tem a informao de uma protena e os
procariotas tm RNA policistrnico uma vez que tm informao de vrias protenas.
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Fatores de transcrio
o Gerais:
- So sempre necessrios para fazer a transcrio.
- Participam na montagem do complexo e no
reconhecimento do promotor.
- TFllD: tem a subunidade TBP que reconhece a TATA
box
- TFllH: 9 subunidades, funes de helicase, a TPase
e a Kinase, fosforila CTD e o desenvolvimento da cadeia
dupla, fuso, feito por esta.
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o Reguladores:
- Ligam-se aos elementos distais e proximais
- Aumentam a eficincia de montagem do complexo por interaes com
protenas
- Regula a eficincia da iniciao da transcrio
Como o enhancer estimula o promotor os ativadores (elementos trans) ligam-se
ao enhancer, a molcula dobra de modo a que a TFllD se ligue TATA box e a partir da
ligam-se todos os outros fatores e monta-se o complexo
NOTAS: elementos proximais e distais no substituem o promotor; so colocados
em qualquer direo; podem estar a montante ou a jusante do promotor
o Dominio CTD:
CTD uma cauda da RNA pol ll na posio C terminal. constituda por 52
repeties e durante a transcrio sofre fosforilaes dinmicas nos resduos de serina
nas posies 2 e 5:
- Iniciao: CTD no fosforilada
- Elongao: CTD fosforilada
Quando fosforilada a CTD pode ligar-se a fatores de processamento de mRNA
durante a terminao.
Fosforilao: TFllH e outras quinases
Desfosforilao: Fcp1 fosfatase
o TFllD:
Fator de transcrio que recruta o resto da maquinaria.
Uma das subunidades do TFllD a TBP que se liga TATA box pois se no se
ligarem no ocorre transcrio uma vez que quando se ligam o DNA dobra-se.
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T8 Processamento
mRNA heterogneo: alta heterogeneidade entre transcries a partir do mesmo
gene
a transcrio e a traduo ocorrem simultaneamento em procariotas mas nos
eucariotas no porque a transcrio ocorre no ncleo e a traduo no citoplasma.
H muitas zonas do DNA que no so transcritas para o RNA mRNA hibrido
para alm de haver mais intres do que exes.
A maioria dos eucariotas tm intres e as bactrias e bacterifagos tambm
podem apresentar embora seja rara.
A estrutura de um gene constante em todos os tecidos de um organismo.
A disposio de exes a mesma ao longo do genoma
A posio de intres conservada em genes homlogos de diferentes espcies.
Adio do cap 5
O cap 5 um capacete que se
adiciona na extremidade 5 e confere
molcula uma maior estabilidade pois
protege-a da ao de fosfatases e nucleases.
adicionado ao mRNA.
Sai um fosfato da extremidade 5 por
hidrlise. Fica uma extremidade difosfato ao
qual se liga o fosfato de um GTP. O
nitrognio na posio 7 da guanina sofre
metilao formando o capo.
As riboses dos dois primeiros nucletidos sofrem metilao no OH formando o
cap1 e o cap2.
Implica a guaniltransferase
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Cauda poliadenilao- 3
O mRNA pode ainda ter uma cauda de
poliadenilatos na extremidade 3 que estabiliza a estrutura.
Os nucletidos de adenina no so codificados pelo
DNA mas sim adicionados ao mRNA.
O mRNA clivado por uma endonuclease que
reconhece a sequencia AAUAAA e depois a polimerase
poly-A adiciona os nucletidos.
Splicing
a retirada de intres para produzir mRNA maduro.
A maior parte dos intres comeam com GU e terminam
com AG.
Tm uma sequncia consenso no incio AGGUAGU
e no fim (10 pirimidinas C ou U) seguida por uma base
qualquer um C e um AG.
Para alm destas regies consenso os intres ainda
tm um branch-point (ponto de ramificao) com uma
adenina.
Depois de reconhecido o
intro faz-se a exciso e forma-se
uma estrutura em forma de lao do
intro havendo a quebra da ligao
ditiol.
A estrutura em lao
conseguida pela formao de
spliceossomo, o intro em forma de
lao rodeado por ribonucleo
protenas SnRNPs que reconhecem
os pontos de ramificao e os de
corte e catalisam essa clivagem.
O processo mediado por SMN (survival of motor neurons).
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Splicing alternativo
Os intres e exes so tecido especficos sendo que num tecido pode ser um intro e
noutro uma exo.
Caracteriza funes especificas de uma mesma protena.
T9 Traduo
O mRNA saindo do ncleo cai ser traduzido para dormao de uma protena
sendo que pode seguir duas vias:
1)Pode ser traduzido por ribossomas do reticulo endoplasmtico rugoso e a a
protena exportada para fora da clula na forma de vesculas, passando ainda pelo
complexo de Golgi
2)Pode ser traduzido por ribossomas livres e a a protena permanecer dentro
da clula executando alguma funo.
Na traduo a informao mantm-se.
Hiptese de Wooble
Existem 64 codes possveis, no entanto no h tRNA's suficientes para esses
codes todos: Bacteria tem 30/40 e os animais e plantas tm 50 tRNA.
Ou seja, wooble props que nos anticodes do tRNA 8 dessas bases fossem fixas
e seguiam o modelo de Watson e Crick.
A ultima base segue o modelo de Wooble qual codifica para mais do que um
nucletido, ou seja, um anticodo codifica para vrios codes.
A posio de Wooble a 1 do tRNA e a 3 do mRNA.
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Estrutura do tRNA
Protenas
os aminocidos tem um lado N-terminal e um C-terminal sendo que o primeiro
vai ligar-se ao C-terminal da protena formando-se assim uma ligao peptdica.
A ligao peptdica ocorre sempre entre um grupo amina e um aminocido e um
grupo carboxila do outro. O radical carboxilo perde um OH e a radical amina perde um
H sendo que h produo de uma molcula de gua e os dois aminocidos estabelecem
uma ligao covalente entre o N de um e o C de outro (reao de condensao)
Cdigo gentico
Redundante: existem vrios codes para o mesmo aminocido
No ambguo: nenhum codo codifica duas protenas
Universal: igual para todos os organismos, exceto alguns procariotas
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Ribossoma
Procariotas: 50s (rRNA 23s + 5s + 31 protenas); 30s(rRNA 16s + 21 protenas); 70s
Eucariotas: 60s (28s + 5,8 s + 5s + 50 protenas), 40s (18s + 33 protenas); 80s
Locais catalticos
Iniciao
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Fatores de traduo
Iniciao
- IF3- assegura a fidelidade ao codo AUG
- IF1- facilita a ligao a AUG e o tRNA seguinte
- IF2- ligao das subunidades do ribossoma.
Fatores de iniciao ligam-se pequena subunidade do ribossoma
Elongao
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Terminao
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