FACENDINI, M.R. et al.

| Sector crnico rengln bovinos-, trazabilidad, industria frigorfica

Vol. 6 | N 6 (2016) ISSN 2250-4559

PID 2142
Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus
y Manzanas frente a Patgenos Poscosecha
Visintin, Griselda; Garca, Blanca; Cceres, Carina Mabel; Musante, Carina La;
Ludi Barzante, Luciano Efran; Niz, Matas

AUTORES: Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Entre Ros. (Oro Verde, Entre Ros, Argentina)*-
CONTACTO: gvisintin@fca.uner.edu.ar

Resumen
El control biolgico es el resultado de la actividad de la microflora epfita, que habita la superficie de las
plantas autorregulando poblaciones de patgenos. La hiptesis general de este trabajo plante reducir
la incidencia de podredumbres poscosecha causadas por Penicillium spp. en ctricos y manzanas, si
los frutos son previamente tratados con antagonistas obtenidos de la superficie de los tejidos del hos-
pedero. El objetivo general fue evaluar la capacidad antagnica de la microflora epfita de ctricos y
manzanas frente a Penicillium spp. La propuesta y desarrollo de protocolos para su extraccin, permiti
obtener una abundante y diversa microflora desde los hospederos. Numerosas cepas fueron preselec-
cionadas in vitro por su capacidad para inhibir el crecimiento de Penicillium spp. Mediante protocolos
basados en inoculacin forzada de microorganismos potencialmente antagnicos y propgulos del
patgeno, se seleccionaron las cepas ms prometedoras como antagonistas. En todos los procesos se
consideraron temperaturas de almacenamiento en fro. Simulando comercializacin externa, cultivos
lquidos de antagonistas fueron aplicados por inmersin y aspersin sobre frutas ctricas. Las mayores
eficacias de proteccin biolgica fueron obtenidas con la bacteria NP11: 75% mediante inmersin y 31%
por aspersin en lnea de empaque experimental. En manzanas, la aplicacin de la levadura Mz105 por
inmersin solo logr mantener las frutas asintomticas por siete das.

Palabras clave: biocontrol, podredumbres poscosecha, microflora epfita, ctricos, manzanas

Objetivo General
Evaluar la capacidad bioactiva de la microflora epfita de ctricos y manzanas frente a patgenos pos-
cosecha.

Objetivos especficos
Obtener material vegetal para extraccin de microorganismos epfitos.
Aislar microorganismos desde Citrus sp. adaptados a incubacin en fro.
Aislar microorganismos desde manzana (Malus sp.) adaptados a incubacin en fro.
Preseleccionar microorganismos como antagonistas potenciales de P. digitatum y de P. expansum.
Seleccionar y aplicar sobre citrus y manzanas antagonistas potenciales de P. digitatum y de P. expansum.

* Convenios o acuerdos: 2010 INTA EEA Concordia. Integracin al proyecto especfico: Manejo Integrado de
Enfermedades de Poscosecha en Frutas, del Programa Nacional-FRUTALES, bajo la Coordinacin del Ing. Agr.
MSc. Daniel Vzquez, Cdigo PNFRU-053921 INTA Concordia. 2013: Integracin al proyecto especfico de INTA:
Nuevas Tecnologas para el mantenimiento de la calidad en la cosecha, acondicionamiento y logstica de frutas
frescas, del Programa Nacional-FRUTALES, bajo la Coordinacin del Dr. Enrique Snchez.

Universidad Nacional de Entre Ros | ISSN 2250-4559 | Eva Pern 24; 3260 FIB Concepcin del Uruguay, Entre Ros, Argentina | (58-69) | 58
 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

Marco terico y metodolgico

La hiptesis general de este trabajo plante reducir la incidencia de podredumbres poscosecha causa-
das por Penicillium spp. en ctricos y manzanas, si los frutos son previamente tratados con antagonistas
obtenidos de la superficie de los tejidos del hospedero. El material vegetal necesario para extraer los
microorganismos que habitan sobre citrus y manzanas fue obtenido mediante convenios con INTA,
EEA Concordia y aportes de productores particulares de Entre Ros. Se obtuvieron principalmente de
plantas con un manejo integral de enfermedades y buenas condiciones sanitarias [1].
El material de citrus incluy hojas y frutas de distintas especies, con madurez en distintas pocas del
ao y condiciones ambientales diferentes, a fin de obtener diversidad en la composicin de las pobla-
ciones microbianas. El material de manzana comprendi hojas, flores y frutas de distintos cultivares,
previo almacenamiento en heladera durante 30 das a 5C y en cmaras hmedas [1, 2].
Desde ambos hospederos, los protocolos de aislamiento de los microorganismos, desarrollados en el
Laboratorio de Fitopatologa de la FCA UNER, consideraron incubar las cajas de petri en heladera a 5
C durante 15 das, con el objetivo de prever su adaptacin al fro, condicin similar a la de las cmaras
frigorficas almacenadoras de frutas, donde los microorganismos seleccionados deban manifestar su
antagonismo frente a Penicillium spp. En cada hospedero fuente de antagonistas, se aplicaron distintas
variantes de extraccin. En Citrus: desde heridas provocadas en frutas, desde hojas y desde frutas ente-
ras (frutoplano); mientras que desde el hospedero manzana: a partir de hojas, frutas y flores [3, 4, 5, 6].

Preseleccin de microorganismos extrados

Los microorganismos obtenidos desde el hospedero Citrus fueron preseleccionados por su capacidad anta-
gnica frente a P. digitatum, mientras que los obtenidos desde manzana por su antagonismo frente a P. ex-
pansum. En cada caso se constat la no patogenia de los potenciales antagonistas sobre los frutos tratados.
Como patgeno de poscosecha de Citrus spp. se cont con numerosos aislamientos de P. digitatum
(P141, P138, P ch, P100 y P160) procedentes del mercado local de citrus, de cmaras frigorficas de
productores citrcolas y de la Seccin Fitopatologa de INTA EEA Concordia.
Como patgeno de poscosecha de manzanas, se utiliz una cepa obtenida de frutas del mercado
local, codificada como P. expansum (Pe).
En ambos casos, la preseleccin se bas en dos tcnicas:
1. Tcnica de Preseleccin in vitro por medio de cultivos mltiples [7].
2. Tcnica de Inoculacin forzada de heridas sobre frutas [5, 7, 8, 9].
Las interacciones in vitro entre cada microorganismo potencialmente antagnico y el patgeno Peni-
cillium, se evaluaron mediante las siguientes distancias: D1: entre la lnea de siembra del microorganis-
mo en evaluacin y el borde de crecimiento de la colonia de Penicillium; D2: entre la lnea de siembra
del microorganismo y su propio borde de crecimiento hacia Penicillium; D3: entre ambos bordes de
crecimiento de colonias.
La preseleccin de microorganismos mediante inoculacin forzada de heridas sobre las frutas, en
general permiti detectar las cepas ms promisorias como antagonistas de Penicillium sp. Para ello,
los objetivos planteados fueron:
1. Preseleccionar microorganismos capaces de inhibir las podredumbres causadas por Penicillium sp.
2. Comprobar la no patogenicidad de los microorganismos que resulten promisorios como antago-
nistas potenciales.
Todos los ensayos recrearon las condiciones de almacenamiento a 5C y alta humedad. Se registr
la Incidencia de heridas sintomticas (%) con hidrosis y podredumbres en funcin del tiempo; y a los
27 das la eficacia final de proteccin biolgica de heridas (%) respecto a las heridas testigo.

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|59

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

Algunos de estos ensayos consideraron adems, evaluar el efecto de inculos que contuvieran mez-
clas de microorganismos antagnicos como protectores biolgicos de heridas.
Tratando independientemente los dos hospederos (citrus y manzana) los ensayos finales de selec-
cin de antagonistas se planificaron considerando las siguientes premisas de partida en Control Biol-
gico de poscosecha [1]:
1. LA ESTRATEGIA ES PREVENTIVA
2. NO HAY PROTECCIN SI EL PATGENO LLEGA ANTES A LA HERIDA
Por otro lado, las metodologas de aplicacin de los tratamientos biolgicos [1, 8, 10, 11, 12, 13] con-
sideraron:
- La presencia de heridas producidas durante el proceso de cosecha normal de un productor, como
nicho de la accin patgena y por ende, la posibilidad de acceso del patgeno antes de aplicar el tra-
tamiento biolgico.
- El encerado de las frutas como cierre del proceso normal para mercado.
Para ello se realizaron dos formas de aplicacin de microorganismos antagnicos, ambas simulando
la comercializacin de frutas para mercado externo:

Aplicacin de antagonistas potenciales en citrus por inmersin

Sobre 150 naranjas Valencia Late en madurez comercial y sin tratamientos qumicos de poscosecha, se
evalu la eficacia de proteccin biolgica ejercida por las bacterias preseleccionadas: NP7, NP11, NC16
y NC21 frente a P. digitatum. La aplicacin por Inmersin en caldo nutritivo (CN), con una concentracin
de 107 ufc de antagonista/ml, supona generar presin del caldo durante 1 minuto sobre las heridas de
las frutas, para facilitar el ingreso del antagonista en las mismas. Se consider adems el encerado de
las frutas con cera de origen vegetal (Carnauba, de pH: 6,5), el secado bajo flujo de aire caliente y la
incubacin segn condiciones de comercializacin externa (29 das a +/- 5C y humedad y posterior-
mente 7 das a 22 C y humedad) [7, 12].

Aplicacin de antagonistas potenciales en citrus por aspersin en lnea

de empaque experimental
Se evalu la eficacia de proteccin biolgica ejercida por la bacteria NP11 frente a P. digitatum sobre
510 naranjas Valencia Seedless por aspersin en lnea de empaque experimental, y condiciones de
almacenamiento en cmaras de fro simulando las temperaturas de comercializacin externa. Al igual
que en el ensayo por inmersin, se parti de premisas que consideraron la presencia de heridas produ-
cidas durante la cosecha normal de un productor, como nicho de la accin patgena y la posibilidad de
acceso del patgeno antes de aplicar el tratamiento biolgico.
La metodologa de aplicacin por aspersin del tratamiento biolgico fue la seguida habitualmente
por el personal capacitado de INTA EEA Concordia en la lnea de empaque experimental. El caldo
(CN+NP11) aplicado mediante pulverizadores manuales a presin (reemplazando en la lnea, el pul-
verizado de fungicidas de sntesis) contuvo una concentracin bacteriana de 2,95x108 ufc/ml de caldo.
Despus del encerado, la incubacin en cmaras de refrigeracin fue a 5 C +/- 2 C y 98% de humedad
relativa durante 28 das y posteriormente 7 das a 20 C [7, 13].

Evaluacin en ambas formas de aplicacin

Cada 7 das, cada fruta se evalu como positiva (con podredumbre) o negativa (sin podredumbre). Se
expres como Incidencia de frutas podridas en porcentaje. Este registro permiti calcular la eficacia
de proteccin biolgica de frutas respecto al testigo ([(Incidencia enfermas en Testigo Incidencia
enfermas tratamiento biolgico)/Incidencia enfermas testigo]*100), construir curvas de progreso de la
enfermedad (CPE) y comparar tratamientos epidemiolgicamente.

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|60

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

Adems, se monitore la poblacin adherida de antagonista y patgeno en frutas extras, al momento

de la aplicacin y cada 7 das [7].

Aplicacin de antagonistas potenciales en manzanas heridas por inmersin

Se evalu la eficacia de proteccin biolgica de la levadura MZ105 sobre manzanas heridas, mediante
inmersin en Caldo nutritivo dextrosa para levaduras (NYDB) conteniendo la levadura antagnica y el
patgeno P. expansum (Pe).
Se utilizaron manzanas Red Delicious disponibles en el mercado local. Despus de realizar 5 heridas
de 2mmx3mm en la zona ecuatorial de cada fruta, se trataron por inmersin en la mezcla: Caldo NYD-
B+Mz105+Pe y se incubaron durante 30 das a +/- 5C y en cmara hmeda.
Luego del periodo de incubacin, cada fruta se evalu como positiva (con podredumbre) o negativa
(sin podredumbre) y se registr como Incidencia de frutas podridas en porcentaje.
Con las incidencias de podredumbre en funcin del tiempo se construyeron curvas de progreso de la
enfermedad y se calcularon reas bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE).

Sntesis de resultados y conclusiones

Aislamientos obtenidos desde Citrus sp. adaptados a incubacin en fro [5, 14].
Aislamiento de microorganismos de la microflora presente en heridas realizadas sobre frutas
ctricas: desde un total de 80 heridas de distintas formas y tamaos, provocadas sobre las frutas y
conservadas en cmara frigorfica a 5 y 90-95% de HR durante 30 das, se obtuvieron 21 aislamientos:
3 levaduras y 18 bacterias.
Aislamiento de microorganismos de la microflora presente en hojas de ctricos: a partir de
muestras de hojas de naranja, se obtuvieron 46 aislamientos: 32 bacterias y 14 levaduras.
Aislamiento de microorganismos de la microflora presente en el frutoplano de distintas espe-
cies de ctricos: mediante lavados de naranjas enteras en solucin tampon fosfato peptona, y protoco-
los de extraccin similares a los aplicados en heridas y hojas, se logr obtener adems una coleccin
de microorganismos: de 66 levaduras y 39 bacterias.
El total de los aislamientos fue obtenido por sus aptitudes de crecimiento en medios nutritivos e in-
cubados a bajas temperaturas. Lamentablemente el hecho de haberlos aislado en esas condiciones no
asegur que permanecieran con esas aptitudes de crecimiento, reproduccin e incremento de inculo
suficiente y en poco tiempo. Es posible que esta inestabilidad, sea la responsable adems de generar
variaciones en su futuro accionar como biocontrolador.
Los microorganismos as obtenidos fueron destinados a ensayos de preseleccin por su capacidad
antagnica frente a Penicillium.
Aislamientos desde manzana (Malus sp.) adaptados a incubacin en fro
El total de microorganismos obtenidos desde el hospedero manzana ascendi a 123, de los cuales 44
(35,8%) se obtuvieron desde hojas, 67 (54,5%) desde frutas y 12 (9,7%) desde flores. Dentro de esta
poblacin, la mayora de los aislamientos fueron bacterianos (62%).

Preseleccin de microorganismos como antagonistas potenciales de P. digitatum

1. Preseleccin de microorganismos por Cultivos mltiples in vitro [7]

Estos bioensayos tuvieron como objetivo: Preseleccionar de manera rpida y sencilla, microorganis-
mos epfitos aislados, por su capacidad antagnica in vitro frente al patgeno Penicillium.
Se constat una gran diversidad en las formas de interaccin in vitro entre los microorganismos eva-
luados y P. digitatum (P100) (Fig. 1).

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|61

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

Las interacciones que demostraron el mayor antagonismo in vitro se caracterizaron por la elevada
capacidad del microorganismo evaluado para multiplicarse, crecer y colonizar el medio de cultivo, limi-
tando en consecuencia la capacidad de crecimiento del patgeno P100.
Estas ltimas interacciones permitieron preseleccionar doce microorganismos como los de mayor
actividad bioactiva in vitro frente a P100.

Fig. 1: Interacciones in vitro entre P. digitatum y distintos antagonistas potenciales. Mediciones de las dis-
tancias D1, D2 y D3 en cultivos mltiples

2. Preseleccin de microorganismos por Inoculacin forzada de heridas sobre naranjas

La preseleccin de microorganismos mediante inoculacin forzada de heridas [5, 15] en general permi-
ti detectar las cepas ms promisorias como antagonistas de P. digitatum. Para ello se plantearon los
siguientes objetivos generales:
1- Preseleccionar microorganismos capaces de inhibir las podredumbres causadas por Penicillium
digitatum
2- Comprobar la no patogenicidad de los microorganismos que resulten promisorios como antago-
nistas potenciales.
En los ensayos de preseleccin realizados entre 2010 y 2012, se evaluaron 66 microorganismos (22
bacterias y 44 levaduras). Se realizaron adems ensayos utilizando la mezcla de dos aislamientos
diferentes de bacterias. El bajo nmero de microorganismos ensayados se debi a la escasa capaci-
dad de almacenamiento en fro de las frutas tratadas, a la disponibilidad de frutas de calidad para ser
ensayadas, y fundamentalmente a la prdida de biodiversidad dentro de la coleccin obtenida tanto en

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|62

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

cantidad como en sus cualidades fisiolgicas. Un gran porcentaje de los microorganismos extrados de
la microflora epfita perdi su capacidad para mantener e incrementar su inculo en medios nutritivos
artificiales y bajo condiciones de almacenamiento en fro, a pesar de considerar alternativas como: di-
ferentes medios de cultivo, incubaciones a distintas temperaturas o agregado de extractos de citrus a
los medios o caldos de cultivo. Mediante estos ensayos, no se logr detectar cepas de comportamiento
promisorio o destacado como antagonista y/o fisiolgicamente estable en funcin del tiempo. Esta
estabilidad fisiolgica pretendida en los microorganismos consideraba el mantenimiento en el tiempo
de: su capacidad de reproduccin en medios nutritivos artificiales, de un porcentaje relativamente alto
de proteccin biolgica de heridas y/ o del retraso en el inicio de podredumbres en heridas tratadas
biolgicamente.
En los ensayos de preseleccin realizados en 2013, los aislamientos a evaluar quedaron definidos
mediante las pruebas previas de preseleccin in vitro. Doce aislamientos bacterianos con resultados
promisorios de antagonismo in vitro, se preseleccionaron por inoculacin forzada de heridas. Todos los
aislamientos haban sido obtenidos de la microflora que habita sobre hojas y frutas de naranja, prove-
nientes de zonas productoras de citrus en Entre Ros, Argentina, como Concordia (ocho aislamientos)
y Chajar (cuatro aislamientos).
Inoculando las heridas con los tratamientos bacterianos (Fig. 2), codificados como: NC16, NC21, NP7
y NP11 se registraron las mayores eficacias relativas de proteccin biolgica (42,5%), valor que se en-
cuentra muy por debajo de las eficacias planteadas como objetivo a lograr dentro del proyecto original
(85-90%).
En funcin de cumplir con el segundo objetivo general y como agregado de valor, se constat la NO
PATOGENICIDAD de dichos aislamientos mediante inoculaciones forzadas de heridas, sin la presencia
de inculo patgeno. En todos los casos, las heridas permanecieron asintomticas de podredumbres
poscosecha (sin sntomas de hidrosis o podredumbres y ausencia de signos) y sin evidenciar cambios
en la calidad comercial de las frutas durante 39 das de incubacin en fro.

Fig. 2. Protocolo de inoculacin forzada para proteccin biolgica de heridas en Naranjas Valencia Late

Seleccin Final de Antagonistas Potenciales de Penicillium digitatum

1. Aplicacin por inmersin

Como objetivo se plante evaluar la eficacia de proteccin biolgica ejercida por las bacterias NP7,
NP11, NC16 y NC21 frente a P. digitatum, sobre naranjas Valencia Late sin tratamientos qumicos de
poscosecha, mediante la aplicacin por inmersin.
Inmediatamente despus de la aplicacin por inmersin y secado, el monitoreo de la carga bacteria-
na adherida a la superficie de las naranjas permiti registrar como valor mximo: 7x103 ufc NP7/cm2 de
fruta. Su poblacin descendi despus del encerado de las frutas y a los 7 das de almacenamiento.
Resistiendo el efecto del encerado, la poblacin de NP11 adherida (7,54x101 ufc/cm2 de fruta) registr
un leve aumento (1,52x102 ufc/cm2), nivel que se mantuvo a los 7 das desde la inmersin en el caldo.

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|63

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

Despus de 29 das de incubacin en fro, el 100% de las frutas de los tratamientos, incluyendo al
testigo, se mantuvo sin infecciones visibles, asintomticas.
Despus de este periodo, el cambio en las condiciones de incubacin a 22C y humedad provista
por cmara hmeda, favorecieron la accin patgena del inculo de Penicillium digitatum presente en
heridas, permitiendo el progreso de infecciones latentes (Tabla 1).

Tabla 1. Aplicacin por Inmersin en antagonistas de P. digitatum. Incidencia promedio (%) de frutas con
podredumbre a partir del tratamiento (ddt), bajo distintas condiciones de incubacin. Eficacia de protec-
cin biolgica (%) contra el patgeno

Incidencia promedio (%) de Eficacia de proteccin

frutas con podredumbre a final (%)
partir del tratamiento (ddt)
Tratamientos Incubacin en fro (1-5C) y Incubacin a 22 5 C y
cmara hmeda cmara hmeda
7 ddt 14 ddt 21ddt 29 ddt 32 ddt 34ddt 36 ddt
NP11 0 0 0 0 0 4 4 75
NC21 0 0 0 0 0 4 8 50
NP7 0 0 0 0 4 4 12 25
NC16 0 0 0 0 4 8 20 -0,25
Testigo 0 0 0 0 0 4 16 --

A los 36 das desde la aplicacin de tratamientos biolgicos por inmersin, el testigo (inmerso solo en
caldo CN) present un 16% de incidencia de frutas podridas, evidenciando la carga de inculo presente
en las frutas an despus del lavado y encerado.
Si bien no existieron diferencias significativas (p>0,05) entre los tratamientos, las menores intensida-
des finales se lograron bajo inmersin en NP11 (4%I) y NC21 (8%I). De ambos tratamientos, se destac
la eficacia final de proteccin biolgica de heridas lograda por NP11 (75%) respecto al testigo.
El ajuste de los valores de incidencia (proporcin de frutas con podredumbre) al modelo Gompertz: -ln[-
ln(y)], permiti obtener las tasas de infeccin (rG) para los tratamientos. Mediante integrales definidas entre
los 29 y 36 das, se calcularon las reas bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE) (Tabla 2).

Tabla 2. Variables epifitiolgicas (% de Incidencia a 36 ddt, ajuste al Modelo Gompertz, tasa de infeccin
(rG) y ABCPE) para 4 tratamientos biolgicos de citrus mediante aplicacin por Inmersin

Trat. Inc. Final R2 Mod. Ecuacin de ajuste Tasa (rG) ABCPE

(%) a 36 ddt Gompertz (rea)
NP11 4 0.8 y=(8,1. 10 )
-136 -0,13.t
0,13 0,11
NC21 8 0.8 y=(1,1. 10-329) -0,16.t 0,16 0,18
NP7 12 0.9 y=(2,2. 10 )
-267 -0,16.t
0,16 0,33
NC16 20 0.9 y=(5,2. 10 )
-989 -0,2.t
0,20 0,37
Test. 16 0.8 y=(6,02. 10-1093) -0,2.t 0,20 0,29

Si bien no existieron diferencias significativas (p>0,05), el anlisis epifitiolgico complement y rati-

fic la seleccin de NP11 como la cepa antagnica ms prometedora, logrando la menor tasa de infec-
cin (rG=0,13) y la menor ABCPE (0,11) (Tabla 2).
Su utilizacin comercial, implicara considerar algunas modificaciones factibles en las plantas de
empaque, como la disponibilidad de piletones para inmersin de las frutas.

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|64

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

2. Aplicacin por aspersin en lnea de empaque experimental

Se plante como objetivo: Evaluar la eficacia de proteccin biolgica ejercida por NP11 frente a P. digita-
tum sobre naranjas Valencia Seedless por aspersin en lnea de empaque experimental y condiciones
de almacenamiento en cmaras de fro, simulando las temperaturas de comercializacin externa.
Despus de la bacterizacin y secado de las frutas y antes de encerar, se constat la eficacia de apli-
cacin por aspersin rescatando 8,8x103 ufc de NP11/cm2 de fruta, superando los valores de bacteriza-
cin logrados mediante la aplicacin por inmersin (7,54x101 ufc/cm2). Luego del encerado y secado de
las frutas, se rescataron 6,3x102 ufc de NP11/cm2 de fruta, valor similar al establecido sobre la superficie
de las frutas mediante la aplicacin por inmersin (1,5x102 ufc/cm2).
Durante el perodo de 28 das de incubacin a 5C no se registraron naranjas con sntomas de po-
dredumbre causadas por P. digitatum, incluyendo el tratamiento testigo.
Los sntomas de podredumbre por P. digitatum se evidenciaron al cambiar las condiciones de
incubacin, a 20C durante 7 das (Tabla 3). Los datos de incidencia finales (%) de frutas con podre-
dumbre, a los 35 das desde la aplicacin por aspersin fueron en promedio de 1,6% para el trata-
miento con NP11 y 2,3% para el tratamiento testigo, sin diferencias estadsticas significativas entre
ellos (p>0,05).

Tabla 3. Aplicacin de NP11 por aspersin en lnea de empaque experimental. Porcentaje de incidencia de
P. digitatum luego de 28 das de incubacin a 5C y despus de 7 das a 20C.

Tratamiento Incidencia (%) de frutas sintomticas por P. digitatum

28 das a 5C + 7 das a 20C
NP11 0,00 1,6
Testigo 0,00 2,3

Aplicando NP11 por aspersin, la eficacia de proteccin biolgica de heridas, con respecto al trata-
miento Testigo fue de 31%, al finalizar la simulacin de condiciones de comercializacin externa.
Esto significara que despus de tratar las frutas con NP11 en zona de produccin de origen y viajar
refrigeradas en barco, al llegar a un mercado de destino, con temperaturas de comercializacin de
aproximadamente 20C, se evidenciaran prdidas poscosecha por P. digitatum que seran slo 31%
menores a las registradas en lotes sin tratamientos poscosecha.
Apoyndonos en eficacias citadas por la bibliografa existente [1], que son acordes a los objetivos
planteados originalmente para nuestras investigaciones, el porcentaje de 31% difiere mucho del desea-
do para el control con antagonistas biolgicos de patgenos de poscosecha, ya que consideramos ini-
cialmente el logro de eficacias que reduzcan al menos el 85% de las podredumbres respecto al testigo.
A partir del periodo de incubacin en fro, y durante los 7 das siguientes de incubacin a 20C, el
progreso de las podredumbres fue linear. En este periodo la diferencia entre las tasas de infeccin (rl)
de ambos tratamientos (rl= 0,035 para el tratamiento biolgico y rl= 0,060 para el testigo), permitira
rescatar el efecto de retraso en la velocidad de las infecciones de P. digitatum una vez finalizado el
almacenamiento en fro, tal como ocurri en la aplicacin de NP11 por inmersin.

Preseleccin de microorganismos como antagonistas potenciales de P. expansum

1. Preseleccin de microorganismos por su capacidad antagnica in vitro frente a P. expansum

Mediante la tcnica de cultivos mltiples, se observ y document la evolucin de las interacciones in
vitro de los microorganismos frente a P. expansum a las 24 hs., 5 y 7 das desde la iniciacin del ensayo.
Las distancias D1, D2 y D3 se registraron a los 7 das de interaccin (Fig. 3).

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|65

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

Segn las mayores distancias D1 y considerando al menos 1 cm entre la lnea de siembra y el borde
de Penicillium expansum se preseleccion a la levadura Mz88 para destinar a ensayos de inoculacin
forzada en frutas.

Fig. 3. Detalle de interacciones in vitro entre microorganismos de la microflora epfita de manzana frente a
Penicillium expansum. a) El microorganismo antagnico crece hacia el patgeno y a la vez se genera una
zona de inhibicin entre ambos; b) El patgeno logra crecer hacia la lnea de siembra de otro microorga-
nismo distinto en evaluacin y se genera una zona de interaccin entre ambos donde se observan altera-
ciones morfolgicas en el micelio patgeno.

2. Preseleccin de microorganismos antagnicos de P. expansum mediante inoculacin

forzada en manzanas
Segn los primeros ensayos de preseleccin realizados, el 85% de los tratamientos result ineficaz en
la proteccin biolgica de heridas. Las levaduras Mz105 y Mz123 fueron las de mejor comportamiento
en inoculaciones forzadas frente a P. expansum, aunque ambas registraron muy bajos valores de efi-
cacia de proteccin biolgica [9, 16].
Aplicando la cepa Mz123 se registraron 6 das libres de enfermedad, una eficacia del 53% de protec-
cin biolgica de heridas a los 19 das desde el tratamiento y un ABCPE= 4,355.
Inoculando la cepa Mz105, se alcanz a proteger solo el 25% de las heridas, pero se resaltan los
valores registrados de ABCPE (1,254) y los das libres de podredumbre. MZ105 protegi las heridas
tratadas durante 12 das, impidiendo las podredumbres, lo que podra considerarse beneficioso a nivel
de comercializacin interna de manzanas.
Ninguna de las mezclas de microorganismos ensayadas result eficaz en la proteccin de heridas,
registrndose podredumbres en las heridas, desde los 6 das desde la inoculacin.
Los ensayos finales de preseleccin por inoculacin forzada permitieron evaluar la eficacia de Mz88
y Mz105. Estos permitieron verificar la posibilidad de utilizacin de la levadura Mz105 como protectora
de heridas en manzanas. Mediante su aplicacin, a los 14 das de la inoculacin solo se registr un
10% de heridas con sntomas de podredumbre, mientras que en el tratamiento Testigo P. expansum el
87,5% de las heridas ya presentaba sntomas.
A los 35 das desde la aplicacin, el 40% de las heridas se mantenan sanas, protegidas biolgica-
mente por MZ105.

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|66

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

Seleccin Final de Antagonistas Potenciales de Penicillium expansum

Eficacia de proteccin biolgica de MZ105 sobre manzanas heridas, mediante inmersin en caldo
NYDB conteniendo la levadura antagnica y el patgeno P. expansum
A los 7 das desde la inmersin en el caldo conteniendo a MZ105 + P. expansum, se registr el menor por-
centaje de Incidencia: 25% de frutas sintomticas. Sin embargo, a partir de all las incidencias registradas
alcanzaron valores muy alejados de los pretendidos originalmente en nuestras investigaciones [1] llegan-
do a afectar el 82,50% de las frutas a los 28 das de incubacin en fro. Estos valores descartan la posibi-
lidad de considerar a Mz105 como un antagonista potencial y promisorio de P. expansum en poscosecha.
Bajo las condiciones del ensayo, la aplicacin de la levadura MZ105 result ineficaz para proteger
biolgicamente las frutas del mercado local frente a P. expansum durante la poscosecha.
El anlisis de los resultados obtenidos permiti concluir sobre los objetivos planteados originalmente:
Desde distintos rganos vegetales de manzanas y citrus se obtuvo una abundante y diversa micro-
flora epfita, constituida principalmente por bacterias y levaduras. Su extraccin fue factible mediante
lavados en solucin tampon fosfato peptona, para lograr suspensiones microbianas. Su aislamiento e
incubacin en fro consider la posibilidad de su futura actividad antagnica en cmaras frigorficas. Se
observaron inconvenientes en el mantenimiento de cepas bajo estas condiciones, indicadores de la va-
riabilidad fisiolgica segn el ambiente donde se encuentran y la consecuente prdida de biodiversidad.
Para cada hospedero (citrus o manzana) y segn la interaccin correspondiente entre patgeno y
microorganismo obtenido, la tcnica de cultivos mltiples permiti preseleccionar aislamientos promi-
sorios por su actividad in vitro frente a Penicillium spp.. Su utilizacin permiti escoger algunas cepas
potenciales, cuya capacidad antagnica fue evaluada mediante protocolos in vivo, basados en inocu-
lacin forzada de microorganismos y propgulos del patgeno. Esto permiti constatar que la bioactivi-
dad de un microorganismo evaluada in vitro, no siempre se correlaciona con la lograda en el ambiente
de las heridas, donde est condicionada por la poblacin del antagonista establecida en las mismas, el
efecto de las ceras utilizadas, los jugos liberados y las temperaturas de almacenamiento.
Mediante las dos pruebas previas, se logr reducir el nmero de cepas, que fueron destinadas para
evaluar su eficacia de proteccin biolgica frente a Penicillium spp. sobre un nmero mayor de frutas.
Sobre naranjas, mediante la aplicacin por Inmersin en caldo nutritivo conteniendo una concentra-
cin de 107 ufc de antagonista/ml, la bacteria NP11 protegi el 75% de las frutas, relativas al testigo. El
anlisis epifitiolgico complement y ratific la seleccin de NP11 como la cepa antagnica ms prome-
tedora, logrando la menor tasa de infeccin (rG=0,13) y la menor ABCPE (0,11).
Mediante la aplicacin por Aspersin en lnea de empaque experimental, la bacteria NP11 logr una
eficacia de proteccin biolgica de heridas de 31%, con respecto al tratamiento Testigo, al finalizar la simu-
lacin de condiciones de comercializacin externa. El porcentaje logrado difiere mucho del deseado para
el control con antagonistas biolgicos de patgenos de poscosecha, ya que se consider inicialmente el
logro de eficacias que reduzcan al menos el 85% de las podredumbres respecto al testigo.
Sobre manzanas, mediante Inmersin en caldo NYDB conteniendo la levadura y el patgeno P.
expansum, Mz105 result ineficaz para proteger biolgicamente las frutas del mercado local frente a P.
expansum durante la poscosecha.

Perspectivas a futuro

Existe una necesidad creciente de fitosanitarios amigables e inocuos para la salud humana, animal
y ambiental. Por esta razn el desarrollo de biocontroladores representa una valiosa alternativa para
modelos de produccin agrcola sostenible y a la vez, una oportunidad para el uso racional de la biodi-
versidad [17]. Para que sea una tecnologa factible de ser utilizada, es necesario realizar evaluaciones

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|67

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

cientficas sobre los riesgos microbiolgicos y bioqumicos, con el fin de garantizar la inocuidad de los
alimentos a lo largo de toda la cadena alimentaria, desde la produccin hasta el consumo [18].
En funcin de esto, los resultados obtenidos en este proyecto implicaran realizar acciones previas a
la posible utilizacin comercial de las cepas biocontroladoras evaluadas, como bioensayos que permi-
tan verificar la inocuidad para animales y humanos. Como alternativa, dichas cepas podran ser deriva-
das a Instituciones con equipamientos especficos (bioterios de experimentacin) en INTA, u otras que
cumplan y desarrollen estos protocolos experimentales.

Indicadores de produccin

Como indicadores de produccin el proyecto logr: una publicacin con referato, una presentacin en una
Reunin Cientfica Internacional y diez presentaciones en Reuniones Cientficas Nacionales. La presen-
tacin del Becario de Iniciacin a la Investigacin Luciano Ludi Barzante en Paraguay, fue seleccionada
para Presentacin Oral, por la Secretara de Ciencia y Tcnica de la Universidad Nacional de Entre Ros,
dentro de los trabajos presentados por aspirantes de la Facultad de Ciencias Agropecuarias.
Como actividades de difusin, se particip con 4 trabajos en las Jornadas INEXA: Difusin de Pro-
yectos de Investigacin, Extensin y Actividades Acadmicas de la UNER.
Como Relaciones Interinstitucionales: Se firmaron dos Convenios sucesivos entre la Facultad de
Ciencias Agropecuarias (UNER) y el INTA EEA Concordia, en 2010 y 2013, los cuales permitieron Coor-
dinar y ejecutar actividades del Proyecto con investigadores externos a la UNER, obtener material
biolgico y utilizar equipamiento especfico de poscosecha.
Como formacin de Recursos Humanos se dirigieron: Dos Becarios de Iniciacin a la Investigacin
(UNER); una Tesista de grado (UADER); dos pasantes (UADER, UNSE) y dos Docentes Auxiliares
Alumnos (FCA-UNER)

Bibliografa

1. Garmendia G., Vero S. Control Biolgico de enfermedades de poscosecha. En: MONDINO P.,
VERO S., editores. Control biolgico de patgenos de plantas. Uruguay: Departamento de Publica-
ciones de la Facultad de Agronoma, Universidad de la Repblica; 2006: 97-113.
2. Mondino, P. Control Biolgico. En: Mondino P., Vero S., editores. Control biolgico de patgenos de
plantas. Uruguay: Departamento de Publicaciones de la Facultad de Agronoma, Universidad de la
Repblica; 2006: 21-26.
3. Mondino P. Aislamiento y seleccin de Agentes de control biolgico. En: Mondino P., Vero S., editores.
Control biolgico de patgenos de plantas. Uruguay: Departamento de Publicaciones de la Facultad de
Agronoma, Universidad de la Repblica; 2006: 79-90.
4. Ludi Barzante L. Extraccin de la microflora de manzana para seleccin de biocontroladores de
patgenos poscosecha. En: Libro de Resmenes de las XIX Jornadas de Jvenes Investigadores
Asociacin de Universidades Grupo Montevideo (AUGM); 2011, 25 al 27 de octubre; Ciudad del Este,
Alto Paran, Paraguay: 550.
5. Visintin G., Garca B., Cceres C., Barredo, G. Potencial antagnico de la microflora ctrica adap-
tada a heridas y a bajas temperaturas frente a Penicillium digitatum. En: Lobos E.a., et al., editores.
Libro de Resmenes de las XIII Jornadas Fitosanitarias Argentinas: fitosanidad responsable, base
de la calidad de vida; 2009, 30 de setiembre, 1 y 2 de octubre; Termas de Ro Hondo, Santiago del
Estero, Argentina. Universidad Nacional de Santiago del Estero. PV96.
6. Visintin G., Garca B., Cceres C., Barredo G. El frutoplano de los ctricos como fuente de mi-
croflora potencialmente antagnica de patgenos poscosecha. En: Libro de Actas de V Jornadas

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|68

 VISINTIN, GRISELDA et al. | Actividad Antagnica de la Microflora Epfita de Citrus y Manzanas

Argentinas de Biologa y Tecnologa de Postcosecha; 2009, 27 y 28 de octubre; San Pedro, Buenos

Aires, Argentina. Asociacin Argentina de Horticultura (ASAHO); EEA San Pedro Centro Regional
Buenos Aires norte, Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria. p. 70.
7. Visintin G., Flico L., Garca B. Manejo de mohos poscosecha de ctricos mediante antagonistas
microbianos. Ciencia, docencia y Tecnologa. (2010) 21(40):187-214.
8. Franchessi, V.; Cceres, C.; Visintin, G.; Garca, B. Microflora epfita de manzano como antago-
nista potencial de Penicillium expansum. INEXA 2013. 5tas Jornadas de Difusin de Proyectos de
Investigacin, Extensin y Actividades Acadmicas de la UNER. 2013, 4 de noviembre, Gualeguay-
ch, Entre Ros, Argentina.
9. Niz, M.; Visintin, G. Antagonistas del desarrollo de Penicillium expansum en poscosecha de manza-
nas. En: libro de Resmenes XXI Jornadas Jvenes Investigadores AUGM. 2013, 14 al 16 de octubre.
Corrientes, Argentina. (1): 345-346.
10. Visintin, G., Garca, B., Flico, L. y Garrn, S. Poblacin natural de Penicillium digitatum sobre
diferentes especies ctricas. En: Publicacin electrnica de Resmenes 11 Congreso Nacional SUHF.
3er. Congreso Panamericano Promocin del Consumo de Frutas y Hortalizas. 2007a, 21, 22 y 23 de
mayo, Montevideo, Uruguay. LATU. Publicacin electrnica: 79.
11. Visintin, G., Garca, B., Flico, L. y Ronconi, A. Establecimiento y persistencia de una bacteria
antagonista de Penicillium digitatum en frutas ctricas tratadas con ceras. En: Libro de Resmenes IV
Jornadas de Biologa y Tecnologa de Poscosecha y I Jornadas de Poscosecha del Cono Sur. 2007b,
5 y 6 de julio, Buenos Aires, Argentina. Resumen N 46: 88.
12. Visintin, G. Garca, B.; Flico L., Alcaraz Flico M.e. y Barredo G. Aplicacin Experimental
de una Bacteria Antagnica de Penicillium por Inmersin de Ctricos. En: Libro de Resmenes del
Primer Congreso Argentino de Fitopatologa. 2008 a, 28 al 30 de mayo, Crdoba, Argentina: 222.
13. Visintin, G. Garca, B. Flico, L. Alcaraz Flico, M. y G. Barredo. Eficacia de Aspersin de
un Microorganismo Bioactivo en una Lnea de Empaque Experimental. En: Libro de Resmenes del
Primer Congreso Argentino de Fitopatologa. 2008 b, 28 al 30 de mayo, Crdoba, Argentina: 221
14. Visintin G., Garca B., Cceres C., Ludi Barzante L. Microflora de naranja Salustiana adapta-
da al fro y su actividad antagnica frente a Penicillium digitatum. En: Libro de Resmenes del 2
Congreso Argentino de Fitopatologa; 2011, 1, 2 y 3 de junio; Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina.
Asociacin Argentina de Fitopatlogos, Grfica Tucumn, Mar del Plata. p. 350.
15. Visintin, G.; Garca, B.; Cceres, C., Ludi Barzante, L. y Befani, R. Microflora de naranja adaptada
al fro y su actividad antagnica frente a Penicillium digitatum. Ciencia, Docencia y Tecnologa. (2013)
24 (47): 249-263. Edicin online (ISSN 1851-1716) en www.revistacdyt.uner.edu.ar
16. Garca, B.; Visintin, G.; Cceres, C.; Musante, C.; Ludi Barzante, L. Biocontrol con levaduras
epfitas de manzanas frente a Penicillium expansum. INEXA 2013. 5tas Jornadas de Difusin de
Proyectos de Investigacin, Extensin y Actividades Acadmicas de la UNER. 2013, 4 de noviembre,
Gualeguaych, Entre Ros, Argentina.
17. Rivero, M. Manual para la aplicacin de fitosanitarios. SENASA. Pag 17. Septiembre 2015. En:
http://www.senasa.gov.ar/Archivos/File/File6261-M_fitosan.pdf.
18. OMS. Organizacin mundial de la salud. Inocuidad de los alimentos. Nota descriptiva N 399.
Noviembre de 2014 En: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs399/es/

Agradecimientos
A la Universidad Nacional de Entre Ros que por medio de la Secretara de Investigaciones Cientficas, Tecnolgicas
y de Formacin de Recursos Humanos instrumenta y fomenta la investigacin, contribuye a la formacin de recursos
humanos, permite el logro de nuevos conocimientos, su transferencia al medio y la integracin con profesionales,
investigadores y productores.

Ciencia, Docencia y Tecnologa - Suplemento | N 6 | Ao vi|2016|(58-69)|69