PCR EN TIEMPO REAL

Ignacio Candia Ramos

Diagnstico Molecular
Tecnologa Mdica

Docentes: Pablo Herrera

Ivania Cortes
Estefania Cifuentes

18/10/17
 1. Que es la PCR en Tiempo Real?

Es una variante de la PCR punto final, cuyo objetivo es detectar y cuantificar las secuencias
especficas de cidos nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes en la reaccin.
En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificacin y deteccin se producen de manera
simultnea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna accin posterior (el producto
de amplificacin es monitoreado conforme transcurre la reaccin sin que haya la necesidad
de que sea manipulado en un gel de agarosa para conocer si la reaccin fue exitosa como
sucede en la PCR punto final). Mediante deteccin por fluorescencia se puede medir
durante la amplificacin la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la
emisin de fluorescencia producida en la reaccin es proporcional a la cantidad de ADN
formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cintica de la reaccin de
amplificacin.

2. Fundamento de la Tcnica

El monitoreo de los productos amplificados conforme transcurre la reaccin es un paso

importante en la PCR en tiempo real, para ello la estrategia tecnolgica que ha dado buenos
resultados se cimenta en sistema basados en reporteros fluorescentes. En general, estos
sistemas pueden ser clasificados en dos mtodos diferentes: especficos y no especficos.

Los mtodos no especficos se basan en el uso de molculas intercalantes que tienen

afinidad por el ADN de doble cadena y que al ser oxidados generan una seal fluorescente.
La fluorescencia emitida es capturada en la etapa de extensin de cada ciclo y es
proporcional al nmero de copias de ADN de doble cadena obtenidas en cada ciclo de la
PCR. El reportero ms usado para estos fines se llama SYBR Green, la cual es una
molcula cargada positivamente que, mientras est en solucin sin unirse al ADN de doble
cadena, prcticamente no emite fluorescencia; sin embargo, cuando se une al surco menor
del ADN incrementa hasta 1,000 veces su fluorescencia. Este sistema es muy econmico y
permite el empleo de un solo fluorforo en diferentes ensayos. Sin embargo, presenta varias
desventajas, ya que no es posible hacer reacciones mltiples o multiplex (en donde se
amplifican varios genes en la misma reaccin), adems de que la seal emitida no es
especfica, porque el fluorforo se une a cualquier amplicn del ADN de doble cadena. Por
lo anterior, para un uso correcto del SYBR Green en la PCR cuantitativa es obligatorio
verificar la especificidad de la seal, analizar la curva de disociacin y comprobar que la
seal de fluorescencia obtenida se debe slo a la amplificacin del blanco y no dmeros de
primers que tambin pueden conformar una doble cadena.

Los mtodos especficos y los no especficos, tienen en comn la seal de fluorescencia

emitida para detectar los productos amplificados. Sin embargo, los mtodos especficos
siguen el principio conocido como transferencia de energa de resonancia fluorescente
(FRET, por sus siglas en ingls) para generar la seal; este mtodo consiste en transferir
energa desde un donador o reportero fluorescente a un aceptor o quencher. Cuando el
reportero y el quencher o apagador se encuentran prximos, el apagador absorbe toda la
fluorescencia del reportero. Cuando este par de molculas se separa, la fluorescencia del
reportero no puede ser absorbida por el apagador y en consecuencia puede ser detectada
por el fotodetector Para ello, existen dos mtodos especficos, stos son: pruebas basadas
en hidrlisis y por hibridacin.

Los mtodos por hidrlisis se basan en sondas fluorescentes de oligonucletidos

etiquetados con un reportero fluorescente y un quencher, ambos se encuentran en
estrecha unin mientras la sonda no hibride a su secuencia blanco. Cuando hibrida, ocurren
cambios conformacionales en el reportero y el quencher, lo cual permite que la actividad
exonucleasa 5-3 de la Taq polimerasa rompa esta unin, logrando que la fluorescencia
emitida por el reportero sea liberada y capturada por el equipo.

Los mtodos por hibridacin consisten en una sonda unida a un reportero fluorescente que
est en estrecha proximidad con un aceptor fluorescente unido a otra sonda. Tanto el
reportero como el aceptor presentan un espectro de excitacin y de emisin similar, de tal
forma que cuando las dos sondas hibriden a su templado blanco, el reportero es excitado y
la seal emitida es transferida al aceptor, generando un incremento en la cantidad de
fluorescencia.

Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de
fluorescencia y estn diseados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia
emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificacin.

3. Descripcin del procedimiento

3.1. Mtodo especfico: Sondas de hidrlisis

Entre las ms utilizadas se encuentran las sondas TaqMan que se conocen tambin como
sondas 5 nucleasas (ya que utilizan la actividad 5 exonucleasa de la ADN polimerasa). En
este sistema se utiliza una sonda, es decir, un oligonucletido especfico (~20 bases) para
la secuencia del gen de inters marcado con dos fluorforos, un reportero unido al extremo
5 y un apagador en el extremo 3. La longitud de la sonda es la distancia entre los dos
fluorforos, de manera que la fluorescencia del reportero est apagada por el fenmeno
FRET. La actividad 5 exonucleasa de la ADN polimerasa corta los nucletidos de la sonda
durante la amplificacin, los fluorforos se separan y se observa la seal de fluorescencia.
Es decir, la hidrlisis de la sonda provoca un incremento en la seal del reportero y sta
aumenta proporcionalmente al incremento del amplicn. Algunos ejemplos de fluorforos
reporteros son FAM, VIC y NED, entre los apagadores se encuentran TAMRA, DABCYL y
BHQ.
3.2. Mtodo Inespecfico: SYBR Green

El SYBR Green se une al surco menor del ADN de doble cadena. Mientras ms ADN de
doble cadena haya en el tubo de reaccin, mayores sern la unin y la seal de
fluorescencia del SYBR Green. Durante la alineacin del iniciador, el SYBR Green se
incorpora en la doble cadena. La seal de fluorescencia incrementa de manera proporcional
a las molculas de doble cadena producidas en la amplificacin.
 4. Aplicaciones de la tcnica de PCR en Tiempo Real

La PCR convencional se aplica en diferentes reas de las ciencias biolgicas y de la salud,

formando parte del quehacer cientfico de muchos laboratorios de investigacin que la
utilizan principalmente para expresin gnica, genotipificacin, deteccin de patgenos y
anlisis de mutaciones. Las aplicaciones de la PCR a tiempo real en el campo del
laboratorio clnico no difieren de las que existen para la PCR convencional. No obstante, es
previsible que gracias a sus indudables ventajas y a la sencillez de su empleo, la PCR a
tiempo real vaya reemplazando la PCR clsica, y que su aplicacin se extienda a un
nmero cada vez mayor de agentes infecciosos, implementndose progresivamente en la
rutina asistencial.

En la Investigacin bsica la determinacin del nivel de expresin de los genes ha permitido

asociar cambios de ciertas molculas en una diversidad de procesos fisiolgicos como en la
inflamacin o para predecir recurrencia del cncer. En el genoma humano, el
reconocimiento de polimorfismos de un solo nucletido, SNPs (del ingls single nucleotide
polymorphisms) intenta comprender la complejidad de la respuesta ante las enfermedades
ms comunes, el entender el papel de stos ayudar a disminuir los efectos adversos que
se presentan en ciertos individuos y permitir disear regmenes de tratamientos con dosis
personalizadas.

El anlisis por (RT) PCR en tiempo real puede realizarse a partir de una amplia variedad de
muestras clnicas como tejidos frescos y fijados en parafina, secreciones corporales, lquido
cefalorraqudeo, sangre total, plasma, leucocitos, ma- terial fecal, exudados de garganta,
vaginales o anales, etc. Se pueden detectar diversos microorganismos como virus y
bacterias a nivel cualitativo (presencia o ausencia) y cuantitativo (carga viral). La velocidad
de estas pruebas y el apoyo que dan al diagnstico oportuno y certero le otorgan un valor
agregado. Esta tcnica se puede utilizar de gua en la eleccin del tratamiento apropiado, al
determinar mutaciones que confieren resistencia a medicamentos, como la rifampicina y la
isoniazida, y a los antivirales como ocurre en el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH-1), evitando los efectos adversos por el uso de medicamentos innecesarios por su falta
de efectividad, reduciendo costos y previniendo la hospitalizacin. Adems, esta
metodologa permite el manejo de muestras potencialmente infecciosas. En el caso de virus
peligrosos, la deteccin por (RT) PCR en tiempo real puede realizarse en muestras
inactivadas por esterilizacin, previniendo la infeccin del personal ocupacionalmente
expuesto.
BIBLIOGRAFA

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