FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUIMICA

INFORME

ASIGNATURA : FARMACOGNOSIA

TEMA : TCNICAS DE FRACCIONAMIENTO Y PURIFICACIN

SECCION : 3A

GRUPO : 02

MESA : 02

DOCENTE : Dra. HERRERA HERNANDEZ, Nora Gabriela

INTEGRANTES : Cieza Colunche, Santos

: Rosado Espritu, Jordjit

: Ramos Pariona, Teresa

CICLO : IV

TURNO : NOCHE

LIMA-PERU

2017-II
 Introduccin
La cromatografa es una tcnica que permite separar, aislar e identificar los
componentes de una mezcla de compuestos qumicos. La muestra es distribuida
entre dos fases inmiscibles (slida, lquida o gas), una estacionaria y otra mvil, que
se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto ntimo, de tal forma
que cada uno de los componentes de la mezcla es selectivamente retenido por la
fase estacionaria.
La cromatografa no solo permite la separacin de los componentes de una mezcla,
sino tambin su identificacin y cuantificacin. Se pueden separar molculas en
funcin de sus cargas, tamaos y masas moleculares.
Las tres clases de cromatografa desde un ngulo ms general son cromatografa
de lquidos, cromatografa de gases y cromatografa de fluidos supercrticos. Como
su nombre lo indica, la fase mvil en las tres tcnicas son lquido, gas y fluido
supercrtico respectivamente. En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido
que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. Solo la cromatografa
de lquidos es la que puede llevarse a cabo en columna o sobre superficies planas,
por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercrticos estn restringidas a
los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna
contienen la fase mvil.
La tcnica ms usada es la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), por su
sensibilidad, fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su
idoneidad para la separacin de especies no voltiles y su aplicacin a sustancias
de primordial inters en la industria, como son los aminocidos, protenas, cidos
nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.
 MARCO TERICO
TCNICAS DE FRACCIONAMIENTO
La tcnica cromatogrfica de purificacin consiste en separar mezclas de
compuestos mediante la exposicin de dicha mezcla a un sistema bifsico
equilibrado. Todas las tcnicas cromatogrficas dependen de la distribucin de los
componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase mvil, llamada
tambin activa, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en
relacin con la otra, denominada fase estacionaria. La fase mvil puede ser un
lquido o un gas y la estacionaria puede ser un slido o un lquido.

CROMATOGRAFA DE ADSORCIN:
Dentro de esta tcnica pueden diferenciarse dos tipos
de cromatografas de adsorcin denominadas
cromatografa de columna y de capa fina (abreviada
TLC, del ingls Thin Layer Chromatography).

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA (CC)

Para la tcnica de cromatografa de adsorcin
en columna se emplean columnas verticales de
vidrio cerrada en su parte inferior con una llave
que permita la regulacin del flujo de la fase
mvil. Las columnas se rellenan con un
adsorbente, como almina o gel de slice (fase
estacionaria), mojado con el disolvente que se
vaya a emplear en el proceso cromatogrfico. En
la parte superior de la columna se pone la disolucin de la mezcla a separar
y a continuacin un
 depsito que contenga el eluyente (fase mvil) que se va a utilizar en la
separacin. Se abre la llave inferior de manera que el eluyente comience a
bajar por la columna. En este proceso, los componentes de la mezcla son
adsorbidos por la fase estacionaria con diferente intensidad, de manera que
el proceso de adsorcin-desorcin hace que unos componentes avancen
ms rpidamente que otros. El lquido que sale por la parte inferior de la
columna se recoge de manera fraccionada.
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)
La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de
un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos
esenciales son, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las
placas durante la extensin, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cmara
en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso tambin poder guardar con
facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.
La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase
estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar
que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con
mayor velocidad sern los menos polares. Polaridad de los compuestos orgnicos
en orden creciente:
Hidrocarburos < olefinas < flor < cloro < nitro < aldehdo
Aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas
En la figura presentada a continuacin se esquematiza un experimento de TLC
 La cromatografa en capa fina presenta una
serie de ventajas frente a otros mtodos
cromatogrficos (en columna, en papel, en
fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es
ms simple. El tiempo que se necesita para
conseguir las separaciones es mucho menor y
la separacin es generalmente mejor. Pueden
usarse reveladores corrosivos, que sobre
papel destruiran el cromatograma. El mtodo
es simple y los resultados son fcilmente
reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para fines analticos.
Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las
partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su
adhesin al soporte, aunque tambin se le puede aadir un adherente.
En la eleccin del eluyente influyen varios factores:
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes
(reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales
(catalizadores).
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad
del componente y probar con eluyentes cada vez menos polare
CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA PREPARATIVA (CCDP)
La cromatografa preparativa se diferencia en que la papilla debe hacerse con
menos agua que de ordinario. El espesor ptimo oscila desde un mnimo de 1 mm.
Hasta un mximo de 2 mm. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa. Una
vez localizados los compuestos, stos se extraen de la fase estacionaria, uno a uno,
con la ayuda de una esptula, sobre un papel de filtro u otro soporte. Una vez
disuelto el compuesto se filtra varias veces para separar el compuesto y la fase
estacionaria. Las placas utilizadas en cromatografa preparativa son placas
grandes, de aproximadamente 20x20 cm.
CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA ANALITICA
Tcnica analtica cualitativa que permite la separacin de los componentes de una
mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos, retencin y
desplazamiento.
Fundamento
Retencin: Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase
estacionaria slida.
Desplazamiento: Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase
mvil.

ANTECEDENTES
IDENTIFICACIN DE ANTOCIANINAS Y CAROTENOIDES EN FLORES DE
MASTUERZO (TROPAEOLUM MAJUS) POR CROMATOGRAFA EN CAPA
FINA.
El objetivo de esta investigacin fue la identificacin de antocianinas y carotenoides
en los tres colores de flor de mastuerzo (Tropaeolum majus L.), la metodologa
incluy la colecta y extraccin de estos componentes. De acuerdo a los resultados
obtenidos se tuvo como mejor solvente de extraccin para antocianinas al metanol
y agua en proporciones de 50:50 % para las muestras rojo y amarillo y de 70:30 %
para la muestra anaranjado. Se seleccion el mejor sistema de solventes para la
fase mvil en la identificacin de antocianinas, siendo el BAW (1- butanol, cido
frmico y agua en la proporcin de 2:0,5:2) como mejor eluyente. Al aplicar la
tcnica de cromatografa en TLC para separar e identificar antocianidinas tales
como cianidina, peonidina, pelargonidina, delfinidina y malvidina, la flor amarilla y
roja posee los cinco componentes antes mencionados y que en la flor anaranjada
no se encuentra la malvidina, corroborndose la presencia de estos componentes
por espectrofotometra, la flor amarilla tiene dentro de su composicin todas las
antocianidinas a excepcin de la peonidina, para la flor de color anaranjado solo se
identific a la peonidina y la flor roja se pudo identificar cianidina y delfinidina. Para
carotenos el mejor solvente de extraccin vara para cada color de flor; en el amarillo
fue el solvente ter de petrleo, en la flor anaranjada el ter de petrleo y cloroformo
(50:50 %) finalmente para la flor roja fue el cloroformo, para la identificacin; el mejor
sistema de solvente para la fase mvil fue ter de petrleo y benceno en la
proporcin de 1:9. Al aplicar la tcnica de cromatografa en TLC para separar e
identificar carotenoides tales como caroteno, caroteno, caroteno, caroteno y
licopeno, en la flor amarilla no se identific caroteno, en la flor anaranjada se
identific caroteno en mayor proporcin y en la flor roja se identific todos los
carotenos, corroborndose la presencia de caroteno por espectrofotometra en las
tres flores de mastuerzo.

BASES TERICAS
ANALITO: es la substancia que se va a separar durante la cromatografa.
CROMATOGRAFA ANALTICA: se emplea para determinar la existencia y
posiblemente tambin la concentracin de un analito en una muestra.
FASE ENLAZADA: es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las
partculas de soporte o a las paredes internas de la columna.
CROMATOGRAMA: es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de
separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla separada.
CROMATGRAFO: es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por
ejemplo, un cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos.
CROMATOGRAFA: es el mtodo fsico de separacin en el cual los componentes
que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es
estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase mvil) se mueve en una
direccin definida.
EFLUENTE: es la fase mvil que atraviesa la columna.
CROMATOGRAFA PREPARATIVA: se usa para purificar suficiente cantidad de
sustancia para un uso posterior, ms que para anlisis.
TIEMPO DE RETENCIN: es el tiempo caracterstico que tarda un analito particular
en pasar a travs del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo
las condiciones fijadas.
DISOLVENTE: es toda sustancia capaz de solubilizar a otra (fase mvil)
 PRACTICA N5
TCNICAS DE FRACCIONAMIENTO Y PURIFICACIN
1.- MATERIAL Y EQUIPOS
Estufa
Beaker 50 mL, 100mL
Pipeta 5 mL, 10mL
Probeta
Balanza anaalitica
Cromatoplacas de placa de silica gel
Lampara uv
Tubo capilar
Placa Petri
Papel metlico

2.- REACTIVOS
Slica gel para CC
Cloroformo
Diclorometano
Acetato de etilo
Hidrxido de sodio
Agua destilada
Etanol 96
 3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Ilustracin 1
pesamos 50 mg de extracto
seca en una placa Petri
Ilustracin 6
Lmpara UV y con los agentes reveladores
adecuados
luego medir la fluorescencia amarilla a 365nm
esto nos va a ayudar a encontrar el RF.
Ilustracin 2
Ilustracin 3
con una esptula colocamos
Sembramos nuestra muestra
un segmento del extracto, le
en la placa de silica gel GF-254:
agregamos etanol 0.5mL
se puede utilizar un capilar
hasta diluir completamente
para proceder a la siembra.
Ilustracin 4
En beaker de vidrio
introducimos la
cromatoplaca, en un
ngulo de 30 con mucho
cuidado para que la silica
gel no se desmorone y as
entre en contacto con la
fase movil y ascienda por
capilaridad de tal modo
que observamos que se
iban formando bandas a
mediada que suba hasta
un centmetro por el nivel
del borde superior
llamado frente del
solvente.
Ilustracin 5
Aspersar la cromatoplaca con
revelador en la campana
extractora con cloruro de aluminio
luego pasar llevar a la plancha
(hot plate) luego medir el de la
fluorescencia amarilla a 365nm
Resultados

Rf Fase mvil Fase Revelador

estacionaria cromatogrfico

cloruro de
aluminio

CUESTIONARIO

1. Al realizar una TLC qu criterios utiliza en la eleccin de la fase mvil y la fase

estacionaria?

Los criterios es elegir bien la fase mvil y la fase estacionaria ya que los
componentes que se debe separar deben ser solubles en la fase mvil y capaz de
interaccionar con la fase estacionaria en esta se utiliz la silicagel.

2. Qu se entiende por RF?

Rf = distancia recorrida por el soluto / distancia recorrida por el solvente

El valor de Rf depende del tipo de solvente empleado, del soporte utilizado y otros
factores ms.

Conocer este valor permite saber que tan rpido se mueve el soluto que se analiza
respecto al sistema cromatogrfico.

3. Qu etapas comprende el empaque de una columna cromatografa?

La cromatografa en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena

con un soporte slido adsorbente (fase estacionaria: los ms utilizados son gel de
slice (SiO2) La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de
este soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que
constituye la fase mvil etanol y diclometano) que, por efecto de la gravedad, hace
mover la muestra a travs de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto
adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna.
Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecer
interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern transportados a
diferentes velocidades y se conseguir su separacin. As, de manera similar a
otros tipos de cromatografa, las diferencias en las velocidades de desplazamiento
a travs del medio slido se corresponden con diferencias en los tiempos de
elucin por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la
muestra original, que se recogern en fracciones diferentes.

La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los
diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes
polares compiten ms eficientemente con las molculas polares de una mezcla
por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazar
las molculas, incluyendo las ms polares, rpidamente a travs de la columna. Si
el disolvente es muy polar la elucin ser muy rpida y generalmente habr poca
separacin de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es
muy apolar, no eluirn los compuestos de la columna.

4. Cules son las diferencias en HPTLC y TLC?

HPTLC

Separaciones dos veces ms rpidas a la mitad de contrapresin de la

columna con las columnas de 5 m
Mayor rendimiento de la muestra separaciones hasta nueves veces ms
rpidas si son necesarias
Reequilibrado rpido de la columna entre anlisis

TLC

Normalizacin y control de calidad extraordinarios

Adherencia, dureza y homogeneidad de superficie excepcionales
Anlisis de muestras con elevada carga de matriz sin preparacin de la
muestra
Mltiples muestras analizadas en paralelo
Gran rentabilidad, rapidez y economa

5- explique el mecanismo de absorcin en la separacin cromatografa?

La separacin se basa fundamentalmente en las distintas afinidades de adsorcin

de los componentes de la muestra hacia la superficie de un slido activo.
Cromatografa de reparto

La separacin se basa fundamentalmente en las diferencias de solubilidad de los

componentes de la muestra en la fase estacionaria (cromatografa de gases) o en
las diferencias de solubilidad de los componentes en la fase mvil y en la fase
estacionaria (cromatografa de lquidos)

6- Cmo se identifica los componentes no coloreados e luidos de una columna

cromatografa?

Elucin: proceso por el cual todos los solutos terminan por abandonar la columna

BIBLIOGRAFIA