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Tcnicas Fitopatolgicas
Laboratrio de Fitopatologia
Embrapa Mandioca e Fruticultura
Manual Bsico de
Tcnicas Fitopatolgicas
Laboratrio de Fitopatologia
Embrapa Mandioca e Fruticultura
Embrapa
Braslia, DF
2016
Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:
1a edio
On-line (2016)
CDD: 632.3
Embrapa 2016
Autores
Eliane Mazzoni Carollo
Engenheira Qumica, DSc. em Qumica, analista da
Embrapa Agrobiologia, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
A B Homem
Patgeno
Hospedeiro
Tempo
Doena
Patgeno
Ambiente Hospedeiro Ambiente
Ausncia Medidas
Danos Indiretos Danos Diretos
Gesto em Laboratrio
Em trabalhos de pesquisa e principalmente
em condies de laboratrio, os cuidados e
a ateno devem ser contnuos. Para isto, os
usurios devem conhecer os riscos sade,
a segurana relacionada com o manuseio de
produtos qumicos e os riscos envolvendo
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equipamentos e rea de circulao de modo
que se use das disposies, procedimentos
que minimizem os riscos e se tenha cincia
das aes emergenciais eficientes.
Biossegurana, tarefas de
rotina, manuteno bsica de
equipamentos e instrumentos
e verificao de registros
Biossegurana
Neste caso, entenda-se biossegurana
como sendo o conjunto de aes voltadas
para a preveno, proteo do usurio (prtica
padro) e minimizao de riscos inerentes s
atividades e prestao de servios. Este foco
de ateno retorna ao ambiente ocupacional
e amplia-se para a proteo ambiental e a
qualidade. No centrado em tcnicas de
DNA recombinante, se baseia em tcnicas
para ensaios microbiolgicos que levem
identificao das doenas de plantas com
segurana e sem contaminaes ao usurio e
ao material identificado.
Conceitos
Desinfeco a eliminao dos germes
patognicos sem que haja necessaria-
mente a destruio de todos os micro-
organismos por meios fsicos ou qumicos.
Esterilizao do material consiste num
processo utilizado para destruir todos os
micro-organismos nele existente.
Antissepsia (anti-contra, septse-putre-
fao) o uso de substncias capazes
de impedir a proliferao de micro-
organismos.
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Assepsia o conjunto de meios emprega-
dos para impedir proliferao de micro-or-
ganismos em local que no os contenha.
Figura 6. Posio
correta para flambagem
de placa de Petri.
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Esterilizao a calor mido (Autoclave)
A autoclave um equipamento muito efi-
ciente para a esterilizao de diversos mate-
riais como vidrarias, plsticos autoclavveis,
meios de cultura e tambm para a destrui-
o de micro-organismos antes de procedi-
mento de descarte. (Figura 7).
Foto: Leandro Rocha
Figura 7.
Autoclave vertical.
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A esterilizao a calor mido consiste no
tratamento trmico mido ou via vapor
saturado cuja funo , mediante o con-
trole da presso de vapor da gua, favo-
recer temperaturas superiores a 100 C,
ou de forma inversa, controlando a tem-
peratura, favorecer presses superio-
res atmosfrica; o seu poder de pene-
trao muito grande e faz com que o
micro-organismo sofra coagulao das
protenas levando-o morte (ZAUZA
et al., 2007)
Figura 8.
Forno Pasteur.
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Zona de esterilidade
(Cmara de Fluxo Laminar)
A cmara de fluxo laminar ou capela micro-
biolgica (Figura 9) um equipamento des-
tinado a controlar as micropartculas areas,
associadas ao manuseio de materiais biolgi-
cos infeciosos ou txicos, por meio de uso de
ventilao apropriada, existente no seu inte-
rior, tornando o ambiente estril para fins de
proteo ao usurio e amostra manipulada
(MANUAL, 2005).
Procedimento de operao
da Cmara de Fluxo Laminar
Ligar a cmara pressionando uma vez o
boto verde;
Ligar a iluminao acionando-se a chave
metlica para a posio luz;
Limpar as paredes, a superfcie da rea de
trabalho, grelhas frontal e posterior e as
laterais da cmara, com algodo embebi-
do em lcool 70% ou qualquer outra solu-
o desinfetante;
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Deixar a cmara ligada pelo menos 30 mi-
nutos antes de iniciar os trabalhos, a fim
de remover qualquer partcula de mate-
rial que possa estar na face do filtro ou
que venha na grelha de proteo;
Esterilizar ou desinfestar superficialmente
com lcool PA, todo equipamento ou ma-
terial que se introduza na rea de traba-
lho da cmara inclusive, os utenslios que
contm as amostras biolgicas a serem ali
manipuladas;
No colocar materiais desnecessrios ao
procedimento na rea de trabalho est-
ril, porque podem obstruir o fluxo de ar e
criar turbulncias que podem causar con-
taminaes cruzada ou aspirao de ar
para dentro da rea de trabalho;
Antes de iniciar os trabalhos, lavar as
mos e os punhos, assim como, todas as
vezes que tiver contato com material no
estril externo rea de trabalho.
Imediatamente aps o trmino do servi-
o, limpar as grelhas frontal e posterior e
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as laterais da cmara, com algodo em-
bebido em lcool PA ou qualquer soluo
desinfectante; em seguida desligar a c-
mara (boto vermelho);
Desligar a iluminao (chave metlica);
Manter, sempre que possvel, a cmara
em funcionamento a maior parte do
tempo, pois a presso positiva gera-
da dentro da rea de trabalho ajudar
a manter as condies de limpeza da
mesma;
Realizar testes e troca dos filtros absolu-
tos (HEPA) sempre por pessoal tcnico
qualificado, contratado para tal.
Temperatura
A temperatura favorece a regulao e a dis-
tribuio das espcies em toda uma regio.
O conhecimento da temperatura funda-
mental para a otimizao do cultivo in vitro.
Os efeitos deste fator sobre o crescimento de
uma espcie pode ser determinado, avalian-
do-se inicialmente a temperatura a intervalos
mais amplos, de aproximadamente 5 C (Ex.:
25 C, 30 C e 35 C), podendo variar de no m-
nimo cinco pontos, para construir uma curva
tpica de crescimento e determinar as tempe-
raturas mnima e mxima de crescimento.
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Em fungo
Embora cada fungo tenha uma
temperatura tima de desenvolvimento,
normalmente a maioria desenvolve-
se bem temperatura ambiente
(20 25 C). A temperatura pode ser
controlada em incubadoras ou em
banho-maria.
Em bactria
A temperatura o fator externo de
maior importncia para a reproduo de
bactrias. As bactrias fitopatognicas
encontram-se temperatura tima para
o seu desenvolvimento entre 25 C e
30 C. As mesmas param de se repro-
duzir entre 33 C e 40 C.
Aerao
O oxignio (O2) assim como o dixido de
carbono (CO2) influencia no crescimento de
micro-organismos. O gs carbnico muito
embora faa parte de algumas reaes
qumicas existentes nas clulas, seu excesso
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no meio de cultura pode inibir o crescimento
e a esporulao de alguns micro-organismos.
pH
O pH timo para o crescimento vegetativo
pode no ser o mesmo que induz esporu-
lao. Enquanto fungos crescem numa faixa
ampla de pH, as bactrias geralmente so sen-
sveis ao meio cido. Sendo assim, em alguns
trabalhos de rotina o pH do meio ajustado
usando-se cido actico, cido clordrico, ci-
do ltico, hidrxido de potssio ou hidrxido
de sdio antes ou depois de autoclavar, se
necessrio. importante verificar se o meio
que contm gar no solidifica em pH abaixo
de 4,0. E autoclavar o meio pode alterar o pH,
portanto, preciso ajust-lo antes e conferir
depois de acordo com os objetivos do estudo.
Nutrio
Os elementos minerais quando requeridos
pela planta e seu fornecimento sendo ade-
quado, fornecem planta uma maior resistn-
cia doena. Portanto, importante manter o
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balano nutricional nas plantas, principal-
mente, de nitrognio, fsforo e potssio,
porm, nada em excesso. Como controle nu-
tricional preventivo das plantas usam-se, na
maioria dos casos, os fertilizantes. E, como
meio nutritivo para o crescimento dos micro-
-organismos em laboratrio temos os meios
de cultura (BEDENDO,1995).
Meios de cultura
Os meios de cultura so substncias ou
solues que podem ser usados na sele-
o e crescimento de um determinado
micro-organismo ou clula vegetal para a
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identificao de uma espcie em particular
(ZAUZA et al, 2007).
Semissinttico
Os meios de cultura semissintticos
que so amplamente utilizados na
microbiologia, assemelham-se aos meios
sintticos quanto ao possurem um
conjunto conhecido de ingredientes ou
substncias. Porm, o meio semissinttico
contm uma fonte natural de acar,
podendo ser a batata, milho, extrato de
carne ou de malte.
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Natural
Os meios de cultura naturais so compos-
tos parcial ou integralmente de produtos
naturais, como parte das plantas (folhas,
brotos, razes, sementes, frutos, etc.) ou
de infuses ou de extratos de materiais de
origem vegetal ou animal. Um pedao de
batata um meio de cultura natural, as-
sim como um pedao de po ou de carne.
Seletivo
O meio de cultura seletivo favorece ao
desenvolvimento de uma cultura pura ou
inibi culturas indesejveis, e para isto, so
utilizadas substncias como: antibiticos,
vitaminas ou fungicidas, adicionados ao
meio de cultura j preparado.
B
Fotos: Leandro Rocha
Isolamento de micro-organismos
fitopatognicos
Aspectos gerais
essencial que o patgeno que se preten-
de isolar seja colocado em um novo ambiente
que favorea o seu desenvolvimento, supe-
rando seus concorrentes saprfitas. Esta eta-
pa requerida se comprova com a segunda e
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quarta regras dos postulados de Koch. Um iso-
lamento bem sucedido de uma cultura depen-
de, basicamente, da capacidade tcnica em
separar determinado organismo de outros.
Mtodos bsicos de isolamento
Para o isolamento so usadas diferentes tc-
nicas, conforme a natureza do tecido afetado,
o substrato e o estdio de desenvolvimento
do patgeno (vegetativo ou reprodutivo),
bem como do operador. E, segundo Alfenas
et al., (2007), as tcnicas bsicas empregadas
so de isolamento direto e isolamento indireto.
Isolamento direto
O isolamento direto baseia-se na trans-
ferncia direta do rgo infectado do
patgeno com o auxlio de um estile-
te, diretamente para o meio de cultu-
ra. Se a pretenso do trabalho com os
esporos presentes na amostra for esti-
mular a esporulao do fungo, deve-
se manter o material em cma-
ra mida (por um a trs dias) a 25 C.
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O material exposto luz contnua em c-
mara mida ir favorecer a esporulao.
A cmara mida deve ser montada por
placas de Petri fechadas ou bandejas en-
voltas por saco plstico transparente e
conter papel de filtro ou algodo embe-
bido com gua e o isolado sobre o papel
ou o algodo.
Isolamento indireto
O isolamento indireto baseia-se na tcni-
ca de transferncia para um meio de cul-
tura de pores infectadas de tecido hos-
pedeiro ou amostras de solo e sementes
infestadas em que no exista a evidncia
de estruturas do micro-organismo. Este
mtodo de isolamento indireto de um mi-
cro-organismo varia com o tipo de rgo
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ou tecido infectado (rgo lenhoso ou
carnoso, no-lenhoso ou no-carnoso) ou
o substrato onde o organismo recupe-
rado. Porm, h casos em que o patgeno
encontra-se internamente nos tecidos da
planta sem produzir frutificaes.
Mtodos de inoculao de
micro-organismos patognicos
A Inoculao permite, artificialmente, tornar
uma planta sadia em uma planta doente.
Este procedimento faz parte da terceira
regra do Postulado de Koch que comprova a
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patogenicidade de um dado micro-organismo
(ALFENAS; FERREIRA, 2007). Qualquer poro
de patgeno, potencialmente capaz de iniciar
a doena, conhecida como inculo
Mtodos de inoculao
Alguns mtodos de inoculao apresenta-
dos so baseados no tipo de inculo usado e
no rgo da planta a ser inoculada (ALFENAS
et al, 2007).
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Esporos a seco como inculo
uma tcnica de inoculao muito em-
pregada em alguns parasitas obrigat-
rios ou biotrficos, como agentes causais
da ferrugem da goiabeira (Puccina psidii)
e da odiose da mangueira (Oidium man-
giferae), que no crescem em meio de
cultura e cujas fontes de inculo devem
consistir de plantas infectadas pelo pr-
prio patgeno. A inoculao destes fun-
gos feita com a atomizao de esporos
a seco ou imersos em gua destilada es-
terilizada, sobre as superfcies a serem
inoculadas.
Suspenso de esporos ou de
miclio triturado como inculo
uma tcnica muito empregada em
inoculaes de folhas, inflorescncias e
frutos. O uso de suspenso de esporos
ou de miclio triturado est ligado ca-
pacidade de esporulao do patgeno
em cultura.
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Para fungos no cultivveis
em meios de cultura
Realizar a coleta dos esporos nos
rgos do hospedeiro com abundante
esporulao
Passar um pincel sobre as reas esporu-
ladas ou raspar com um escalpelo e reco-
lher os esporos em um bquer com gua
destilada ou, ainda, efetuar a imerso e
agitao das leses esporuladas direta-
mente no bquer com gua e mediante
o uso de um coletor de esporos apropria-
do acoplado a uma bomba de vcuo.
Exame microscpico
O microscpio ptico de luz (Figura 15)
um equipamento cuja finalidade produzir
uma imagem ampliada e detalhada de alta
resoluo de organismos microscpicos que
no possa ser detectada pelo olho humano.
Em certas situaes, em observaes de cor-
tes histolgicos, o equipamento permite a vi-
sualizao de estruturas fngicas no interior
do tecido vegetativo (como hifas vegetativas,
vesculas e outros) de maneira a estudar a in-
terao fungo-planta e identificar os patge-
nos isolados (PEREIRA; PEREIRA, 2007).
Figura 15.
Microscpio ptico
Questionrio de Opinio
2. Qual tema voc gostaria que fosse abordado numa prxima publicao?