USO DE MARCADORES MOLECULARES EN PLANTAS; APLICACIONES EN

FRUTALES DEL TRPICO

DEFINICION:
Los marcadores moleculares han sido definidos como cualquier diferencia fenotpica
controlada genticamente.
Algunos ejemplos de ellos son: Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin
(RFLP), Amplificacin aleatoria del ADN polimrfico (RAPD), Polimorfismo en la longitud de
los fragmentos amplificados (AFLP), Microsatlites o Secuencias simples repetidas (SSR),
Amplificacin aleatoria del polimorfismo de microsatlites (RAMPO) etc. (Rallo et al. 2002).
TIPOS DE MARCADORES
Isoenzimas
Son las protenas ms ampliamente usadas como marcadores moleculares y stas fueron
los primeros marcadores moleculares usados en gentica de plantas (Tanksley et al. 1981).
Su anlisis se realiza extrayendo la enzima de los tejidos de la planta, tras lo cual, las
variantes son separadas con electroforesis y visualizadas mediante la tincin del gel con
colorantes especficos (Powell 1992; Haines 1994).
Marcadores de ADN
Segn Karp et al. (1997) dentro de este grupo se incluyen tres categoras bsicas.
Categora 1: mtodos que no se basan en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Por ejemplo, RFLP y nmero variable de repeticiones en tandem (VNTRs).
Categora 2: tcnicas que utilizan iniciadores (primer) arbitrarios o semiarbitrarios. Por
ejemplo, iniciadores PCR mltiples arbitrarios (MAAP), RAPD, RAMPO.
Categora 3: PCR con sitio objetivo especfico. Por ejemplo, SSR, Inter secuencias
simples repetidas (ISSR). Las categoras 2 y 3 son marcadores basados en la PCR.
Para realizar el anlisis se necesitan las enzimas de restriccin. Paterson (1996)
menciona que stas actan como tijeras moleculares altamente especficas. Estas
enzimas reconocen y cortan el ADN en sitios especficos

I- Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP)

Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin fueron los primeros marcadores
ADN.
El procedimiento general consiste en digerir el DNA extrado mediante enzimas de
restriccin para a continuacin separar los fragmentos mediante electroforesis y
transferirlos a una membrana Y por ltimo completar el proceso mediante una hibridacin
con una zona marcada
El resultado final es un conjunto de fragmentos que correspondern con los fragmentos
generados al cortar con las enzimas de restriccin. En todos los casos un esquema en el

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que se representa el homocigoto para un alelo el homocigoto para el otro y tambin un
patrn obtenido para cada uno de los homocigotos as como para el heterocigoto entre
ellos.
Ventajas:
Codominancia
Metodologia sumamente solida y muy transferible entre laboratorios.
No se requiere informacion acerca de la secuencia.
Polimorfismo: combinaciones enzima/sonda
Inconvenientes:
Re quieren la distribucin de sondas a los laboratorios colaboradores
Requieren cantidades grandes de DNA
No permiten la automatizacin
Tienen exigencias tcnicas moderadas
Costosos
Requieren la distribucin de sondas a los laboratorios colaboradores
Bajos niveles de polimorfismo en algunas especies
Pocos loci detectados por ensayo

II- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

El anlisis PCR es un procedimiento in vitro para la sntesis y duplicacin de secuencias
especficas de ADN. Esta tecnologa utiliza secuencias de oligonucletidos que inician la
sntesis de fragmentos de ADN de longitudes variables, no mayores de 6 Kb en promedio
(Valadez y Kahl 2000).
En la tcnica PCR se utiliza el TERMOCICLADOR que realiza ciclo de temperatura.
En el proceso intervienen cebadores o primers, nucletidos y la polimerasa
Cada Ciclo tiene 3 etapas
Primera Etapa: La desnaturalizacin de ADN a 95 C para separar las cadenas o
desnaturalizar.
Segunda Etapa: Anillamiento a 55 65 C para que se unan los primers especficos a
cada una de las cadenas complementarias
Tercera Etapa: Elongacin a 72 c estos primer que sirven de molde para que la taq
polimerasa sintetiza ADN hacia el extremo 3 prima usando nucletidos libres
La tcnica PCR ha suministrado un conjunto de marcadores como por ejemplo; los RAPDs,
SSR, AFLPs, regiones amplificadas de secuencias caracterizadas (SCARs), amplificacin
selectiva de loci polimrficos (SAMPLs), amplificacin azarosa de las huellas del ADN ADN
Fingerprinting (RAF) y amplificacin directa con ADN microsatlites (DAMD) (SIDTA 1999;
Ramage et al. 2004; Saxena et al. 2005).

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III- Amplificacin aleatoria del ADN polimrfico (RAPD)
Conocidos como fragmentos de ADN polimrficos amplificados al azar.
La tecnologa RAPD es una metodologa cientfica mediante pcr secuencial no especficas
del genoma es aleatoriamente.
Los marcadores de tipo RAPD utilizan una sencilla estrategia realizada pcr nicamente con
un cebador o cebador corto de secuencia aleatoria de unos 10 nucletidos de forma es
probable que en el genoma se encuentre varias secuencias con las que hibride el cebador
y tambin se encuentre un fragmento blanqueado por la secuencia directa y reversa
invertida del cebador separada menos del lmite por amplificacin por pcr esta hibridacion
resultara por pcr la amplificacin de un fragmento.
A pesar de su interpretacin dominante los marcadores RAPD han sido muy utilizados.

Ventajas:
Simplicidad tcnica
No requiere conocimiento de secuencia
Inconvenientes:
Dominancia
Reproducibilidad

IV- Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP)

Son considerados marcadores de alta eficacia, permiten el anlisis de un elevado nmero
de loci por experimento sin requerir informacin previa sobre su secuencia, son en su
mayora dominantes y altamente reproducibles.
El anlisis AFLP combina la digestin con enzimas de restriccin con el PCR.
Pasos:
Primer lugar es necesario realizar una extraccin de ADN genmico a continuacin se
digiere ese dna con dos enzimas de restriccin y el paso siguiente es el empalme de unos
adaptadores es el que permite realizar posteriormente una amplificacin mediante pcr de
hecho se llevan a cabo dos relaciones de amplificacin una preamplificacion y una siguiente
una segunda pcr o amplificacion selectiva.
La visualizacin de estos resultados pues se puede realizar mediante geles de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes de secuenciacin o mediante analizadores
de fragmentos.
Ventajas
Alta reproducibilidad
Gran cantidad de informacin por reaccin
No requiere conocimiento de frecuencia o generacin de sondas

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Inconvenientes
Alta complejidad tcnica
Dominante
Problemas de comigracion

V- Microsatlites o secuencias simples repetidas (SSR; MP-PCR)

Son regiones de secuencias pequeas (dos a 10 pares de bases) repetidas, arregladas en
serie, las cuales se asume que estn distribuidas azarosamente por todo el ADN.
Dentro de los basados en secuencias de amplificacin especficas los micro satlites estara
basados en amplificacin de secuencias especficas de copia mltiple.
Ventajas:
Codominancia
Multialelico
Altamente reproducible
Inconvenientes:
Complejidad tcnica
En anlisis un locus con una pareja de primers