Qumica Orgnica II

CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA DE AMINOCIDOS.

1).- Introduccin:
La cromatografa en capa delgada (TLC, por sus siglas en ingls: thin layer
chromatography) es un tipo de cromatografa de reparto en la que los componentes de una mezcla
se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes, uno retenido en el soporte o
fase estacionaria, y el otro que sube por capilaridad llamado eluyente o fase mvil. La fase
estacionaria puede ser silicagel o almina sobre un soporte de aluminio o vidrio mientras que el
eluyente se selecciona en funcin de la polaridad de los componentes a separar.
El soporte debe ser inerte pero genera diferentes procesos de adsorcin, por lo que la
separacin ocurrir tambin, en parte, debido a la interaccin entre las molculas a separar con
dicho soporte. La fase estacionaria, al ascender por la placa que contiene al adsorbente, recubre las
partculas del soporte y es retenida por adsorcin. El adsorbente debe seleccionarse teniendo en
cuenta el tamao de partculas ya que las de menor tamao conducen a mayor adhesin al soporte y
mayor separacin de las mezclas.
El desarrollo de la cromatografa consiste en hacer pasar una mezcla de componentes a
separar (muestra) a travs de la fase estacionaria mediante el pasaje de la fase mvil (generalmente
en forma ascendente/vertical). El proceso de adsorcin se debe a interacciones intermoleculares de
tipo dipolodipolo o enlaces de hidrgeno entre el soluto y el adsorbente. El orden de elucin de un
compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase mvil o eluyente por lo que, puede ser
un disolvente nico o mezclas miscibles de distinta polaridad.
La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos
cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa): menor tiempo de desarrollo; mayor
resolucin de separacin; posibilidad de utilizar reveladores corrosivos que sobre papel destruiran
el cromatograma; y la posibilidad de lograr resultados fcilmente reproducibles muy tiles con fines
analticos.
El parmetro para determinar la separacin y posible identidad de los componentes es la
Razn de Flujo (Rf) que se considera como la relacin entre la distancia recorrida por el soluto
respecto de la del eluyente desde el origen de la corrida (siembra). Este valor ser variable de
acuerdo a las condiciones en que se desarrolle la cromatografa por lo que no es un parmetro
absoluto de comparacin y deben tenerse en cuenta las condiciones al momento de interpretar los
resultados. La retencin se debe a que el soluto a separar se adsorbe a los centros activos polares de
la fase estacionaria; a medida que se produce la elucin van siendo desplazados por la fase mvil.
La retencin y la selectividad en la separacin dependen entonces de la Polaridad del compuesto y
la naturaleza del disolvente ya que un aumento en la polaridad del disolvente facilita su
desplazamiento en la placa. Por lo tanto, para lograr resultados comparables o citables
cientficamente se deben realizar las corridas en las mismas condiciones sembrando un patrn de
referencia.
El Rf se calcula como la relacin:

Rf = X (distancia recorrida por el compuesto desde el centro de la siembra)

Y (distancia recorrida por el eluyente desde el centro de la siembra).

En algunos casos pueden utilizarse reveladores para evidenciar la presencia de

constituyentes incoloros, o bien utilizar placas con indicador de fluorescencia y observar a la
luz UV a 254 nm y 365 nm. En el caso especfico de los aminocidos se revela el cromatograma
con solucin etanlica de ninhidrina, la cual dar una coloracin violeta con la mayora de los
aminocidos, excepto con prolina e hidroxiprolina que dan amarillo.

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2).- Objetivo: Separar los constituyentes de una mezcla desconocida de aminocidos utilizando la
cromatografa en placa o capa delgada.
3).- Proceso: Reparto de los componentes de la mezcla en dos fases.

4).- Materiales a utilizar:

- Cromatofolios de silicagel 60 F254
- Cuba cromatogrfica (puede ser un vaso de precipitados con vidrio de reloj para tapar o un
frasco de mermelada limpio seco y sin raspaduras)
- Lpiz negro, regla, pinza, tijera.
- Capilares.
- Aspersor

5).- Reactivos:
- Solucin acuosa de la mezcla de aminocidos a separar.
- Soluciones de diversos aminocidos patrones.
- Fase Mvil: Etanol 96 + Hidrxido de amonio (2 + 1)
- Revelador: solucin etanlica de ninhidrina al 0,2%.

6).- Procedimiento:
Importante: asegurarse de no tocar con las manos el cromatofolio ya que los aminocidos de la
piel dejarn manchas de huellas dactilares con ninhidrina.

6.a) Preparacin de la cuba cromatogrfica: Introducir entre 15 y 20 mL de la fase mvil o eluyente

en la cuba cromatogrfica cuidando de no tocar con la solucin las paredes de la cuba; tapar con
cuidado para no provocar salpicaduras y dejar en reposo para saturar la misma (Nota: cuanto
ms tiempo de saturacin se deje, ms rpido y mejor eluir el sistema).

6.b) Preparacin del cromatofolio: Sobre una placa de TLC de 14cm de alto por 5-6 cm de ancho
(dependiendo del nmero de siembras a realizar), delimitar las zonas de manipulacin con un
lpiz, dejando 2 cm desde cada borde superior e inferior; luego, a partir de la lnea indicada en el
borde inferior a 2 cm del borde de la placa, demarcar la lnea de siembra con un delgada lnea a
lpiz cuidando de no levantar la silicagel de la placa (Medir por fuera de la cuba que esta lnea se
halle por encima de la superficie del solvente contenido en la cuba, ya que de otro modo, la
siembra difunde al solvente y se malogra la corrida). De ser necesario, se puede colocar la placa
en estufa suave unos minutos a fin de quitar exceso de humedad (activacin).

Zona de desarrollo del

Cromatograma

Lnea de siembra
Bordes que se recortarn

6.c) Siembra de la mezcla a separar y de las muestras patrones: Tomar la placa con una pinza
desde el extremo superior de manipulacin; colocarla en la mesada sobre un papel limpio y
proceder a la siembra: con un capilar (o micropipeta doblemente estirada) tomar una pequea

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porcin de la solucin a separar, descartar la gota excedente tocando el borde del recipiente que
contiene la solucin; sobre la lnea de siembra (por encima de la de manipulacin) tocar con el
capilar suavemente la placa a modo de que absorba el lquido y no se levante la silicagel.
Generalmente se concentra la siembra realizando este toque 3 o 4 veces cuidando que quede una
mancha circular de no ms de 0,5cm. De la misma manera se procede a sembrar las distintas
soluciones patrones dejando entre cada mancha de siembra aproximadamente 0,5 1 cm de
distancia (del nmero de siembras depender el ancho de la placa). Dejar evaporar el solvente de la
solucin unos minutos.
Nota: Evitar sembrar sobre los extremos del cromatofolio ya que podra perderse la muestra
por los costados.

6.d) Desarrollo de la cromatografa: Previo a introducir el cromatofolio en la cuba, cortar las zonas
de manipulacin (que se descartan) y realizar un pequeo corte inclinado en cada extremo
(derecho e izquierdo) inferior. NO tocar ms con la mano la placa. Usar pinzas para introducir
el cromatofolio dentro de la cmara cromatogrfica o cuba cuidando que ste solo toque el
recipiente en la base y en los extremos superiores (inclinado contra la pared del frasco). La lnea
de siembra debe quedar por encima de la superficie del solvente. Tapar la cmara y dejar eluir
hasta 5 centmetros antes del final del cromatofolio. NO MOVER LA CUBA MIENTRAS SE
DESARROLLA EL CROMATOGRAMA. Una vez finalizada la corrida, sacar la placa con una
pinza, demarcar la lnea de llegada y dejar secar a temperatura ambiente o estufa suave.

6.e) Revelado del Cromatograma: Colocar la placa sobre una superficie plana (preferentemente un
cartn) y asperjarla (bajo campana) con la solucin del revelador. Esperar unos minutos a que
aparezcan las manchas color violeta. Delimitar con un lpiz suavemente las manchas, ubicando
el centro de las mismas. Medir con una regla las distancias recorridas por cada mancha desde el
centro de cada siembra al centro de cada mancha y referir esta distancia a la distancia total
recorrida por el eluyente desde la lnea de siembra y hasta el frente de llegada; calcular el Rf y
comparar con los de los patrones tambin calculados de la misma manera.

7).- Informe:
- Objetivo
- Tabla de aminocidos en la que debe constar el PM, sinonimia, densidad, PF, PE, solubilidad en
agua, en etanol y en otros solventes y la bibliografa de donde se obtuvieron los datos.
- Breve esquema simplificado de la tcnica.
- Modo de preparacin de las soluciones a utilizar y del reactivo revelador.
- Observaciones prcticas referidas a los detalles para lograr una mejor corrida y/o posibles
errores a solucionar a posteriori.
- Esquema de la placa antes y despus del desarrollo; resultados de las mediciones de las
distancias de cada muestra y del solvente; clculo de los Rf; discusin de los resultados en base a
la comparacin de estos datos.
- Conclusiones.

8).- Cuestionario:
1) En qu propiedad se basa la separacin de aminocidos por reparto?
2) Cul es la fase estacionaria y cul la fase mvil?
3) Cmo se prepara el reactivo revelador? Formule la reaccin qumica con un aminocido.
4) Qu es la razn de flujo? Cmo se calcula?
5) Qu precauciones debe tomar para realizar la TLC de aminocidos?
6) Cmo puede lograr una mejor resolucin del cromatograma?
7) Cmo debe trabajar para que los Rf resulten comparables?

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8) Investigue sobre la posibilidad de cambiar la polaridad de la fase mvil. Cmo se puede

lograr esto y de qu depender la seleccin de la misma?

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