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Abstracto
La sntesis de glicgeno por el visn, el glndula uterina y el epitelio luminal (GE y LE) es
estimulada por estradiol (E 2 ) durante el estro. Posteriormente, los depsitos de glucgeno
se movilizan hasta casi completarse para satisfacer las necesidades energticas de desarrollo
e implantacin preembrionaria por mecanismos an no determinados. La hiptesis de que la
progesterona (P 4 ) fue responsable del catabolismo de las reservas de glucgeno uterino
como una de sus acciones para garantizar el xito reproductivo. El visn se trat con E2, P4
o vehculo (controles) durante 3 das y el tero recogi 24 h (E2, P4 y vehculo) y 96 h (E2)
ms tarde. Para evaluar el cebado E 2 , el visn se trat con E 2 durante 3 das, luego
P 4 durante 3 das adicionales (E 2 P 4 ) y el tero se recogi 24 h despus. El porcentaje de
contenido de glucgeno en el epitelio uterino fue mayor en E 2 + 96 h (GE = 5,71 0,55; LE
= 11,54 2,32) que E 2 +24 h (GE = 3,63 0,71; LE = 2,82 1,03) y ambos Mayor que los
controles (GE = 0,27 0,15, LE = 0,54 0,30, P <0,05). El tratamiento como E 2
P 4redujo el contenido de glucgeno (GE = 0,61 0,16; LE = 0,51 0,13), a niveles no
diferentes de los controles, mientras que concomitantemente aument la expresin del gen
de la enzima catablica (glucgeno fosforilasa m y glucosa-6-fosfatasa) Cantidad de
protena fosfo-glicgeno sintasa (inactiva) en homogeneizados uterinos. Curiosamente,
E 2 P 4 aumento glucgeno sintasa 1 mensajero ARN (mRNA) y hexokinase 1mRNA y
protena. Nuestros hallazgos nos sugieren que mientras que E 2promueve la acumulacin de
glucgeno por el tero de visn durante el estro y el embarazo, es P 4que induce el
catabolismo del glicgeno uterino, liberando la glucosa que es esencial para apoyar la
supervivencia y la implantacin preembrionarias.
Introduccin
El crecimiento pre-embrionario, la implantacin y el desarrollo fetal temprano dependen de
las secreciones de las clulas epiteliales glandulares y luminales uterinas (histotrficas) que
contienen glucosa, glucgeno, aminocidos, grasas, iones y hormonas (Burton et al ., 2002 ,
Hempstock Et al ., 2004 ). Aunque la gluconeognesis no se produce en el tero (Zimmer &
Magnuson 1990 , Ynez et al ., 2003 ), la glucosa es absorbida, transportada al lumen
uterino, metabolizada como un sustrato energtico y cuando est en exceso almacenada
como glucgeno.
La sntesis de glucgeno comienza con la fosforilacin de la glucosa por hexoquinasa que
produce glucosa-6-fosfato, que se isomeriza en glucosa-1-fosfato y se convierte en uridina-
difosfato-glucosa (Ferrer et al ., 2003 ). Las unidades de glucosilo de estas ltimas se
transfieren a los extremos no reductores de las molculas de glucgeno por la glucgeno
sintasa. El glicgeno se cataboliza por glucgeno fosforilasa, liberando glucosa-1-fosfato,
que puede ser isomerizado a glucosa-6-fosfato y entrar en la va glicoltica, o ser
desfosforilado por glucosa-6-fosfatasa, liberando glucosa para la exportacin a la circulacin
sistmica y / O lumen uterino.
El contenido de glucgeno uterino en los picos de los roedores durante el proestro al estro, y
se moviliza durante la implantacin y el embarazo (Demers et al ., 1972 ; Greenstreet &
Fotherby 1973a ). De forma similar, el tero humano almacena grandes cantidades de
glucgeno durante las fases de proliferacin tarda a secrecin temprana, que se moviliza por
la fase secretora tarda (Verma 1983 , Cornillie et al ., 1985 , Spornitz 1992 ). En el visn, el
contenido de glicgeno epitelial uterino glandular y luminal disminuy 99% entre el estro y
el perodo de peri-implantacin (Dean et al ., 2014 ). Mink son reproductores estacionales
que exhiben una diapausa embrionaria obligatoria y pueden tener blastocistos (hasta 17) en
un estado de desarrollo detenido durante 50-60 das despus del coito , lo que da lugar a una
implantacin tarda (Hansson 1947 ; Enders 1952 ). Es probable que las reservas de
glicgeno uterino de visn sean una fuente potencial de energa que apoye la supervivencia
y la implantacin preembrionarias. Como evidencia, el contenido de glucgeno uterino en
las mujeres estriles o en las que exhiben abortos espontneos disminuy considerablemente
en comparacin con las mujeres normales y, en algunos casos, ausentes (Hughes et
al. , 1963 , Rubey et al., 1965 , Maeyama et al., 1977 , Zawar et al ., 2003 , Girish et
al., 2012 ).
La sntesis de glucgeno uterino es estimulada por estradiol (E2) en ratas, conejos, cobayas
(Demers et al., 1972 , Demers et al ., 1973a ) y visn (Rose et al ., 2011 ). En la rata
ovariectomizada, E2 exgeno aument el contenido de glucgeno uterino como se esperaba
(Paul & Duttagupta 1973 ). Sin embargo, cuando se trataron concomitantemente con E2 y
progesterona (P4), las concentraciones de glicgeno uterino se redujeron cuando se
compararon con E2 solo. Demers y Jacobs ( 1973 ) trataron conejos ovariectomizados y
conejillos de indias con E2 seguido de P4 (E2 P4) para simular el cebado de E2 y
reportaron una reduccin en el contenido de glucgeno uterino y un aumento de dos veces
en la actividad de glucgeno fosforilasa, Comparado con E2 solo. Estos hallazgos sugieren
que P 4 promueve el catabolismo del glicgeno uterino y / o antagoniza las acciones
glucognicas de E 2 .
Las concentraciones circulantes de E2 en el visn aumentan despus del apareamiento,
luego disminuyen durante el perodo variable de diapausa embrionaria y aumentan de nuevo
durante el perodo peri-implantacin (Lagerkvist et al ., 1992 ). Las concentraciones
plasmticas de P 4 en el visn permanecen bajas hasta el equinoccio vernal
(independientemente del momento del apareamiento), y luego aumentan concomitantemente
con E 2 durante el perodo peri-implantacin. Es posible que E 2 promueva la acumulacin
de glucgeno durante el proestro y el estro, y que despus del apareamiento y la ovulacin,
P 4 induce la movilizacin del glucgeno. Si esto es cierto, el tero de visn debe ser
extremadamente sensible a P4 en este momento, ya que las concentraciones circulantes del
esteroide, mientras aumentan, son muy bajas hasta la diapausa tarda (Lagerkvist et
al ., 1992 ). Sin embargo, el aumento de la sensibilidad uterina a P 4 , en respuesta a
E 2 inducida por la regulacin de los receptores P 4 , puede resultar en un tero que
responde a las concentraciones de P 4 (quiz inmutables).
Para determinar si P4 podra inducir el catabolismo del glucgeno y / o disminuir la sntesis
de glucgeno en el tero de visn, los animales fueron ovariectomizados bilateralmente y
tratados con E2 y P4 solos o para simular E2 cebado, E2 seguido por P4 (E2
P _ { 4} ). Uteri se analizaron para: contenido de glucgeno de endometrio, miometrio,
estroma, epitelios glandular y luminal; (Ii) niveles de expresin de mRNA relativos para
glucgeno sintasa 1, glicgeno fosforilasa m, hexoquinasa 1 y glucosa-6-fosfatasa 3, y (iii)
niveles de protena para glicgeno sintasa y hexoquinasa 1.
Materiales Y Mtodos
Animales
Veinticinco adultos (18-19 meses de edad) visones hembras premiparas (6-8 descendientes
por litera), fueron trasladados de las condiciones al aire libre del rancho a la instalacin de
animales de interior en la Universidad Estatal de Idaho (ISU) a principios de noviembre. El
visn se aloj individualmente, se aliment una mezcla de pollo y subproductos de pescado
diariamente y se recibi agua ad libitum. Los animales fueron expuestos a un fotoperiodo
diario que se aproxima a los cambios fotoperidicos naturales para el sureste de Idaho
(Rose 1995 ) a temperatura ambiente entre 22-28 C. Todos los procedimientos
relacionados con el cuidado de los animales, la ciruga y los tratamientos hormonales fueron
aprobados por el Comit Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la ISU y
conformados con la Gua para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Protocolo #
6410909).
Hormonas
Inicialmente se disolvieron Estradiol 17 beta (E2, R187933, Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO, EE.UU.) y progesterona (P4, P0130: Sigma Chemical Co.) en alcohol etlico al 95%
(EtOH) y despus se mezclaron En aceite de ssamo como vehculo para la inyeccin
subcutnea.
Tratos
En el da 0 (17 de noviembre), todos los visones se ovariectomizaron bilateralmente a travs
de una nica incisin ventral media, mientras que bajo anestesia con hidrocloruro de
ketamina (50 mg / kg de peso corporal, Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA,
EE.UU. Los animales fueron posteriormente devueltos a sus jaulas durante 11 das, para
permitir la recuperacin y la eliminacin natural de las hormonas ovricas residuales. El da
12, los animales fueron asignados al azar a uno de los cinco grupos (Fig. 1 , n = 5 /
grupo). El visn en los grupos 2,3 y 4 se inyect una vez al da los das 12,13 y 14 con E2
(50 g / kg de peso corporal). En el grupo 5 cada uno recibi inyecciones diarias de P4 (25
mg / kg de peso corporal) en los das 12, 13 y 14 mientras que el visn en el grupo 4 recibi
inyecciones de P4 los das 15, 16 y 17. Los animales del grupo 3 recibieron cada uno
Inyecciones diarias de vehculo en los das 15, 16 y 17 mientras que el visn en el grupo 1
reciba vehculo solo a los das 12, 13 y 14 y representaba los controles.Veinticuatro horas
despus de la ltima perturbacin, los animales fueron sacrificados con una dosis letal de
Sleep-A-Way (Fort Dodge Animal Health), se recolectaron teros y se congelaron
rpidamente en nitrgeno lquido.
Veinticinco visones hembra adultos fueron ovariectomizados bilateralmente el 17 de
noviembre (da 0). El da 12, los visones fueron asignados aleatoriamente a uno de los cinco
grupos ( n = 5 / grupo) y los tratamientos iniciados. El visn en los grupos 2, 3 y 4 se inyect
una vez al da, los das 12, 13 y 14 con estradiol 17beta (E2, 50 g / kg de peso corporal). En
los mismos das, el visn en el grupo 5 recibi inyecciones diarias de progesterona (P4, 25
mg / kg de peso corporal).Visn en el grupo 3, recibieron inyecciones diarias de vehculo en
los das 15, 16 y 17, mientras que visn en el grupo 4 recibieron inyecciones diarias de P4
en los mismos das para simular el cebado E2. El visn en el grupo 1 recibi inyecciones de
vehculo solamente a los das 12, 13 y 14 y represent los controles. Todos los animales
fueron sacrificados 24 h despus de la ltima perturbacin () con una dosis letal de Sleep-
A-Way (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA, EE.UU.), el tero recogido y
congelado rpidamente en nitrgeno lquido. D = da.
Concentraciones de glicgeno en homogeneizados uterinos
Las concentraciones de glicgeno se determinaron usando un procedimiento modificado de
Good et al . ( 1933 ). El tejido uterino (70-120 mg) de cada visn se liofiliz durante 3 das y
se homogeneiz en 20 volmenes de KOH al 30%. Se incub una alcuota de 125 l del
homogeneizado a 100 C durante 30 minutos para desnaturalizar las enzimas y destruir la
glucosa libre. Para aislar el glicgeno, las muestras se diluyeron con 1,2 volmenes (150 l)
de EtOH al 95%, se congelaron a -80C durante 60 min, se descongelaron y se centrifugaron
a 9600 xg durante 10 min. Despus de descartar el sobrenadante, los tubos se invirtieron y el
grnulo se sec durante la noche. Posteriormente, se aadieron 100 \ mu L de HCl 1,0 N al
grnulo, se calentaron a 100C durante 2,5 h para descomponer el glucgeno en D -
glucosa. Las concentraciones de glucosa, como indicador del contenido de glucgeno, se
determinaron usando Wako Glucose Auto Kit (439-90901, Wako Chemicals USA, Inc.,
Richmond, VA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La glucosa se
cuantific espectrofotomtricamente ( = 505 nm) comparando incgnitas con una curva
estndar de concentraciones crecientes de glucosa. Todas las muestras se analizaron por
duplicado, en un solo ensayo con un coeficiente de variacin intra-ensayo del 2,0%.
Localizacin de depsitos de glucgeno en secciones transversales
uterinas
Las muestras uterinas se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, se deshidrataron y
se montaron en bloques de parafina. Secciones transversales uterinas (7 m) fueron
incubadas con cido peridico-Schiff (PAS) reactivo y counterstained con hematoxilina. Las
imgenes fueron capturadas digitalmente a 25, 200 y 400 y analizadas utilizando el
software ImageJ (Ambramoff et al. , 2004 ). Para la cuantificacin del contenido de
glucgeno endometrial y miometrial, se analizaron tres imgenes de corte transversal uterino
consecutivas de cada visn a 25 (seccin transversal uterina completa), mientras que para
el contenido de glicgeno epitelial glandular y luminal, una porcin (a 400 ) de cada una de
Se analizaron tres secciones transversales uterinas consecutivas. Debido a que la PAS tie
los carbohidratos adems del glucgeno, se trat previamente una seccin transversal
adicional con diastasa (A8220, Sigma Chemical Co.), para digerir el glicgeno antes de la
tincin con PAS y sirvi como control negativo. El contenido de glicgeno de cada tejido se
cuantific restando valores de control negativos de secciones teidas con PAS sin diastasa y
luego se expres como un porcentaje del rea que se ti positiva para el glucgeno.
QPCR
Todas las reacciones de qPCR se llevaron a cabo por triplicado utilizando el Kit de PCR
Verde SYTTEC SYBR (204143; QIAGEN) segn las instrucciones del fabricante. Las
concentraciones de cebador directo e inverso se optimizaron previamente y se aadieron a 5
l de plantilla de ADNc (100-200 ng) por reaccin.Los productos de PCR se detectaron en
tiempo real midiendo la fluorescencia verde de SYBR durante la fase de recocido usando el
sistema de PCR en tiempo real MJ Research Chromo4 (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA, EE.UU.).
Temperatura
Los cebadores directo e inverso (5 Amplicn N de
Genes de fusin (
'a 3') (pb) acceso
C)
1. Gys1 , glicgeno sintasa 1; Pygm , glucgeno fosforilasa-msculo; Hk1 , hexoquinasa 1; G6pc3 , glucosa - 6 - fosfatasa
3; Gapdh , gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa.
TCAATAGTAGTGCCGACAGGGTCA
AGCCTTCCCTCCAATCATCACAGT
TGGGTGTGCCCTTGTTATCTCGAA
TGGGCTTGTGAGCTGGCCCTA
ACCAGTGGAAGCAGGGATGATGTT
La eficacia de la duplicacin del amplicn durante cada ciclo de PCR fue: gliceraldehdo 3-
fosfato deshidrogenasa 97%; Glucgeno sintasa 1, 103%; Glucgeno fosforilasa m,
98%;Glucosa-6-fosfatasa 3, 97%; Y hexoquinasa 1, 100%. Los controles negativos no
contenan plantilla y la amplificacin nunca estuvo por encima del fondo. La especificidad
del cebador se determin usando anlisis de la curva de fusin, lo que dio como resultado
una nica temperatura de fusin para cada amplicn.
Los cambios de pliegue en la expresin gnica se determinaron usando el mtodo de curva
estndar relativa (Pfaffl 2001 ). Se generaron curvas estndar a partir de tres pocillos
controlados agrupados. El ADNc de estos teros se diluy (1:10, 1: 100, 1: 1000 y 1:10.000)
o no diluido para construir curvas estndar (cDNA ng / mL frente al ciclo de cuantificacin,
Cq) para cada gen de inters ( R 2 = 0,98-0,99).Los datos se promediaron por grupo de
tratamiento ( n = 5 mink / grupo, cada ensayo en triplicado) y se expresaron en trminos de
diferencia de pliegue relativo en comparacin con los controles.
Se eligi la gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa con la que normalizar nuestros datos, ya
que mostr la menor variacin en la expresin (gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa Cq
para E 2 + 24 h = 21,59 0,22, para E 2 + 96 h, Cq = 21,54 Para P 2 + P = 4 , Cq = 21,64
0,55, para P 4 + 24 h = 21,72 0,33 y para controles, Cq = 22,28 0,22), en comparacin
con 18s rRNA (18s rRNA Cq para E 2 + Para E2 + 96h, Cq = 18,34 0,39, para E2 P4,
Cq = 17,97 0,07, para P4 + 24 h = 18,60 0,56 y para los controles, Cq = 23,05 \ pm
0,48).
Anlisis de Western Blot
Las protenas uterinas se aislaron usando tampn de lisis RIPA (sc-24948 Santa Cruz
Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las
concentraciones de protena se determinaron utilizando el kit de ensayo de protenas Pierce
BCA (23225, Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Las protenas enzimticas de
inters se resolvieron por peso molecular utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida
de dodecilsulfato sdico (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se
bloquearon durante 1 h en tampn de leche al 5% que contena solucin salina tamponada
con Tris-Tween 20 : BP337 - 100, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.) para reducir la
unin no especfica. Las membranas se incubaron posteriormente durante la noche a 4C con
anticuerpos primarios especficos para la glucosa sintasa (3886S, Cell Signalling
Technology, Danvers, MA, USA, dilucin 1: 5000), glucgeno sintasa fosforilada (3891S,
Cell Signalling Technology, dilucin 1: 5000) Y hexoquinasa 1 (2024S, Cell Signaling
Technology, dilucin 1: 1000). Posteriormente, las membranas se lavaron en TBS-T para
eliminar el exceso de anticuerpos primarios. En ese momento se incubaron las membranas
con anticuerpo secundario (inmunoglobulina G anti conejo conjugada con peroxidasa de
rbano picante, 7074, Cell Signaling Technology, dilucin 1: 1000) durante 2 h para detectar
las protenas enzimticas de inters.Concomitantemente (como control de carga) incubamos
membranas con un anticuerpo primario conjugado con peroxidasa de rbano picante (HRP)
contra actina beta (Actb-HRP, 5125S, Cell Signalling Technology, dilucin 1: 10.000)
durante 2 h. A las transferencias con HRP conjugado con el anticuerpo secundario se aadi
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrato (WBKLS0100; Millipore
Corporation), mientras que las muestras que se incubaron con Actb-HRP se incubaron con
Novex HRP Chromogenic Substrato (100002903 Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.
). Las transferencias resultantes se fotografiaron usando Bio-Rad VersaDoc 3000 Imager
(Bio-Rad Laboratories). La cantidad relativa de cada protena de inters se determin
utilizando ImageJ gel analizador para cuantificar la densidad de banda y luego normalizado
a beta actina como un control de carga, con todas las muestras ensayadas en triplicado.
Para validar el uso de anticuerpos primarios contra las protenas de visn, tanto el visn
como las protenas de rata se analizaron simultneamente. Para cada protena ensayada se
detect slo una banda nica correspondiente al peso molecular correcto de cada protena
(glucgeno sintasa, fosfo-glucgeno sintasa y hexoquinasa 1) tanto en la rata y visn tejido
uterino (datos no presentados). Todos los anticuerpos primarios se produjeron contra
protenas humanas y fueron validados por el fabricante contra protenas de rata. Los
anticuerpos contra la glucgeno sintasa no eran especficos de una nica isoforma y por lo
tanto se uniran tanto a la glucgeno sintasa 1 (msculo) como a la glucgeno sintasa 2
(hgado).
Anlisis Estadstico
Todos los datos se analizaron mediante un anlisis de varianza unidireccional, seguido por la
prueba post hoc de Tukey (SigmaPlot, versin 12.5, Systat Software Inc., San Jos, CA,
EE.UU.). Las diferencias se consideraron significativas a P 0,05.
Resultados
El rea endometrial uterina fue cuatro veces mayor a las 24 h y seis veces mayor a las 96 h
despus de la ltima inyeccin de E 2 en comparacin con los controles ovariectomizados
(Tabla 2 , P 0,05). El rea endometrial del visn tratado como E 2 P 4 , fue menor que
E 2 + 96 h de animales tratados ( P 0.05), pero no difiri de E 2 + 24 h mink. Aunque el
rea endometrial del visn tratado con E2 P4 y P4 + 24 h tendi a ser mayor que los
controles, las diferencias no fueron significativas. El rea del miometrio fue mayor a las 24 h
(3,5 veces) y 96 h (2,5 veces) despus de la ltima inyeccin de E 2 en comparacin con los
controles (Tabla 2 ; P 0,05). El rea miometrial del visn tratado como E 2 P 4 no
difiri del visn tratado con E 2 solamente (24 y 96 h) y fue mayor en comparacin con los
controles ( P 0.05). El rea de mioma del visn tratado con P 4 + 24 h no difiri de los
controles ovariectomizados.
1. Dentro de una columna, los medios sin un superndice comn difieren ( P 0.05).
Tabla 2. Promedio ( SE) del endometrio uterino y las reas del miometrio (pxeles
10 4 ). El visn en los grupos 2, 3 y 4 se inyect una vez al da a los das 12, 13 y 14
con estradiol 17beta (E2, 50 g / kg de peso corporal). En los mismos das, el visn en
el grupo 5 recibi inyecciones diarias de progesterona (P4, 25 mg / kg de peso
corporal). El visn en el grupo 3 recibi el vehculo solamente en los das 15, 16 y 17
mientras que el visn en el grupo 4 recibi inyecciones diarias de P4 en los mismos
das. El visn en el grupo 1 recibi el vehculo solamente en los das 12, 13 y 14 y
represent los controles. Todos los visones fueron sacrificados aproximadamente 24 h
despus de la ltima perturbacin
Las concentraciones brutas de glucgeno uterino en el visn tratado como E 2 + 24 h fueron
mayores que para todos los otros tratamientos (Tabla 3 , P 0.05). En E2 + 96 h de visn tratado,
las concentraciones de glicgeno uterino fueron superiores a los controles ( P 0.05), pero
aproximadamente 50% menos que para E2 +24 h de visn tratado ( P 0.05). Para el contenido de
glicgeno uterino tratado con viscosa E2 P4 fue un 70% menor que para los animales tratados
con E2 + 24 h ( P 0,05) y 40% menos que el visn tratado como E2 + 96 h. El tratamiento con
P 4 + 24 h no tuvo efecto sobre el contenido bruto de glucgeno uterino en comparacin con los
controles.