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TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al ttulo de
MICROBILOGO AGRCOLA Y VETERINARIO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al ttulo de
MICROBILOGO AGRCOLA Y VETERINARIO
APROBADO:
_________________________
Maria Ximena Rodrguez
DIRECTORA
________________________ ________________________
Jos Salvador Montaa Pedro Jimnez
JURADO 1 JURADO 2
ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN PARA
PROMOTORES DE CRECIMIENTO VEGETAL (CIDO INDOL ACTICO Y
GIBERELINAS) EN CULTIVOS MICROBIANOS
APROBADO:
_________________________ ________________________
ANGELA UMAA Mphil . JANETH ARIAS PALACIOS
Decana Acadmica Director de Carrera
Do you hear the message in the music now
I hear it too
You know, you got your history in the making now
Slowing down won't get you through, no no
Jamiroquai
AGRADECIMIENTOS
A tesistas del laboratorio 131 (Anglica, Pablito, Daniel, William, Caro Bello,
Ruth) que ya casi lo logramos todos.
Y a todos los que se queden por fuera de esta lista, pero que igualmente
saben que nos apoyaron y nos ayudaron y que les agradecemos.
1. INTRODUCCIN4
2. MARCO TEORICO7
1.1.1 ETILENO.10
1.1.2 ACIDO ABSCSICO...11
1.1.3 CITOQUININAS.12
1.1.4 BRASINOESTEROIDES..12
1.1.5 ACIDO JASMNICO..........................................................13
2.2 AUXINAS13
2.2.1 CARACTERSTICAS GENERALES13
2.2.2 REGULACIN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA14
2.2.3 BIOSNTESIS DE AUXINAS EN PLANTAS.............18
2.3 GIBERELINAS.19
2.3.1 CARACTERSTICAS GENERALES20
2.3.2 REGULACIN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA22
2.3.3 BIOSNTESIS DE GIBERELINAS EN PLANTAS..22
2.4 RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO
VEGETAL.24
2.4.1 MECANISMOS DE ACCIN DE PGPRs.24
2.4.1.1 Mecanismos de accin directa ...25
2.4.1.2 Mecanismos de accin indirecta.. ...29
2.4.2 BIOSNTESIS DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO
VEGETAL...30
2.4.2.1 Biosntesis de auxinas por bacterias...........................30
2.4.2.1.1 Ruta Indol 3 acetamida (IAM).. 30
2.4.2.1.2 Ruta Indol 3-Piruvato (IPvA)..31
I
2.4.2.2 Biosntesis de giberelinas por bacterias.32
2.5 MTODOS DE DETECCIN DE REGULADORES DE
CRECIMIENTO VEGETAL34
2.5.1 MTODOS DE DETECCIN COLORIMTRICA DE
REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL36
2.5.1.1 Deteccin colorimtrica de auxinas36
2.5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky 36
2.5.1.2 Deteccin colorimtrica de giberelinas..36
2.5.1.2.1 Reactivo de Folling-Wu (cido fosfomolbdico).36
2.5.1.2.2 Reactivo 2,4-cido dinitrofenilhidrazina..37
2.5.2 DETECCIN FSICO-QUMICA DE REGULADORES DE
CRECIMIENTO VEGETAL.37
2.5.2.1 Cromatografa de capa fina (TLC)..37
2.5.2.2 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).38
2.5.2.3 Cromatografa de gases acoplada a espectroscopa de
masas (GCMS)..38
2.5.2.4 Espectrofluorometra.39
3. JUSTIFICACIN.41
4. OBJETIVOS44
4.1 OBJETIVO GENERAL44
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS..44
5. MATERIALES Y MTODOS45
5.1 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE
AUXINAS (CIDO INDOL ACTICO, AIA)...45
5.1.1 DETECCIN COLORIMTRICA..45
5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky..45
5.1.1.2 Evaluacin del espectro de absorbancia (400-700nm)
para las reacciones con diferentes formulaciones del
reactivo de Salkowsky... 47
II
5.1.2 DETECCIN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO
VEGETAL POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA
(TLC)47
5.2 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE
GIBERELINAS50
5.2.1 DETECCIN COLORIMTRICA..50
5.2.1.1 Reactivo Folling-Wu cido Fosfomolibdico.50
5.2.1.2 Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina.51
5.2.2 DETECCIN FLUOROMTRICA.52
5.3 BIOENSAYO PARA LA DETECCIN DE AUXINAS Y
GIBERELINAS53
5.3.1 NDICES DE GERMINACIN...54
5.4 MICROORGANISMOS.55
5.4.1 MEDIOS DE CULTIVO...56
5.4.2 RECUPERACION Y RECONSTITUCIN DE CEPAS.56
5.5 PRODUCCION DEL INOCULO PARA LA FERMENTACIN.56
5.5.1 PREPARACIN DEL INCULO Azotobacter vinelandii y
Azospirillum brasilense..56
5.5.2 PREPARACIN DEL INCULO DE LAS CEPAS DEL
BIOINOCULANTE (14 Cepas)..57
5.5.3 FERMENTACIN DISCONTINUA...57
5.5.3.1 Fermentacin discontinua de cepas de referencia y
estandarizacin de medio de cultivo....................57
5.5.3.2 Fermentacin discontinua de las cepas del
bioinoculante..58
5.6 MTODOS DE DETECCIN DE REGULADORES DEL
CRECIMIENTO VEGETAL A PARTIR DE CULTIVOS
MICROBIANOS........................................................................58
5.6.1 DETECCION DE AUXINAS MICROBIANAS..58
5.6.1.1 Deteccin colorimtrica (Reactivo de Salkowsky)...58
III
5.6.1.1.1 Curva patrn de cido indol actico (AIA). 58
5.6.1.1.2 Determinacin de produccin de cido indol actico
(AIA) en cultivos microbianos..59
5.6.1.2 Deteccin de auxinas y giberelinas por cromatografa
de capa fina (TLC)..59
6. RESULTADOS Y DISCUSIN.61
6.1 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE
AUXINAS.61
6.1.1 DETECCIN COLORIMTRICA (REACTIVO DE
SALKOWSKY)61
6.2 DETECCIN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO
VEGETAL POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (TLC)71
6.2.1 ESTANDARIZACIN DE FASE MVIL PARA TLC.71
6.2.2 DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN
TLC...73
6.2.3 LIMITES DE DETECCION DE REGULADORES DE
CRECIMIENTO VEGETAL EN TLC (AIA, IBA, GA3)75
6.3 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE
GIBERELINAS76
6.3.1 DETECCIN COLORIMTRICA76
6.3.1.1 Reactivo Folling-Wu (cido fosfomolbdico).................76
6.3.1.2 Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina..77
6.3.2 DETECCIN FLUOROMTRICA..79
6.4 DETECCION DE CIDO INDOL ACTICO EN CULTIVOS
MICROBIANOS POR REACCIN DE SALKOWSKY.81
6.4.1 CURVA PATRN DE CIDO INDOL ACTICO (AIA)..81
6.4.2 PRODUCCIN DE CIDO INDOL ACTICO (AIA)..82
6.4.2.1 Azotobacter vinelandii..82
6.4.2.2 Azospirillum brasilense87
6.4.2.3 Cepas bioinoculante...89
IV
6.5. DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN
CULTIVOS MICROBIANOS POR CROMATOGRAFA DE CAPA
FINA (TLC)..93
6.5.1 Azotobacter vinelandii.93
6.5.2 Azospirillum brasilense95
6.5.3 CEPAS BIOINOCULANTE..97
6.6 BIOENSAYO PARA DETECCIN DE ACTIVIDAD DE
REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL..105
6.6.1 ANLISIS ESTADSTICO107
6. 7 ANLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIN GENERAL116
7. CONCLUSIONES122
8. RECOMENDACIONES124
9. REFERENCIAS126
V
NDICE DE TABLAS
VI
Tabla 6.10 Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de
crecimiento en cultivos de Azotobacter vinelandii..93
Tabla 6.11 Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de
crecimiento en cultivos de Azospirillum brasiliense94
Tabla 6.12 Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de
crecimiento en cultivos de cepas del bioinoculante98
Tabla 6.13 Anlisis multivariado MANOVA para la variable rplica en la
interaccin tratamiento*rplica en pruebas de bioensayos.108
Tabla 6.14 Valores de P (ANOVA) para la deteccin de actividad de
reguladores de crecimiento en bioensayos108
Tabla 6.15 Tablas de comparacin Duncan para estadio 1..113
Tabla 6.16 Tablas de comparacin Duncan para estadio 2..114
Tabla 6.17 Tablas de comparacin Duncan para estadio 3..115
Tabla 6.18 Resultados de los mejores tratamientos para los montajes 1 y 2
de evaluacin de lo reguladores, y montaje 3 de evaluacin de
microorganismos116
VII
NDICE DE FIGURAS
VIII
Figura 6.5 Espectro de absorcin de reacciones con diferentes
formulaciones de reactivo de Salkowsky (AIA 30ug/m).69
Figura 6.6 Espectro de absorcin de reacciones con formulaciones de
reactivo de Salkowsky modificadas (AIA 30ug/m)..70
Figura 6.7 Cromatogramas luz visible y UV S13, S5, S2.............................74
Figura 6.8 Lmite de deteccin de reguladores de crecimiento vegetal (AIA,
IBA y GA3) en TLC...75
Figura 6.9 Reaccin con cido fosfomolbdico a diferentes concentraciones
de GA3.76
Figura 6.10 Reaccin de cido fosfomolbdico con una mezcla de AIA y GA3.
(1:1)77
Figura 6.11 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferente
concentraciones de GA3.78
Figura 6.12 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferentes
concentraciones de AIA.78
Figura 6.13 Curva patrn de concentraciones AIA con reactivo Salkowsky
(R1m)81
Figura 6.14 Curvas de produccin de AIA por Azotobacter vinelandii en
diferentes medios82
Figura 6.15 Produccin AIA por A. vinelandii ATCC12518 en medio BT83
Figura 6.16 Curvas crecimiento(Abs540) y produccin de AIA (ug/ml) de
Azotobacter vinelandii en diferentes medios de cultivo85
Figura 6.17 Curvas de produccin de AIA por Azospirillum brasilense en
diferentes medios86
Figura 6.18 Curvas crecimiento (Abs540nm) y produccin de AIA (ug/ml) de
Azospirillum brasilense en diferentes medios.87
Figura 6.19 Produccin de AIA por las cepas del bioinoculante evaluado, y
curva de produccin de AIA por Azotobacter vinelandii ...90
Figura 6.20 Cromatgramas A. vinelandii. ..................................................94
Figura 6.21 Cromatgramas A. brasilense...................................................96
IX
Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante99
Figura 6.23 Estados de desarrollo Lactuca sativa L.108
X
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO..132
ANEXO 2
GRFICAS DE PRODUCCIN AIA133
ANEXO 3
ESTADSTICA BIOENSAYO139
XI
Resumen
1
promoviera la produccin de los reguladores y as mismo el desarrollo
microbiano.
2
Abstract
Finally, a bioassay was performed. This assay let to determine the effect of
different plant growth regulators at three development stages in lettuce
seedlings. Following that, it was possible to associate plant growth regulator
production and effects on seedlings development to lettuce seeds treated
with microbial broths.
3
1. INTRODUCCIN
4
Las giberelinas (GAs), funcionan como reguladores de crecimiento vegetal al
estar estrechamente asociadas a la promocin de la germinacin de las
semillas, crecimiento del tallo, inducir la brotacin de yemas y el desarrollo de
los frutos. Existen varios tipos de giberelinas, siendo las ms comunes: GA1,
GA3, GA4, GA7 y GA9.
5
concentraciones y pueden encontrarse mezclados con otros compuestos
debido a que se generan como metabolitos secundarios, lo que hace
necesaria la purificacin eficiente del compuesto.
Este trabajo hace parte del proyecto Formacin de tcnicos para mejorar la
calidad de suelos en pases en va de desarrollo: empleo de compost
mejorado biotecnolgicamente en cultivos orgnicos, financiado por la
Fundacin Internacional de Universidades Catlicas (FIUC).
6
2. MARCO TERICO
7
Existen siete clases de reguladores de crecimiento vegetal entre los cuales
se encuentran auxinas, giberelinas, citoquininas, brasinosteroides, cido
abscsico, etileno y cido jasmnico,, las cuales participan en la regulacin
del crecimiento y desarrollo de la planta (Kende & Zeevaart, 1997; Tanimoto,
2005).
La actividad de estos
reguladores sigue una
dinmica de regulacin
intrnseca y un movimiento
dentro de la planta (Figura
2.1), establecido en base a
estudios clsicos desde el
sitio de produccin y
transporte de cada
regulador (Tanimoto, 2005).
Algunos de estos
reguladores son adquiridos
del suelo afectando el
desarrollo de la planta.
Figura 2.1 Movimientos de los reguladores de crecimiento
en la planta. Tomado de Tanimoto, 2005.
8
Los reguladores de crecimiento vegetal, actan de uno u otro modo en
9
La caracterizacin qumica de stos, fue establecida a partir de tejidos de
plantas superiores, y su descubrimiento fue a travs de ensayos a partir de
extracto de tejidos y la accin de cada regulador, auxinas a partir de orina,
giberelina de cultivos filtrados de Gibberella fujikoroi, entre otros. Hoy en da
se utilizan mtodos de extraccin y purificacin como HPLC, TLC y GC-MS,
entre otros (Davies, 1988).
2.1.1 ETILENO
En 1935, Crocker propuso al etileno
como regulador del crecimiento
vegetal tras varios aos de
observacin como regulador y como
producto sintetizado por la planta
(Davies, 1988). Hoy en da es
Figura 2.2 Estructura qumica del Etileno.
reconocido como un regulador del
Tomado de www.plant-hormone info.
crecimiento vegetal de tipo
gaseoso (Figura 2.2), que
10
2.1.2 CIDO ABSCSICO
11
2.1.3 CITOQUININAS
2.1.3 BRASINOESTEROIDES
Siendo estos reguladores de crecimiento vegetal recientemente
determinados, los brasinoesteroides son conocidos como reguladores
nuevos con mltiples efectos. Estimulan el alargamiento celular, el
alargamiento del tubo polnico y la diferenciacin del tejido vascular, e inhiben
el alargamiento de la raz (Taiz & Zeiger, 2006).
12
2006). El tratamiento con nanogramos de brasinoesteroides por planta es
suficiente para promover el crecimiento, por lo que sern de importancia en
la agricultura, al aumentar los rendimientos de cultivos (Purves et al, 2002).
2.2 AUXINAS
13
Figura 2.5 Estructura qumica del cido 3-Indol Actico.
Tomado de www.plant-hormone info.
Para que una sustancia exhiba accin auxnica debe tener un radical cido o
ser fcilmente convertible a l, un anillo aromtico y de uno a cuatro
carbonos entre el carboxilo y el anillo(Rojas & Ramirez, 1987).. Todas las
auxinas sintticas causan efectos parecidos pero cada producto individual
tiene una aplicacin particular dentro de la regulacin o accin auxnica (Taiz
& Zeiger, 2006)
Derivados del indol como cido indol propinico (IPA), cido indol
butrico (IBA) (Figura 2.6) y el ido 3-indol actico (AIA) (Figura 2.5).
Derivados del naftaleno, como cido naftalen actico (NAA) (Figura
2.6), cido naftoxiactico (Noxa o BNOA), cido naftilpropinico
(NPA).
Derivados fenoxi, usados como herbicidas selectivos y algunas veces
como reguladores del crecimiento vegetal.
14
4-clorindol-3-acido acetico (4-Cl-IAA) Acido indol actico-aspartico
15
Acido 2,4,5-triclorofenoxiactico Acido 2,4 - diclorofenoxiactico
La elongacin celular, est generada por la respuesta del tejido a las auxinas
las cuales son resumidas por Arteca, 1996 en:
16
Cambi en las relaciones hdricas de la clula, aunque el potencial
osmtico no cambia; el potencial de la clula se torna negativo.
Al disminuir el potencial hdrico, el agua dentro de la clula se mueve
hacia la pared celular ejerciendo presin y ocasionando la elongacin
celular.
Una vez elongada la clula, los enlaces covalentes entre la celulosa y
los polisacridos de la pared son establecidos nuevamente.
17
2.2.3 BIOSNTESIS DE AUXINAS EN PLANTAS
Las auxinas son producidas en las plantas a partir del catabolismo del
triptfano lo cual se observ en ensayos en donde al colocar triptfano ste
era catabolizado por el tejido en AIA, aumentando su concentracin en el
mismo (Salisbury et al., 1994; Taiz & Zeiger, 2006).
Figura 2.8 Biosntesis de AIA en plantas. Tomado de Taiz & Zeiger, 2006
18
El triptfano est compuesto por un grupo indol y est universalmente
presente en los tejidos vegetales, ya sea en forma libre o incorporada. Hay
tres rutas principales de sntesis de auxinas dependientes del triptfano (Taiz
& Zeiger, 2006).
2.3 GIBERELINAS
19
inductor del sobrecrecimiento del tallo que se denomin cido giberlico.
Pocos aos despus, se comprob que las plantas tambin poseen
compuestos con estructuras muy semejantes al cido giberlico (Agrios,
2004).
Desde el punto de vista qumico, las GAs (Figura 2.9) constituyen una familia
de diterpenos tetracclicos cidos cuyo esqueleto est constituido por un
anillo ent-giberelano de 20 o 19 tomos de carbono. Sin embargo, a nivel
fisiolgico, en este grupo solamente se pueden distinguir unos pocos
miembros con capacidad para influir en el crecimiento vegetal o giberelinas
activas (Arteca, 1996).
20
Figura 2.9 Estructura qumica de las giberelinas. Tomado de Life the Science of Biology, 2001.
21
2.3.2 REGULACIN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA
22
est catalizada por dos monooxigenasas de membrana dependiente de
NADPH; la ent-kaureno oxidasa (KO) y cido ent-kaurenoico oxidasa (KAO),
cada uno de los cuales cataliza tres pasos metablicos consecutivos. Estas
rutas son comunes a todos los organismos incluyendo microorganismos
(Arteca, 1996; Martinez & Garca, 2004). La tercera etapa de la biosntesis de
GAs tiene lugar en el citoplasma y en ella intervienen dioxigenasas solubles
dependientes de 2-ceto-glutarato y Fe+2, esta es la etapa ms compleja en la
que se han descrito dos rutas metablicas importantes denominadas:
No hidroxilacin temprana en el carbono 13
Hidroxilacin temprana en el carbono 13
Figura 2.10 Rutas de biosntesis de las giberelinas en plantas. Tomado de Martinez & Garca, 2004
23
2.4 BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL
24
2.4.1.1 Mecanismos de accin directa
25
con reconocida actividad como productoras de reguladores de crecimiento se
encuentran los gneros Azospirillum y Azotobacter los cuales al penetrar la
raz producen giberelinas, auxinas, citoquininas, cido abscsico y fijan
nitrgeno (Vargas et al, 2001), lo que las convierte en excelentes
biofertilizantes. Para el gnero Pseudomonas tambin se ha reportado la
capacidad de produccin de auxinas y giberelinas (Vargas et al., 2001).
26
Se han identificado cerca de 130 clases de giberelinas, provenientes de
plantas, bacterias y hongos de las cuales las ms comunes y biolgicamente
activas son GA1, GA3 y GA4 (Cassan et al., 2001). En recientes artculos se
han reportado al rededor de 89 tipos de giberelinas producidas por
diazotrficos (microorganismos fijadores de nitrgeno). Gracias a distintos
experimentos se ha observado la produccin de giberelinas por Azotobacter
sp., Pseudomonas sp., Rhizobium leguminosarium bv phaseoli, Azospirillum
brasilense, Azospirillum lipoferum, Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum
seropedicae, Bacillus pumilus y Bacillus licheniformes (Dobbelaere et al.,
2003).
27
tiene un efecto similar a inoculaciones con Azospirillum lipoferum al promover
el desarrollo de las races a las 48 horas de la inoculacin en plntulas de
maz especialmente incrementando la densidad de los pelos radicales en
reas fisiolgicamente activas para la absorcin de nutrientes y agua
(Dobbelaere et al., 2003; Garcia de Salomone & Dobereiner, 1996). En un
estudio comparativo, aplicaciones de GA3 e inoculaciones con Azospirillum
sp., fue comparado su efecto en altura y peso fresco sobre plantas de maz
sometidas a un tratamiento inhibidor de la sntesis de giberelinas. Se
observaron niveles parecidos en el incremento de la altura de las plantas
inoculadas con Azospirillum brasilense y Azospirillum lipoferum con relacin
a las que se les adicion la GA3, concluyendo que las GAs producidas por
Azospirillum sp. juegan un papel importante en el desarrollo de gramneas
(Dobbelaere et al., 2003). Los miembros de este gnero ofrecen un
excelente modelo para establecer la produccin de auxinas y su biosntesis,
al igual que investigar las asociaciones plantabacteria. Investigaciones
enfocadas a la biosntesis de AIA en Azospirillum brasilense ponen de
manifiesto varias rutas de biosntesis dependientes de triptfano, y
utilizndolo como modelo en el estudio de biosntesis de AIA en bacterias
(Zakharova et al, 1999).
28
suelo, la textura y estructura del suelo. Gracias a la gran abundancia de
microorganismos en la rizsfera inducidos por la liberacin de compuestos
orgnicos por las plantas, se incluyen una serie de factores biticos que
afectan la supervivencia de las PGPR en el suelo, dentro de stas se incluye
predacin por nemtodos y protozoos, actividad de bacterifagos,
competencia microbiana por recursos e interacciones directas como
inhibicin de la actividad microbiana por produccin de antibiticos y
sinergismo o incremento de nutrientes disponibles (Strigul & Kravchenko
2005).
29
2.4.2 BIOSNTESIS DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL
Las auxinas son derivadas del triptfano (Trp), por mltiples rutas
metablicas, pero solo puede ser sintetizado funcionalmente por rutas
dependientes de Trp.
Esta ruta fue descrita inicialmente como una ruta de sntesis especfica para
bacterias, ya que no habia evidencia de su existencia en plantas, hasta el
uso de tcnicas de alta sensibilidad para la deteccin de IAM en tejidos de
Arabidopsis thaliana, en donde se encontr que tambin hace parte de las
rutas de sntesis utilizadas por las plantas (Piotrowski et al., 2001; Pollmann
30
et al., 2002).
31
Figura 2.11 Biosntesis de AIA en bacterias. Tomado de Piotrowski et al. 2001
32
donde el acetato y el mevalonato son considerados como precursores
importantes de la sntesis de los isoterpenoides (Rohmer, 2003).
AcetilCoA
Acido Mevalnico
GIBERELINAS GA3
Isopentenil Pirofosfato
GA12 aldehdo
Dimetilalil Pirofosfato
Geranio Pirofosfato
7Acido Kaurenoico Hidroxilado
Farnesil Pirofosfato
Geranilgeranil Pirofosfato
Copil Pirofosfato
Ent- Kaurenal
Ent- Kaurenol
Figura 2.12 Ruta de sntesis de giberelinas siguiendo del Acido Mevalnico. Tomado de Davies, 1988
33
2.5 MTODOS DE DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO
VEGETAL
34
de rutina, el cual se emplea para la purificacin y separacin de giberelinas.
Mientras que para su deteccin se han desarrollado diferentes mtodos,
como la cromatografa de capa fina (TLC), cromatografa de gases (GC),
cromatografa de gases y espectrofotometra de masas (GCMS) (Castillos,
1997). De esta forma la produccin in vitro de giberelinas por Azospirillum
sp., y el efecto de las mismas han sido estudiados por espectrofotometra de
masas (MS), por medio de esta tcnica se ha logrado establecer al
microorganismo como productor de auxinas y giberelinas exgenos de la
clase, GA1 y GA3 (Cassan, 2001).
35
2.5.1 MTODOS DE DETECCIN COLORIMTRICA DE REGULADORES
DEL CRECIMIENTO VEGETAL
36
color del reactivo a azul mostrando la reduccin ocasionada por la presencia
de giberelina en la solucin (Graham & Henderson, 1960).
37
La tcnica permite por tanto separaciones eficientes de mezclas complejas,
identificacin preliminar de sus constituyentes como deteccin de
compuestos indeseables.
38
presentan inconvenientes de este tipo por lo que es comnmente usada en la
identificacin y cuantificacin en este tipo de sustancias (Arteca, 1996).
Este mtodo fue el primero en ser usado para el anlisis de reguladores de
crecimiento vegetal por McMillan y sus colaboradores quienes trabajaron en
la identificacin de giberelinas. Aunque se conocen varias giberelinas, y son
de estructura qumica similar, se diferencian por la sustitucin de tomos los
cuales pueden ser reflejados en el espectro de masas lo que permite una
identificacin exacta no solo del grupo (giberelinas) sino de la molcula en si,
con lo cual se determina si es biolgicamente activa o no, al igual que se
observan diferencias en los derivados que producen (Davies, 1988).
2.5.2.4 Espectrofluoromtria
Bajo ciertas condiciones, los tomos absorben fotones de una longitud de
onda determinada, emiten algunas porciones de energa como fotones de
longitud de onda ms larga (energa ms baja), produciendo fenmenos
conocidos como fluorescencia y fosforescencia (Ramrez et al, 1996).
39
La eficacia cuantitativa de la tcnica disminuye con el aumento de la
temperatura, y el fenmeno de fluorescencia se ve afectado por tetrabromuro
de carbono y/o yoduro de etilo al igual que la concentracin de oxgeno que
ocasiona atenuacin (quenching) (Skoog & Leary, 1993).
40
3. JUSTIFICACIN
41
Las giberelinas, cumplen varios procesos importantes dentro de las plantas
entre los que se encuentran: induccin de sntesis enzimtica, promocin de
la germinacin de semillas, rompimiento de estados de dormancia o latencia
de estructuras vegetativas o semillas, activacin de la elongacin de tallos y
races, desarrollo de frutos.
42
eficiente y segura que permita obtener la mxima efectividad de cada mtodo
en la deteccin de auxinas y giberelinas producidas, lo que se lograr
estableciendo el tiempo exacto de produccin de los reguladores de
crecimiento vegetal por parte de los microorganismos, logrando de esta
forma una curva de producto que puede ser aplicable a varios tipos de
microorganismos. Gracias a esto, se podra llegar a evaluar la viabilidad y
efectividad de distintos productos, desarrollar investigaciones y generar un
avance biotecnolgico, todo esto con el fin de aprovechar los beneficios que
pueden llegar a generar el uso de auxinas y giberelinas para el desarrollo de
una mejor agricultura.
43
4. OBJETIVOS
44
5. MATERIALES Y MTODOS
45
escala de colores ms cercana a los obtenidos con el reactivo a base de
cido perclrico..
Tabla 5.1 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de mezclas de cido perclrico y cloruro
frrico y cido sulfrico y cloruro frrico.
Concentracin Volumen de reaccin
Reactivo FeCl3 H2SO4 HClO4 AIA Salkowsky Referencias
Perclrico 10 mM - 3,5 M 1 mL 2mL Bric et al, 1990
R1 40 mM 7,9 M - 1 mL 1 mL Glickmann & Dessaux, 1994
R2 16 mM 10,8 M - 1 mL 1 mL Glickmann & Dessaux, 1994
R3 9,2 mM 6,9 M - 1 mL 1 mL Glickmann & Dessaux, 1994
Tabla 5.2 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de cido sulfrico con diferentes
modificaciones en cuanto a concentraciones de H2SO4 y FeCl3 y diferentes volmenes de reaccin.
Concentracin Volumen de reaccin
Reactivo FeCl3 H2SO4 AIA Salkowsky
R1m 40 mM 7,9 M 1 mL 2mL
R1m1 40 mM 10,8 M 1 mL 1 mL
R1m2 40 mM 10,8 M 1 mL 2mL
R2m 16 mM 10,8 M 1 mL 2mL
46
5.1.1.2 Evaluacin del espectro de absorbancia (400-700nm) para las
reacciones con diferentes formulaciones del reactivo de Salkowsky.
47
Tabla 5.3. Descripcin de fases mviles utilizadas en la estandarizacin de TLC para deteccin de
reguladores de crecimiento vegetal.
Fase
Solvente Proporciones Referencias
Mvil
S1 CHCl3 : CH3COOC2H5 :CH3COOH 90:5:10 Zeevart, 1965
Metzger &
S2 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 50:30:20 Zeevart, 1980
S3 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 60:40:5 Torres et al, 2000
S4 CHCl3 : CH3COOC2H5 : HCOOH 50:40:10 Tien et al, 1979
Barazani &
S5 CHCl3 : CH3COOC2H5 : HCOOH 30:55:10 Friedman, 1999
Modificado de
S6 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 50:30:5 Torres et al, 2000
Modificado de
S7 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 50:30:10 Torres et al, 2000
Ahmad & Ahmad,
S8 CHCl3 : CH3COOC2H5 : HCOOH 50:30:10 2004
Ross & Bradbeer,
S9 CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH 15:5:1 1968
Sweet & Lewis,
S10 CHCl3 : CH3COOH 95:5 1971
Sweet & Lewis,
S11 (CH3)2CHOH : NH4OH 25% : H2O 8:1:1 1971
Strzelczyk et al,
S12 (CH3)2CHOH : NH4OH 25% : H2O 10:1:1 1983
S13 (CH3)2CHCH2OH : CH3COOH : H2O 12:3:5 Tien et al, 1979
Contreras et al,
S14 ETER PETROLEO:CH3COOC2H5 60:40 2001
Contreras et al,
S15 CH2Cl2:CH3COOC2H5 : CH3COOH 90:10:1 2001
Contreras et al,
S16 ETER PETROLEO:CH3COOC2H5 30:70 2001
El revelador utilizado fue H2SO4 60% y FeCl3 28mM, con una composicin
similar al reactivo de Salkowsky, garantizando la deteccin de auxinas (AIA),
y citado en literatura como revelador para giberelinas (Merck, 1980).
La aplicacin del revelador para la estandarizacin se realiz por medio de
inmersin (Figura 5.1) y no por aspersin (Figura 5.2), por la facilidad de
manejo de las placas de tamao (3.5cm x 10cm) y para garantizar el
cubrimiento total del revelador sobre la placa.
48
Figura 5.1. Revelado por inmersin
49
5.2 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE
GIBERELINAS
50
AIA (Sigma-Aldrich) (1:1), y solo AIA comercial a una concentracin de
100g/l.
51
tubos a un bao de hielo durante 5 minutos, posteriormente se aadieron
2 gotas de KOH al 10% en alcohol etlico al 80%, se homogeniz y se dej
reaccionar durante 5 minutos. El desarrollo de color rojo vino mostr una
reaccin positiva, y se midi la intensidad del color a 430 nm en un
espectrofotmetro (Genesis 20) (Graham & Thomas, 1960).
52
5.3 BIOENSAYO PARA LA DETECCIN DE AUXINAS Y GIBERELINAS
Las cmaras hmedas fueron montadas con 20 semillas por caja, colocando
5 por cada surco, y acordeones de 4 surcos, con 4 repeticiones por
tratamiento, para un total de 80 semillas por tratamiento (ISTA, 2006). La
inoculacin con el caldo del ultimo dia del cultivo microbiano, los patrones
comerciales de reguladores y los productos comerciales de las semillas fue
realizada previa imbibicin en la solucin de cada tratamiento, GA3
53
(100ug/mL), AIA (100ug/mL), IBA (100ug/mL), Gibgro GA3 10% (200ppm),
Hormonagro (ANA 17,2g/L, 500ppm) y agua, durante 10 minutos y
posteriormente colocadas en cmara hmeda. La evaluacin de las cepas de
referencia y de las cepas del bioinoculante fue realizada imbibiendo las
semillas durante 10 minutos en los caldos de cultivo (sobrenadante) de la
fermentacin discontinua de cada cepa.
Con los datos de los estadios de desarrollo de las plntulas obtenidos a partir
del montaje en las cmaras hmedas, se establecieron ndices o parmetros
de evaluacin de crecimiento (Tabla 5.4), los cuales se evaluaron para el
54
resto de estadios para establecer diferencias significativas entre cada
tratamiento, en el cambio de estadio a estadio y su posible efecto sobre las
plntulas.
Tabla 5.4 ndices de germinacin. Tomado de Czabator, 1964;Thomson & Elkassaby., 1993
Indice Definicin
5.4 MICROORGANISMOS
55
hongos mesfilos a partir de la fraccin orgnica de residuos slidos urbanos
(Rodrguez & Ruiz, 2006).
56
5.5.2 PREPARACIN DEL INCULO DE LAS CEPAS DEL
BIOINOCULANTE (14 Cepas)
57
5.5.3.2 Fermentacin discontinua de las cepas del bioinoculante
La fermentacin discontinua para las cepas del bioinoculante se realiz
siguiendo el mismo procedimiento descrito en el numeral 5.5.3.1, pero
solamente se llev a cabo en Caldo B y Caldo BT.
58
espectrofotmetro (Genesis 20) a 530nm. Las mediciones se realizaron por
triplicado y se determin la curva de calibracin y la ecuacin de la recta.
59
Finalmente la fraccin orgnica concentrada se reconstituy en 50ul de
metanol, sonicando las muestras durante 45 minutos.
Los cromatgramas fueron realizados en placas de silica gel para deteccin
de fluorescencia (Merck) de 10 x 10 cm, las cuales fueron limpiadas
previamente en la fase mvil de cloroformo: acetato de etilo: acido actico
(50:30:20).
60
6. RESULTADOS Y DISCUCION
a c
b d
Figura 6.1 Curvas de deteccin AIA con el reactivo de Salkowsky a base a de cido perclrico y cido
sulfrico: a Salkowsky HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1 (H2SO4 7,9 M
FeCl3 40 mM, 1:1), c Salkowsky R2 (H2SO4 10,8 M FeCl3 16 mM, 1:1), d Salkowsky R3 (H2SO4 6,9
M FeCl3 9,2 mM, 1:4); se observan los datos de pendiente y R2 para cada una de las reacciones.
61
Curva deteccin AIA - Salkowsky Curva deteccin AIA - R1
(HClO4 3.5M - FeCl3 10mM, 1:2) (H2SO4 7.9M - FeCl3 40mM, 1:1)
a b
c d
Figura 6.2 Muestras de reaccin de diferentes concentraciones de AIA con los diferentes reactivos de
Salkowsky. a Salkowsky HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salkowsky R1 (H2SO4 7,9 M
FeCl3 40 mM, 1:1), c Salkowsky R2 (H2SO4 10,8 M FeCl3 16 mM, 1:1), d Salkowsky R3 (H2SO4 6,9
M FeCl3 9,2 mM, 1:4); se observa la escala de color segn las diferentes concentraciones de AIA.
62
6.1) y el color de la reaccin, se realizaron unas modificaciones a los
reactivos R1 y R2 (Glickmann & Dessaux, 1995) debido a que estos
presentaron datos ms altos de pendiente y R2 que los datos obtenidos con
el reactivo R3, comparados con los datos obtenidos a partir de la curva de
calibracin realizada con Salkowsky a base de HClO4. El color de la reaccin
fue similar en los cuatro para las cuatro formulaciones del reactivo. Teniendo
en cuente estas observaciones, se decidi variar la proporcin de reaccin
entre AIA y el reactivo, as como las concentraciones de H2SO4 y FeCl3
(Tabla 5.2). Nuevamente se compar la sensibilidad de cada reactivo (Figura
6.3) y el color de reaccin, buscando una coloracin similar a la gama de
colores observada en reaccin con Salkowsky a base de HClO4 (Figura 6.4).
Tabla 6.1 Datos de pendiente, R2 y color obtenidos a partir de la reaccin de HClO4, R1, R2 y R3 con
AIA, los asteriscos pertenecen a la gama de color del reactivo a base de acido perclorico el cual cuenta
con 4 asteriscos, buscando una comparacin entre la gama de color con los reactivos evaluados.
63
a c
b d
Figura 6.3 Curvas de deteccin de AIA con el reactivo de Salkowsky a base a de cido perclrico y
cido sulfrico: a Salkowsky a base de HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1m
(H2SO4 7,9 M FeCl3 40 mM, 1:2), c Salkowsky R1m1 (H2SO4 10,8 M FeCl3 40 mM, 1:1), d
64
Curva deteccin AIA - Salkowsky Curva deteccin AIA - R1m
(HClO4 3.5M - FeCl3 10mM, 1:1) (H2SO4 7.9M - FeCl3 40mM, 1:2)
a b
Curva deteccin AIA - R1m1 Curva deteccin AIA - R1m2
(H2SO4 10.8M - FeCl3 40mM, 1:1) (H2SO4 10.8M - FeCl3 40mM, 1:2)
c
d
e
Salkowsky R1m2 (H2SO4 10,8 M FeCl3 40 mM, 1:2), e Salkowsky R2m (H2SO4 10,8 M FeCl3 16
mM, 1:2); se observan los datos de pendiente y R2 para cada una de las reacciones.
Figura 6.4 Muestras de reaccin de diferentes concentraciones de AIA con los diferentes reactivos de
Salkowsky. a Salkowsky a base de HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1m (H2SO4 7,9 M
FeCl3 40 mM, 1:2), c Salkowsky R1m1(H2SO4 10,8 M FeCl3 40 mM, 1:1), d Salkowsky R1m2 (H2SO4
10,8 M FeCl3 40 mM, 1:2), e Salkowsky R2m (H2SO4 10,8 M FeCl3 16 mM, 1:2); se observa la escala de
color segn las diferentes concentraciones de AIA.
65
Al obtener los datos de las reacciones del patrn de AIA con los reactivos R1m,
R1m1, R1m2 y R2m (Tabla 6.2) y los diferentes patrones de color (Figura 6.4)
observados en el momento de la reaccin, en comparacin con los datos iniciales
de la reaccin de AIA con Salkowsky preparado con HClO4 y de acuerdo a las
pendientes de las grficas y la escala de color que presento la reaccin se decidi
trabajar con el reactivo R1m, el cual presenta mayor sensibilidad y color de
reaccin con el reactivo a base de cido perclrico. El reactivo R1m1 presenta
mayor sensibilidad que el R1m, pero la reaccin muestra una tonalidad diferente a
la reaccin con Salkowsky-HClO4.
Tabla 6.2 Datos de pendiente y R2 obtenidos a partir de la reaccin de R1m, R1m1, R1m2 y R2m con AIA.
los asteriscos pertenecen a la gama de color del reactivo a base de acido perclorico el cual cuenta con 4
asteriscos, buscando una comparacin entre la gama de color con los reactivos evaluados.
66
1950) la reaccin de oxidacin producida por el cido es ms intensa segn el
poder oxidativo del cido utilizado, siendo el cido perclrico uno de los cidos con
mayor poder oxidativo (Bric et al,1991, Glickmann & Dessaux 1995). Lo que se
busc en este trabajo fue sustituir el cido perclrico por cido sulfrico,
igualmente un cido con un alto poder oxidativo (Merck, 2001).
67
para cada reactivo, se corri una reaccin con solucin de AIA en dos
concentraciones (10ug/ml y 30ug/ml), y el espectro se determin en rango de luz
visible (400nm 700nm) (Figura 6.5 y 6.6). Los picos de mxima absorcin estn
entre 528nm y 534 nm. La longitud de absorbancia mxima de la reaccin con
Salkowsky-HClO4 fue de 528 nm, lo cual se ajusta a la literatura donde se
recomienda la lectura a 530 nm (Salkowsky, 1889); de la misma forma ocurre con
el reactivo R1m donde la diferencia no excede los 0.5 nm, con lo que se puede
determinar la lectura a 530 nm (Tabla 6.3) (Bric et al, 1991; Glickmann & Dessaux,
1995). En caso de que la longitud de onda de mxima absorcin tenga un cambio
mayor de 10nm, se podra modificar la lectura de la prueba a la longitud del onda
de pico de absorcin para aumentar la sensibilidad de la prueba. En el caso del
reactivo R1m no es necesario hacer esta modificacin.
Tabla 6.3 Valores de mxima absorcin en el espectro absorbancia de 400 700nm de las reacciones con
las diferentes formulaciones del reactivo de Salkowsky.
(nm)
10 30
REACTIVO ug/ml ug/ml
Perclrico 528,50 528,50
R1 529,50 529,50
R2 531,00 530,50
R3 532,00 532,00
R1m 532,50 532,50
R1m1 531,00 531,50
R1m2 532,50 533,50
R2m 533,50 535,00
68
ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN
SALKOWSKY-HClO4 (AIA 30ug/ml) SALKOWSKY-H2SO4 R1 (AIA 30ug/ml)
a.
b.
c. d.
Figura 6.5 Espectro de absorcin de reacciones con diferentes formulaciones de reactivo de Salkowsky (AIA
30ug/m). a. HClO4, b. H2SO4 R1, c. H2SO4 R2 d. H2SO4 R3.
69
ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN
SALKOWSKY-HClO4 (AIA 30ug/ml) SALKOWSKY-H2SO4 R1m(AIA 30ug/ml)
b.
a.
c. d.
e.
Figura 6.6 Espectro de absorcin de reacciones con formulaciones de reactivo de Salkowsky modificadas
(AIA 30ug/m). a. HClO4, b. H2SO4 R1m, c. H2SO4 R1m1, d. H2SO4 R1m2, e. H2SO4 R1m2
70
6.2 DETECCIN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL
POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (TLC)
Los Rf de GA3 obtenidos a partir de las fases mviles S1, S3, S4, S5, S8, S9,
S10, S12, S14, S15, S16 (Tabla 6.4) con un frente de corrida de 4.5 cm,
demuestran la falta de afinidad entre el solvente y la muestra. Aumentando el
frente de corrida de 4.5 cm a 6 cm se observ movilidad de la muestra en los
solventes S3, S4, S5 (Tabla 6.4), mientras que con las mismas fases mviles
se observ la movilidad de AIA e IBA, la cual se ve sesgada por la falta de
movilidad de GA3.
71
Tabla 6.4 Movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de crecimiento (GA3, AIA, IBA) en las fases
mviles evaluadas (los reguladores con prefijo m indican el carril del cromatograma en el que se sirvi
la mezcla de los tres reguladores, mix).
La fase mvil S13 fue el mejor sistema de solvente para la movilidad de GA3
evidenciado por el mayor Rf de GA3 de las 16 fases mviles (Tabla 6.5), con
una fluorescencia clara. Sin embargo las bandas de AIA e IBA no presentan
buena resolucin, presentndose como manchas; mientras que en el carril
del Mix se observa un enmascaramiento AIA por IBA, observndose solo una
mancha amarilla con un borde fucsia caracterstico del AIA (Figura 6.8 a). El
sistema de solvente S5 presenta el segundo Rf de GA3 ms alto de las 16
fases mviles evaluadas, lo que lo hace un excelente solvente para GA3
(Tabla 6.5); sin embargo, aunque AIA e IBA se observan con buena
resolucin, este sistema tambin resuelve otras bandas en el cromatgramas
(Figura 6.8 b).
La fase mvil S2, compuesta por cloroformo: acetato de etilo: cido actico
(50:30:20), present un Rf para GA3 de 0.28, el cual es menor comparado
72
con S5 y S13 (Tabla 6.5), y excelente resolucin entre las bandas de AIA e
IBA, en los dos frentes de corrida evaluados (Figura 6.8 c y d).
Los valores de Rf y la resolucin entre las bandas de AIA e IBA (Figura 6.9)
obtenidos a partir de los cromatgramas sugieren a la fase mvil S2, como el
solvente adecuado para la deteccin de los tres reguladores de crecimiento
vegetal (AIA, IBA y GA3).
Tabla 6.5 Mejores valores de movilidad cromatogrfica (Rf) Rf de las fases mviles para la deteccin
de AIA, IBA y GA3 (los reguladores con prefijo m indican el carril del cromatograma en el que se sirvi
la mezcla de los tres reguladores, mix).
mGA3 mAIA mIBA GA3 AIA IBA mGA3 mAIA mIBA GA3 AIA IBA
S2 0,31 0,75 0,88 0,28 0,83 0,88 0,28 0,83 0,88 0,28 0,83 0,91
S5 0,00 0,85 0,90 0,36 0,86 0,90 0,39 0,89 0,93 0,39 0,89 0,93
S13 0,76 0,00 0,93 0,73 0,90 0,91 0,78 0,86 0,92 0,78 0,90 0,92
73
IBA IBA
GA3 AI
AIA
GA3
IBA
AIA
AIA
GA3
GA3
c. Cromatograma S2
Frente de corrida 4 cm 6cm d. Cromatograma S2
Frente de corrida 4 cm 6cm
FIGURA 6.7 a. Cromatograma fase mvil S13, luz visible y UV, frente de corrida 4cm, b.Cromatograma
fase mvil S5, luz visible y UV, frente de corrida 4cm, c. Cromatograma fase mvil S2, luz visible frente
de corrida 4cm y 6cm, d. Cromatograma fase mvil S2, luz UV, frente de corrida 4cm y 6cm.
74
Las giberelinas fueron detectadas por la fluorescencia que resulta de la
reaccin de oxidacin entre el cido giberlico y el cido sulfrico del
revelador (Reyes et al., 1991), lo cual fue observado bajo luz ultravioleta,
observndose una fluorescencia azul intensa en los cromatogramas (Figura
6.7), tanto en la mezcla de reguladores como en el patrn de GA3.
GA3
AIA
IBA
GA3
AIA
IBA
Figura 6.8 Lmite de deteccin de reguladores de crecimiento vegetal (AIA, IBA y GA3) en TLC. Panel
superior cromatograma luz visible y panel inferior cromatoigrama en UV.
75
6.3 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE
GIBERELINAS
76
GA3: AIA
100ug/ml
Figura 6.10. Reaccin de cido fosfomolbdico con una mezcla de AIA y GA3. (1:1).
77
Figura 6.11 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferente concentraciones de GA3
Figura 6.12 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferentes concentraciones de AIA.
78
6.3.2 DETECCIN FLUOROMTRICA
79
desafortunadamente este equipo no contaba con un juego de filtros de
longitudes de onda cercanas a las requeridas.
80
6.4 DETECCIN DE CIDO INDOL ACTICO EN CULTIVOS
MICROBIANOS POR REACCIN DE SALKOWSKY
0,7
0,6
0,5
0,4 y = 0,023x + 0,019
0,3 R = 0,994
0,2
0,1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Concentracin AIA ug/ ml
Figura 6.13 Curva patrn de concentraciones AIA con reactivo Salkowsky (R1m)
81
6.4.2 PRODUCCIN DE ACIDO INDOL ACTICO (AIA)
70 60
60
50
50
40
40
30
30
20 20
10 10
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (Dias) Tiempo (Dias)
a. b.
Figura 6.14 Curvas de produccin de AIA por Azotobacter vinelandii a. Produccin de AIA en medio BT, b.
Produccin de AIA en medio TSB (Montaje 2).
82
A. vinelandii fue establecido como el control positivo para la produccin de AIA por
la buena produccin de AIA detectada en el segundo montaje y su tendencia de
produccin en aumento lineal. Al comparar su produccin en los medios de cultivo
TSB y BT se observ un comportamiento similar en cuanto a la produccin de AIA
(Figura 6.14). Esta cepa de A. vinelandii tambin fue utilizada como control
positivo de produccin de AIA en medio BT por Duque & Quintana (2008). La cepa
present un comportamiento lineal tendiente al aumento en la produccin de AIA
hasta el da 8 de cultivo (Figura 6.15). En cuanto a concentracin de AIA por da
de cultivo, los valores fueron similares a los obtenidos en el segundo y tercer
montaje. Los resultados de Duque & Quintana (2008) corroboran el
comportamiento de la cepa en procesos de produccin de AIA.
Los resultados de este estudio tambin concuerdan con los resultados reportados
por Zakharova y colaboradores (1999), quienes observarn una tendencia lineal
ascendente para las curvas de produccin de AIA en A. vinelandii y A. brasilense
habitantes de rizsfera.
100,00
Concentracin de AIA ug/ ml
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
-20,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16
-40,00
Tiempo (das)
Figura 6.15 Produccin AIA por A. vinelandii ATCC12518 en medio BT (Duque & Quintana, 2008)
83
que asegura al medio BT como un medio apropiado para la produccin de
biomasa y para la produccin de AIA (Figura 6.15 y 6.17). El medio B no present
dicho comportamiento, ya que no se observ produccin de AIA, este resultado se
puede explicar por que tanto el medio TSB como el medio BT (Anexo 1) estimulan
la produccin de AIA por proporcionar una fuente de triptfano (Trp), el cual es
considerado como el principal precursor en la va de sntesis de AIA. En cultivos
con presencia triptfano se incrementa la produccin de AIA por diferentes vas
metablicas (Bric et al., 1991; Zakharova et al., 1999), mientras que el medio B al
no tener una fuente de triptfano no promueve la produccin de AIA por dichas
vas. Esta observacin sugiere que en esta cepa de A. vinelandii solo actan las
rutas dependiente de triptfano para la biosntesis de AIA. En el medio B tampoco
se evidenci buena produccin de biomasa, probablemente por ser un medio
mineral carente de fuentes de nitrgeno orgnico, aunque este medio se
recomienda para el crecimiento de microoganismos nativos de suelo (Strzelczyk et
al., 1984).
84
cuales regulan la toma de nutrientes en las clulas (Brock et al, 2001), la tripticasa
es una fuente de triptfano, que estimula la produccin de AIA lo que determinara
su comportamiento (Asghar et al., 2002; Karadeniz et al., 2006). As mismo, el
medio BT es un medio apropiado para la produccin de biomasa, aunque es un
medio sencillo de sales bsicas y glucosa (Anexo1). Entre sus componentes se
encuentra NH4NO3 y triptona (digerido pancretico de casena) que adems de ser
fuente de triptfano sirve de fuente de nitrgeno orgnico y Ca, promoviendo un
mejor crecimiento (Brock et al, 2001). La glucosa, fuente de carbono, es
metabolizada rpidamente por A. vinelandii (Moreno & Garcia, 1995).
70 70 7
Concentracin AIA ug/ ml
8 60 6
60
50 6 50 5
40 40 4
30 4
30 3
20
2 20 2
10
0 0 10 1
0 1 2 3 4 5 6 7 0 0
Tiempo (Dias) 0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (Dias)
AIA ug/ ml Crecimiento en unidades de Abs AIA ug/ml Crecimiento en unidades de Abs
a. b.
0,9 7
Crecimiento (Abs) vsProducin AIA ug/ ml
Concentracin AIA ug/ ml
0,8
6
0,7
0,6 5
0,5 4
0,4 3
0,3
2
0,2
0,1 1
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (Dias)
AIA ug/ml Crecimiento en unidades de Abs
c.
Figura 6.16 Curvas crecimiento (Abs540) y produccin de AIA (ug/ml) de Azotobacter vinelandii. a. Cultivo en
medio TSB, b. Cultivo en medio BT, c. Cultivo en medio B.
85
produccin de AIA (Tabla 6.6), ya que no se observ un pico de produccin
constante entre los montajes. Al calcular la diferencia en produccin de AIA entre
los das de cultivo, se logr establecer el da de mayor produccin de AIA para
tomar este como el da de muestreo ptimo para determinar cuanto puede llegar a
producir una cepa da a da en este tipo de cultivos.
Tabla 6.6 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por Azotobacter vinelandii en medios
TSB y BT (los valores indican la diferencia de produccin de AIA da a da)
TSB BT
Dia Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3 Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3
0 0,152 0,000 2,513 0,042 0,000 0,000
1 0,181 3,078 3,212 0,647 0,000 10,659
2 2,745 4,570 8,495 0,944 10,363 8,091
3 0,233 17,070 7,890 1,446 17,527 14,570
4 0,343 15,067 9,503 0,527 24,933 17,715
5 1,887 14,113 3,481 2,463 6,371 -4,449
6 2,218 11,882 -6,089 -0,012 11,210 -3,938
86
6.4.2.2 Azospirillum brasilense
Produccin de AIA por Azospirillum brasilense en medio BT Produccin de AIA por Azopirillum brasilense en medio TSB
9
8
8
7 7
Concantracin AIA ug/ml
6 6
5 5
Concentracin AIA ug/ml
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (Dias) Tiempo (Dias)
a. b.
Figura 6.17 Curvas de produccin de AIA por Azospirillum brasilense a. Produccin de AIA en medio BT, b.
Produccin de AIA en medio TSB (Montaje 2)
87
El crecimiento de A. brasilense en los medios de cultivo mostr la misma
tendencia de A. vinelandii con un crecimiento similar en el medio TSB
donde la produccin de AIA no fue muy alta (7ug/ml), pero el crecimiento y
desarrollo de la cepa determinado por la turbidez del cultivo (Figura 6.18),
gracias a que este medio (TSB) es una buena fuente de nutrientes para
este tipo de microorganismos favoreciendo as su desarrollo y crecimiento
con fuentes de C, N y dems elementos esenciales para su crecimiento
(Brock et al, 2001). Por otro lado, el crecimiento en medio BT no se
comparara con el crecimiento en TSB, ya que los datos de turbidez
obtenidos fueron muy, esto se vi reflejado en la produccin de AIA, la cual
fue de 5 ug/ml. Para el medio B no se observ ni produccin de AIA ni
crecimiento de la cepa, debido a que esta puede que sea una cepa un
poco ms exigente en cuanto a requerimientos para produccin de
biomasa.
50 5 70 7
Concentracin AIA ug/ ml
60 6
40 4 50 5
30 3 40 4
30 3
20 2
20 2
10 1 10 1
0 0
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (Dias) Tiempo (Dias)
AIA ug/ml Crecimiento en unidades de Abs AIA ug/ ml Crecimiento en unidades de Abs
a. b.
Figura 6.18 Curvas crecimiento (Abs540) y produccin de AIA (ug/ml) de Azospirillum brasilense.
a. Cultivo en medio TSB, b. Cultivo en medio BT.
88
Tabla 6.7 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por Azospirillum brasilense en
medios TSB y BT (los valores indican la diferencia de produccin de AIA da a da).
TSB BT
Dia Montaje 1 Montaje 2 Montaje 1 Montaje 2
0 0,000 0,000 0,000 0,000
1 0,211 2,339 0,153 0,000
2 0,600 0,108 0,342 0,000
3 0,441 1,142 0,792 2,298
4 0,429 -0,188 1,355 0,927
5 1,238 0,995 0,239 2,500
6 0,453 2,608 -1,060 0,699
89
Produccin AIA (CepasBioinoculante)+
Control positivo (Azotobacter vinelandii)
79,00
69,00
Concentracin AIA ug/ ml
59,00
49,00
39,00
29,00
19,00
9,00
-1,00
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (Dias)
Azotobacter vinelandii Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4
Cepa 5 Cepa 6 Cepa 7 Cepa 8 Cepa 9
Cepa 10 Cepa 11 Cepa 12 Cepa 13 Cepa 14
Figura 6.19 Produccin de AIA por las 14 cepas del bioinoculante evaluado, y curva de produccin de
AIA por Azotobacter vinelandii control positivo.
La produccin de AIA por parte de las cepas (Tabla 6.8), no sobrepas los
47ug/ml. La produccin de AIA fue buena en el medio de cultivo BT al igual
que la produccin de biomasa, lo que no se observ en medio B, por la
carencia de triptona en el medio, con lo que se puede concluir las rutas de
biosntesis de AIA, tanto en las bacterias y los actinomicetos del
bioinoculante, es dependiente triptfano (Strzeclczyk et al, 1984).
90
Tabla 6.8 Valores de mxima produccin de AIA por las cepas bioinoculante
91
Tabla 6.9 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por las 14 cepas del bioinoculante evaluado y A. vinelandii
Da de Azotobacter
Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4 Cepa 5 Cepa 6 Cepa 7 Cepa 8 Cepa 9 Cepa 10 Cepa 11 Cepa 12 Cepa 13 Cepa 14
cultivo vinelandii
0 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
1 0,000 0,986 15,486 7,542 0,431 1,058 0,768 0,000 1,694 5,181 2,722 2,029 0,542 2,667 0,778
2 10,363 1,306 32,222 33,681 1,861 0,391 0,681 0,000 2,222 34,917 0,792 0,565 1,292 5,917 0,528
3 17,527 16,028 -23,083 -18,028 9,861 1,594 0,580 0,007 7,681 -16,500 4,361 0,116 1,250 16,569 0,389
4 24,933 11,431 7,264 10,278 13,028 0,855 -0,072 0,135 2,986 -14,097 0,750 1,087 -1,181 4,736 0,889
5 6,371 0,792 -27,833 -30,333 -0,194 0,768 0,101 0,036 2,556 -7,556 2,403 0,420 -0,278 -25,417 -0,792
6 11,210 -2,194 -2,472 -1,861 -1,778 -0,159 0,377 0,071 3,153 -0,194 -1,236 1,246 -0,472 -2,153 -0,597
92
6.5. DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN CULTIVOS
MICROBIANOS POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (TLC)
93
0 1 2 3 4 5 6 MIX
0 1 2 3 4 5 6 MIX
a b
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
c d
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
e f
Figura 6.20 Cromatgramas A. vinelandii. R1 a luz visible b fluorescencia, R2 c luz visible
d fluorescencia, R3 e luz visible f fluorescencia
6.5.2 Azospirillum brasilense
94
Los cromatgramas de A. brasilense mostraron la produccin de AIA por
parte de la cepa desde el da 1 hasta el da 6, lo cual se vi reflejado con la
presencia de una banda fucsia con un valor de Rf 0.82, igual al Rf del control
(Tabla 6.11) (Torres et al., 2004). Se observ aumento en la intensidad del
color de la banda (rosado tenue a fucsia intenso), lo que refleja el aumento
de concentracin de AIA en el curso de tiempo de la fermentacin. No se
observ la presencia de IBA (banda amarillo naranja), ni de GA3 (banda de
fluorescencia azul en luz UV de longitud de onda laga). Esta cepa mostr un
comportamiento similar a A. vinelandii. Se observ la similitud entre rplicas y
la presencia de IBA y GA3 en el control (mix de reguladores) con un Rf de
0.89 para IBA y 0.37 para GA3 (Figura 6.21).
AZOSPIRILLUM BRASILENSE
Da de R1 R2 R3
cultivo AIA IBA GA3 AIA IBA GA3 AIA IBA GA3
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
1 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,88 0,00 0,00
2 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00
3 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00
4 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00
5 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00
6 0,82 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00 0,89 0,00 0,00
MIX 0,82 0,89 0,28 0,89 0,95 0,37 0,89 0,92 0,37
95
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
a b
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
c d
0 1 2 3 4 5 6 MIX
0 1 2 3 4 5 6 MIX
e f
Figura 6.21 Cromatgramas A. brasilense. R1 a luz visible b fluorescencia, R2 c luz visible
d fluorescencia, R3 e luz visible fluorescencia
96
6.5.3 CEPAS DEL BIOINOCULANTE
97
Tabla 6.12 Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de crecimiento en cultivos de
cepas del bioinoculante
Da de CEPA 1 CEPA 2 CEPA 3
cultivo AIA IBA GA3 AIA IBA GA3 AIA IBA GA3
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
2 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
4 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
5 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
6 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
MIX 0,92 0,95 0,37 0,82 0,86 0,31 0,92 0,94 0,38
CEPA 4 CEPA 5 CEPA 6
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00
2 0,69 0,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00
3 0,69 0,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00
4 0,69 0,00 0,31 0,00 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00
5 0,69 0,00 0,31 0,77 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00
6 0,69 0,00 0,31 0,77 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00
MIX 0,69 0,74 0,31 0,77 0,83 0,32 0,89 0,94 0,40
CEPA 7 CEPA 8 CEPA 9
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,92 0,00 0,00
5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,92 0,00 0,00
6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,92 0,00 0,00
MIX 0,83 0,35 0,88 0,86 0,89 0,38 0,92 0,95 0,40
CEPA 10 CEPA 11 CEPA 12
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
1 0,00 0,00 0,37 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
2 0,00 0,00 0,37 0,00 0,00 0,43 0,00 0,00 0,00
3 0,00 0,00 0,37 0,00 0,00 0,43 0,00 0,00 0,40
4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,40
5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,40
6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,40
MIX 0,83 0,88 0,37 0,85 0,89 0,43 0,83 0,40 0,40
CEPA 13 CEPA 14
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
MIX 0,85 0,38 0,38 0,82 0,31 0,31
98
A. CEPA 1 CEPA 1
0 1 2 3 4 5 6 MIX
0 1 2 3 4 5 6 MIX
B. CEPA 2 CEPA 2
0 1 2 3 4 5 6 MIX
0 1 2 3 4 5 6 MIX
C. CEPA 3 CEPA 3
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante A. Cepa 1, B. Cepa 2, C,
cepa 3.
99
D. CEPA 4 CEPA 4
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
E. CEPA 5 CEPA 5
0 1 2 3 4 5 6 MIX
0 1 2 3 4 5 6 MIX
F. CEPA 6 CEPA 6
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante D Cepa 4, E Cepa 5,
F Cepa 6
100
G. CEPA 7 CEPA 7
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
CEPA 8
H. CEPA 8
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
I. CEPA 9 CEPA 9
0 1 2 3 4 5 6 MIX
0 1 2 3 4 5 6 MIX
101
J. CEPA 10 CEPA 10
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
K. CEPA 11 CEPA 11
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
L. CEPA 12 CEPA 12
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
102
M. CEPA 13 CEPA 13
0 1 2 3 4 5 6 MIX 0 1 2 3 4 5 6 MIX
N .CEPA 14 CEPA 14
0 1 2 3 4 5 6 MIX
0 1 2 3 4 5 6 MIX
.Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante G. Cepa 7, H. Cepa 8,
I. Cepa 9, J Cepa 10, K Cepa 11, L Cepa 12, M Cepa 13, N Cepa 14
103
sintetizar dicho metabolito por la carencia de la maquinaria enzimtica
necesaria para el desarrollo de esta va de sntesis o inhibicin en la
expresin de estas rutas metablicas. Igualmente es posible que tampoco se
encontraran disponibles en el medio los precursores referenciados para la
ruta de sntesis.
104
mismo. Adicionalmente la banda correspondiente a GA3 no se detect,
incluso en las concentraciones ms altas de las mezclas de patrones
sometidas a extraccin. En el control de corrida, la banda de GA3 siempre se
detect, lo que indica que no hubo problemas con el revelador.
105
especficos para germinacin. Esto son ndices que segn la teora se
pueden manejar para el resto de estados pues lo que marcan es el cambio
de un estado a otro, mas no caractersticas como tal de ese cambio, es decir
en este caso marca por nmero la cantidad de plntulas que pasan del
estado uno al dos, del dos al tres y as; igualmente tambin se tiene en
cuenta el tiempo de cambio de estado. Se decidi determinar los ndices
para todos los estados porque las semillas con las que se trabaj son
semillas certificadas, lo que indica que su germinacin es casi del 100%.
Este porcentaje de germinacin dificulta el poder encontrar diferencias
significativas entre los tratamientos, ya que el total de las semillas germinara
y no se evidenciara fcilmente el efecto de los tratamientos.
0 1 1a 1b 2
3 3a 3b 3c 3d
106
6.6.1 ANLISIS ESTADSTICO
Una vez determinados los ndices para cada estado y para cada tratamiento,
se tomaron los datos obtenidos de los tres montajes y se analizaron
buscando determinar el mejor tratamiento para todos los ndices y as
establecer cual regulador de crecimiento tenia el efecto ms marcado en
cada estado en general o en determinados ndices. En los montajes 1 y 2,
ninguna de las plntulas, en los seis tratamientos, present desarrollo hasta
el estado 4, en los 14 das de lectura. En el montaje 3, en algunos
tratamientos, se observaron plntulas con desarrollo hasta estado 4, pero
estos datos no se analizaron porque no se contaba con valores asociar su
comportamiento a un regulador de crecimiento especfico.
107
significativo o igual a 0, es decir que no se encuentra variabilidad entre las
rplicas para cada tratamiento en ninguno de los tres montajes realizados.
Tabla 6.13 Anlisis multivariado MANOVA para la variable rplica en la interaccin tratamiento*rplica
en pruebas de bioensayos.
Pr > F
Estadstico Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3
Wilks' Lambda 0.9988 0.4183 0.7462
Pillai's Trace 0.9982 0.8604 0.7016
Hotelling-Lawley Trace 0.9999 0.7539
Roy's Greatest Root 0.1657 0.128 0.2275
108
germinacin, por esto no es posible encontrar diferencias significativas entre
tratamientos para estos ndices.
109
total de 100 semillas, pues el nmero total de semillas por tratamiento de la
primera prueba no es representativo para estos ensayos(ISTA, 2006). En
este segundo montaje, en el estado 1, Hormonagro y GA3 presentaron los
mayores valores para los ndices R50, R50 y VG, AIA tambin present
valores en el rango de Hormanogro y GA3 para los ndices de velocidad de
germinacin (R50 y R50) (Tabla 6.15 b). El estado 2, se ve mayormente
influenciado por GA3 y Hormonagro para todos los ndices (Tabla 6.16 b). El
estado 3 present efecto de GA3 para para los ndices de velocidad de
germinacin (R50 y R50), y los ndices de cantidad de semillas a germinar
por da (PV) y valor de la germinacin (VG) estn influenciados por el control
(Tabla 6.17 b).
110
igualmente promueven la iniciacin de la raz generando el desarrollo y
elongacin de la radcula, y a nivel celular promueven la divisin y
diferenciacin celular por lo que influyen en el desarrollo de tejidos y
fototropismo de las plantas (Arteca 1996, Taiz & Zeiger, 2006). As entonces,
se podra decir que el efecto de las auxinas (Hormonagro) se ve reflejado en
los resultados observados en el estado 2 tanto del montaje 1 como del
montaje 2, donde este tratamiento se ve como uno de los mejores agrupado
con el tratamiento GA3, quien tambin se reporta como un promotor de la
divisin celular. En estado 2 las plntulas estn pasando de emergencia de
la radcula a emergencia de hipocotilo por lo que se presenta una gran
actividad de diferenciacin celular y divisin celular, procesos en los que se
podra ver un efecto directo tanto de las auxinas como de GA3 (Taiz & Zeiger,
2006). Para el estado 3, es difcil determinar cual tratamiento present la
mayor influencia, pues en el montaje 1 predomin el efecto de Hormonagro, y
en el montaje 2 GA3 tuvo mayor influencia en los ndices de velocidad.
111
Segn los datos del montaje de las cepas y comparando con los datos
obtenidos a partir del anlisis de los montajes 1 y 2, se podra decir que para
el estado 1, las cepas 6, 10 y 13 (Tabla6.18) fueron los mejores
tratamientos, ya que presentaron los valores ms altos para los datos
significativos de los ndices; se podra atribuir a estas cepas un efecto de
GA3. En el estado 2, los mejores tratamientos fueron la cepa 12 y 13,
posiblemente por la produccin de auxinas y/o GA3. Finalmente para el
estado 3, los mejores tratamientos agrupados en la mayora de los ndices
fueron las cepas 10, 7 y A. vinelandii, posiblemente por la produccin de
auxinas y/o GA3.
112
GC GRI R50 R50 PV MDG VG
Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan
Agua 100 A Agua 2,333 A Gibgro 36.000 B Gibgro 36.000 B Hormo 0,5509 A IBA 0,7027 A Hormo 0,2301 A
Gibgro 100 A Gibgro 2,333 A Hormo 36.000 B Hormo 36.000 B Gibgro 0,4556 B Hormo 0,41 B IBA 0,2244 B A
Hormo 100 A Hormo 2,333 A GA3 52.000 B A GA3 52.000 B A Agua 0,3954 B C GA3 0,3889 B Gibgro 0,1694 B A C
AIA 100 A AIA 2,333 A IBA 60.000 A IBA 60.000 A GA3 0,3949 B C Gibgro 0,3704 B GA3 0,1536 B C
IBA 100 A IBA 2,333 A AIA 60.000 A AIA 60.000 A IBA 0,3393 C Agua 0,3333 B Agua 0,1318 D C
GA3 100 A GA3 2,333 A Agua 60.000 A Agua 60.000 A AIA 0,3324 C AIA 0,2263 B AIA 0,0753 D
a.
Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan
Agua 100 A Agua 1,667 A GA3 43.200 B GA3 43.200 B Hormo 0,2794 A Agua 0,275 A Hormo 0,0769 A
Gibgro 100 A Gibgro 1,667 A AIA 45.600 B AIA 45.600 B GA3 0,2508 A Gibgro 0,22371 A GA3 0,0697 A
AIA 100 A AIA 1,667 A Hormo 60.000 AB Hormo 60.000 AB Agua 0,2256 A Hormo 0,22222 A IBA 0,0511 AB
GA3 100 A GA3 1,633 A IBA 67.200 A IBA 67.200 A IBA 0,2249 A AIA 0,21098 A AIA 0,0507 AB
Hormo 99 AB Hormo 1,650 AB Agua 72.000 A Agua 72.000 A AIA 0,2064 A IBA 0,19444 A Agua 0,0482 AB
IBA 98 B IBA 1,667 B Gibgro 79.200 A Gibgro 79.200 A Gibgro 0,1972 A GA3 0,18148 A Gibgro 0,0358 B
b.
GC GRI R50 R50 PV MDG VG
Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan
Cepa 13 100.000 A Cepa 13 1,667 A Cepa 6 48.000 C Cepa 6 48.000 C Cepa 6 0,3031 A Cepa 13 0,26897 A Cepa 13 0,0802 A
A, vinelandii 100.000 A A, vinelandii 1,667 A Cepa 5 48.000 C Cepa 5 48.000 C Cepa 10 0,3021 A Cepa 10 0,23785 B A Cepa 10 0,0727 B A
Cepa 9 100.000 A Cepa 9 1,667 A Cepa 12 48.000 C Cepa 12 48.000 C Cepa 13 0,296 B A A, vinelandii 0,23479 B A Cepa 12 0,0681 B A C
Cepa 2 100.000 A Cepa 2 1,667 A Cepa 7 48.000 C Cepa 7 48.000 C Cepa 12 0,2958 B A Cepa 8 0,23016 B A C Cepa 8 0,0675 B A C
Cepa 6 100.000 A Cepa 6 1,667 A Cepa 10 48.000 C Cepa 10 48.000 C Cepa 8 0,2917 B A C Cepa 12 0,22569 B A C Cepa 6 0,0621 B D A C
A, brasilense 98.750 A A, brasilense 1,646 A Cepa 8 48.000 C Cepa 8 48.000 C Cepa 5 0,2833 B A C Cepa 3 0,22437 B A C Cepa 7 0,0618 B D A C
Cepa 3 98.750 A Cepa 3 1,646 A Cepa 9 51.000 C B Cepa 9 51.000 C B Cepa 7 0,2802 B D A C Cepa 9 0,22321 B A C Cepa 14 0,0611 B D A C
BT 98.750 A BT 1,646 A Cepa 11 51.000 C B Cepa 11 51.000 C B Cepa 14 0,275 B D A C Cepa 14 0,22109 B A C Cepa 5 0,0597 B D A C
Cepa 5 98.750 A Cepa 5 1,646 A Cepa 13 51.000 C B Cepa 13 51.000 C B Cepa 1 0,2604 E B D A C Cepa 1 0,21759 B A C Cepa 1 0,0596 B D A C
Cepa 8 98.750 A Cepa 14 1,646 A Cepa 1 51.000 C B Cepa 1 51.000 C B Cepa 11 0,2576 E B D A C Cepa 7 0,21693 B A C A, vinelandii 0,0594 B D A C
Agua 98.750 A Agua 1,646 A Cepa 14 54.000 C B Cepa 14 54.000 C B Cepa 9 0,2549 E B D A C Cepa 5 0,21181 B A C Cepa 9 0,0572 B D A C
Cepa 14 98.750 A Cepa 8 1,646 A Cepa 4 57.000 C B Cepa 4 57.000 C B A, vinelandii 0,2498 E B D A C A, brasilense 0,20738 B C Cepa 3 0,056 B D A C
Cepa 7 97.500 A Cepa 1 1,625 A Cepa 2 57.000 C B Cepa 2 57.000 C B Cepa 4 0,2484 E B D A C Cepa 6 0,2042 B C A, brasilense 0,0474 B D C
Cepa 4 97.500 A Cepa 4 1,625 A Cepa 3 57.000 C B Cepa 3 57.000 C B Cepa 3 0,2465 E B D A C Agua 0,18866 B C Cepa 11 0,0452 D C
Cepa 1 97.500 A Cepa 10 1,625 A A, vinelandii 57.000 C B A, vinelandii 57.000 C B Agua 0,2396 E B D C Cepa 2 0,18519 B C Agua 0,045 D C
Cepa 12 97.500 A Cepa 7 1,625 A Agua 57.000 C B Agua 57.000 C B Cepa 2 0,2369 E D C BT 0,18287 B C Cepa 4 0,0448 D C
Cepa 10 97.500 A Cepa 12 1,625 A BT 60.000 B BT 60.000 B A, brasilense 0,2263 E D Cepa 4 0,18056 B C Cepa 2 0,0439 D C
Cepa 11 95.000 A Cepa 11 1,583 A A, brasilense 72.000 A A, brasilense 72.000 A BT 0,2173 E Cepa 11 0,17593 C BT 0,0397 D
c.
Tabla 6.15 Tablas de comparacin Duncan para estadio 1; a. Montaje 1, b. Montaje 2 c. Montaje 3
113
GC GRI R50 R50 PV MDG VG
Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan
Agua 100 A Agua 2,333 A Hormo 48.000 C Hormo 48.000 C Hormo 0,3912 A Agua 0,31349 A Hormo 0,12207 A
Gibgro 100 A Gibgro 2,333 A Gibgro 56.000 B C Gibgro 56.000 B C Agua 0,31349 B Hormo 0,30463 B A Agua 0,09906 B A
Hormo 100 A Hormo 2,333 A Agua 60.000 B C Agua 60.000 B C Gibgro 0,2996 C B GA3 0,27546 B A GA3 0,08034 B A
AIA 100 A AIA 2,333 A GA3 66.000 B A GA3 66.000 B A GA3 0,29167 C B Gibgro 0,23333 B A Gibgro 0,06991 B A
IBA 100 A IBA 2,333 A AIA 72.000 B A AIA 72.000 B A AIA 0,26466 C B IBA 0,22194 B A AIA 0,05669 B
GA3 100 A GA3 2,333 A IBA 80.000 A IBA 80.000 A IBA 0,23225 C AIA 0,2133 B IBA 0,05227 B
a.
GC GRI R50 R50 PV MDG VG
Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan
Agua 100 A Hormo 1,667 A GA3 76.800 C GA3 76.800 C GA3 0,19775 A GA3 0,18401 A GA3 0,036661 A
Gibgro 100 A Gibgro 1,667 A Hormo 81.600 C Hormo 81.600 C Hormo 0,18985 A Hormo 0,18032 A Hormo 0,034358 A
IBA 100 A Agua 1,667 A AIA 100.800 B AIA 100.800 B Agua 0,15926 B AIA 0,15291 B Agua 0,024444 B
GA3 100 A AIA 1,667 A IBA 100.800 B IBA 100.800 B AIA 0,155 B Agua 0,15253 B AIA 0,023928 B
Hormo 99 AB GA3 1,667 A Agua 105.600 B Agua 105.600 B IBA 0,15035 B IBA 0,14947 B IBA 0,022617 B
AIA 98 B IBA 1,633 A Gibgro 124.800 A Gibgro 124.800 A Gibgro 0,13749 B Gibgro 0,13287 B Gibgro 0,018366 B
b.
GC GRI R50 R50 PV MDG VG
Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan
Cepa 13 100.000 A Cepa 13 1,667 A Cepa 12 69.000 H Cepa 12 69.000 G Cepa 13 0.21838 A A. vinelandii 0.19213 A Cepa 13 0.041030 A
A, vinelandii 100.000 A A. vinelandii 1,667 A Cepa 13 69.000 H Cepa 13 69.000 G Cepa 10 0.20432 B A Cepa 10 0.19077 A Cepa 10 0.039711 A
Cepa 9 100.000 A Cepa 9 1,667 A Cepa 9 69.000 H Cepa 9 69.000 G Cepa 12 0.20255 B A C Cepa 12 0.18988 A Cepa 12 0.039200 B A
Cepa 2 100.000 A Cepa 2 1,667 A Cepa 10 72.000 H G Cepa 10 72.000 F G A. vinelandii 0.19659 B D A C Cepa 13 0.18619 A A. vinelandii 0.038149 B A
Cepa 6 100.000 A Cepa 6 1,667 A Cepa 7 72.000 H G Cepa 7 72.000 F G Cepa 6 0.18816 B D A C Cepa 5 0.18244 A Cepa 5 0.034658 B A
A, brasilense 98.750 A A. brasilense 1,646 A Cepa 6 75.000 F H G Cepa 6 75.000 F G Cepa 9 0.18571 B D C Cepa 9 0.17593 B A Cepa 9 0.032771 B A C
Cepa 3 98.750 A Cepa 3 1,646 A Cepa 1 78.000 F H E G Cepa 1 78.000 F G E Cepa 5 0.18452 B D C Cepa 14 0.17380 B A C Cepa 6 0.032218 B D A C
BT 98.750 A BT 1,646 A A. vinelandii 81.000 F H E D G A. vinelandii 81.000 F G E D Cepa 7 0.18403 B D C Cepa 1 0.17176 B A C Cepa 1 0.031063 B D A C
Cepa 5 98.750 A Cepa 5 1,646 A Cepa 8 84.000 F H E D G Cepa 8 84.000 F G E D Cepa 11 0.17974 B D E C Cepa 6 0.17130 B A C Cepa 7 0.030883 B D A C
Cepa 8 98.750 A Cepa 14 1,646 A Cepa 11 84.000 F H E D G Cepa 11 84.000 F G E D Cepa 1 0.17903 B D E C Cepa 8 0.16921 B D A C Cepa 14 0.030843 B D A C
Agua 98.750 A Agua 1,646 A Cepa 5 87.000 F H E D C G Cepa 5 87.000 F G E D C Cepa 8 0.17731 F B D E C Cepa 11 0.16736 B D A C Cepa 11 0.030312 B D A C
Cepa 14 98.750 A Cepa 8 1,646 A Cepa 14 90.000 F B E D C G Cepa 4 90.000 F B E D C Cepa 14 0.17674 F B D E C Cepa 7 0.16713 B D A C Cepa 8 0.030187 B D A C
Cepa 7 97.500 A Cepa 1 1,625 A Cepa 4 93.000 F B E D C Cepa 14 90.000 F B E D C Cepa 3 0.16979 F D E C Cepa 2 0.16667 B D A C Cepa 3 0.027969 B D C
Cepa 4 97.500 A Cepa 4 1,625 A Cepa 3 96.000 B E D C Cepa 3 96.000 B E D C Cepa 4 0.16944 F D E C Cepa 3 0.16458 B D A C Cepa 2 0.027778 B D C
Cepa 1 97.500 A Cepa 10 1,625 A Cepa 2 99.000 B D C Cepa 2 99.000 B D C Cepa 2 0.16667 F D E Cepa 4 0.16250 B D A C Cepa 4 0.027616 B D C
Cepa 12 97.500 A Cepa 7 1,625 A BT 105.000 B A C BT 105.000 B A C BT 0.14962 F E BT 0.14962 B D C BT 0.022397 D C
Cepa 10 97.500 A Cepa 12 1,625 A Agua 108.000 B A Agua 108.000 B A Agua 0.14815 F E A. brasilense 0.14347 D C A. brasilense 0.020912 D
Cepa 11 95.000 A Cepa 11 1,583 A A. brasilense 123.000 A A. brasilense 123.000 A A. brasilense 0.14517 F Agua 0.14015 D Agua 0.020763 D
c.
Tabla 6.16 Tablas de comparacin Duncan para estadio2; a. Montaje 1, b. Montaje 2 c. Montaje 3
114
GC GRI R50 R50 PV MDG VG
Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan
Agua 100 A Agua 2,333 A Hormo 80.000 B Hormo 80.000 B Hormo 0,2691 A Hormo 0,22783 A Hormo 0,061949 A
Gibgro 100 A Gibgro 2,333 A Gibgro 88.000 B A Gibgro 88.000 B A Gibgro 0,229 B A Gibgro 0,20034 B Gibgro 0,045786 B
Hormo 100 A Hormo 2,333 A GA3 96.000 B A GA3 96.000 B A Agua 0,2061 B Agua 0,18946 C B Agua 0,039128 C B
AIA 100 A AIA 2,333 A AIA 104.000 A AIA 104.000 A AIA 0,1977 B AIA 0,17949 C B AIA 0,035482 C B
IBA 100 A IBA 2,333 A IBA 108.000 A IBA 108.000 A GA3 0,1919 B GA3 0,16667 C GA3 0,031987 C B
GA3 100 A GA3 2,333 A Agua 108.000 A Agua 108.000 A IBA 0,1694 B IBA 0,16204 C IBA 0,028221 C
a.
GC GRI R50 R50 PV MDG VG
Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan
Agua 100 A Agua 1,667 A GA3 116.400 C GA3 116.400 C Agua 0.86667 A Hormo 0.137762 A Agua 0.100794 A
Gibgro 100 A Gibgro 1,667 A Hormo 122.400 CB Hormo 122.400 CB GA3 0.14583 B GA3 0.135309 A GA3 0.019810 B
AIA 100 A AIA 1,667 A Gibgro 124.800 CB Gibgro 124.800 CB Hormo 0.13939 B Gibgro 0.132867 A Hormo 0.019214 B
GA3 100 A Hormo 1,65 A AIA 127.200 CB AIA 127.200 CB Gibgro 0.13749 B AIA 0.131036 A Gibgro 0.018366 B
Hormo 99 AB GA3 1,65 A IBA 132.000 AB IBA 132.000 AB AIA 0.13297 B IBA 0.12596 AB AIA 0.017525 B
IBA 98 B IBA 1,63 A Agua 139.200 A Agua 139.200 A IBA 0.12595 B Agua 0.115873 B IBA 0.015913 B
b.
GC GRI R50 R50 PV MDG VG
Trat Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media DuncanTrat Media DuncanTrat Media Duncan Trat Media DuncanTrat Media Duncan
Cepa 13 100.000 A Cepa 13 1,667 A Cepa 10 99 E Cepa 10 99 E A. vinelandii 0,151 A A. vinelandii 0,14205 A A. vinelandii 0,021443 A
A. vinelandii 100.000 A A. vinelandii 1,667 A Cepa 7 102 E Cepa 7 102 E Cepa 10 0,1427 B A Cepa 10 0,12922 B A Cepa 10 0,018506 B A
Cepa 9 100.000 A Cepa 9 1,667 A Cepa 8 102 E Cepa 8 102 E Cepa 8 0,1373 B A C A. brasilense 0,12443 B A C Cepa 8 0,015851 B C
Cepa 2 100.000 A Cepa 2 1,667 A A. vinelandii 105 D E Cepa 11 105 E Cepa 13 0,1333 B A C Cepa 9 0,11971 B D A C A. brasilense 0,015627 B C
Cepa 6 100.000 A Cepa 6 1,667 A Cepa 13 108 D E A. vinelandii 105 E Cepa 6 0,1319 B A C Cepa 11 0,11829 B D A C Cepa 9 0,015533 B C D
A. brasilense 98.750 A A. brasilense 1,646 A Cepa 9 108 D E Cepa 13 108 D E Cepa 7 0,1292 B A C Cepa 14 0,11705 B D C Cepa 11 0,015126 B C D
Cepa 3 98.750 A Cepa 3 1,646 A Cepa 6 108 D E Cepa 6 108 D E Cepa 11 0,126 B D A C Cepa 8 0,11502 B D C Cepa 7 0,015005 B C D
BT 98.750 A BT 1,646 A Cepa 11 108 D E Cepa 9 108 D E Cepa 12 0,1243 E B D A C Agua 0,11448 B D C Cepa 13 0,014499 B C D
Cepa 5 98.750 A Cepa 8 1,646 A Cepa 12 111 D E Cepa 12 111 D E Cepa 9 0,1242 E B D A C Cepa 5 0,11386 B D C Cepa 6 0,014429 B C D
Cepa 8 98.750 A Cepa 5 1,646 A Cepa 14 114 D E Cepa 4 114 D E A. brasilense 0,121 E B D C Cepa 7 0,11375 B D C Cepa 12 0,01431 B C D
Agua 98.750 A Cepa 1 1,625 A Cepa 5 120 D E C Cepa 14 114 D E Cepa 5 0,1193 E B D C Cepa 12 0,11353 B D C Cepa 14 0,013928 B C D
Cepa 12 97.500 A Cepa 10 1,625 A Cepa 1 120 D E C Cepa 1 117 D E C Cepa 14 0,1184 E B D C Cepa 6 0,10938 B D C Cepa 5 0,013927 B C D
Cepa 1 97.500 A Cepa 12 1,625 A Cepa 4 123 B D E C Cepa 5 120 B D E C Cepa 1 0,1183 E B D C Cepa 13 0,10882 B D C Agua 0,013295 B C D
Cepa 10 97.500 A Cepa 7 1,604 A BT 132 B D A C BT 132 B D A C Agua 0,1153 E B D C Cepa 4 0,10627 B D C Cepa 1 0,0122 C D
Cepa 7 96.250 A Cepa 4 1,604 A Cepa 2 141 B A C Cepa 2 141 B A C Cepa 4 0,1115 E D C Cepa 2 0,1059 B D C Cepa 4 0,012096 C D
Cepa 4 96.250 A Cepa 14 1,604 A A. brasilense 144 B A C A. brasilense 144 B A Cepa 2 0,1087 E D C Cepa 1 0,10313 D C Cepa 2 0,011517 C D
Cepa 14 96.250 A Cepa 11 1,583 A Cepa 3 147 B A Cepa 3 147 A Cepa 3 0,1004 E D BT 0,09681 D Cepa 3 0,009873 C D
Cepa 11 95.000 A Agua 1,229 B Agua 153 A Agua 153 A BT 0,097 E Cepa 3 0,09624 D BT 0,0094 D
c.
115
Tabla 6.17 Tablas de comparacin Duncan para estadio3; a. Montaje 1, b. Montaje 2 c. Montaje 3
Tabla 6.18 Resultados de los mejores tratamientos para los montajes 1 y 2 de evaluacin de
reguladores, y montaje 3 de evaluacin de microorganismos.
116
que aunque en algunos casos mostraron sensibilidad mayor presentaban
gama de color diferente a la de la reaccin por oxidacin del grupo indol por
Salkowsky-HClO4. (Bric et al., 1991; Gordon & Weber, 1950)
117
tcnicas sencillas y al mismo tiempo econmicas, se decidi trabajar con
triptona, un suplemento econmico y ampliamente utilizado en laboratorios
de microbiologa convencionales. La triptona no solo es fuente de triptfano
sino tambin es fuente de carbono y nitrgeno orgnico fcilmente asimilable
por todos los microorganismos. Se determin, al observar el comportamiento
en crecimiento de las cepas y la produccin de AIA, que el medio B
suplementado con triptona (BT) es un medio ptimo tanto para el desarrollo
microbiano como para la promocin de produccin de AIA. Se descart el
medio B sin suplemento, ya que en este no se observ un buen desarrollo
microbiano y adems no se detecto la presencia de AIA, pero permiti
comprobar que los microorganismos evaluados poseen rutas metablicas
dependientes de triptfano para la biosntesis de AIA.
118
muestras obtenidas a partir de los cultivos microbianos, observndose una
produccin de AIA y GA3 por las cepas 4 y 5 mientras que la produccin de
AIA fue determinada en las cepas 2 y 9, y la produccin de GA3 fue
observada en las cepas 10, 11 y 12. Las cepas de referencia mostraron
produccin de AIA pero no de GA3. La cepa de A. vinelandii no est
caracterizada como productora de GA3, pero la de A. brasilense si lo est
(Daz L.A., 2006, comunicacin personal).
119
y 9, siendo las cepas 2, 4 y 9 unas de las cepas con mayores
concentraciones de AIA en cultivo (determinado por Salkowsky-R1m). Lo
contradictorio de esta observacin es que la cepa 5 presenta bajas
concentraciones de AIA en cultivo. En el caso de las cepas que presentan
resultados positivos con Salkowsky y no muestran deteccin en TLC, no se
puede hablar de inespecificidad del reactivo de Salkowsky, pues este detecta
anillos indol en general (Salkowsky, 1889). En el caso que de Salkowsky
estuviera detectando otros compuestos indlicos, se observaran bandas de
color rosado-fucsia con Rf diferentes a del AIA, y este no fue el caso para
dichas cepas; incluso no se observaron bandas con la coloracin y Rf propios
de IBA. La razn de por qu se detecta AIA por Salkoswsky y no TLC est
ms encaminada a un problema en el momento de la extraccin lquido-
lquido con acetato de etilo, como ya se mencion en el numeral 6.5.
120
accin de GA3 como nico regulador producto del metabolismo de la cepa 1,
teniendo en cuenta que el valor mximo de produccin de AIA segn prueba
de Salkowsky fue de 4ug/mL.
121
7. CONCLUSIONES
122
Se evalu la produccin de AIA y GA3 por parte de las cepas de
bioinoculante acelerador de compostaje, donde las cepas 4 y 5 fueron
las nicas productoras de los dos metabolitos, las cepas 2 y 9 se
definieron como productoras de AIA, y las cepas 10, 11 y 12 como
productoras de GA3, de acuerdo a la prueba de TLC.
La prueba de Salkowsky determin a las cepas 2, 3 y 9 como las de
produccin ms alta de AIA.
El bioensayo en semillas de lechuga asoci a las cepas 6, 10, 12 y 13
como productoras de auxinas y AIA.
123
8. RECOMENDACIONES
124
Hacer varias repeticiones, en tiempos diferentes, de los montajes de
los bioensayos, incluyendo otras formulaciones comerciales de
reguladores de crecimiento y ANA grado reactivo, para as confirmar la
asociacin de los tratamientos a los ndices calculados para los
diferentes estados de desarrollo.
Montar los bioensayos con semillas de especie con germinacion y
desarrollo ms lento, pero que sean fcilmente asequibles a un
laboratorio de microbiologa, para poder encontrar ms fcilmente
diferencias significativas entre los ndices y los estados de desarrollo.
En este trabajo tambin se hicieron ensayos con semillas de frjol,
montando curvas para determinar tiempo ptimo de imbibicin, pero la
rpida contaminacin de las semillas por hongos y bacterias no
permiti hacer la evaluacin de todos los estados de desarrollo. Es
posible minimizar la contaminacin con el uso productos como
Mancozeb.
Continuar caracterizando las cepas del bioinoculante como PGPB,
evaluando por ejemplo fijacin de nitrgeno, solubilizacin de fosfatos,
produccin de siderforos y capacidad antagnica, entre otras. El
inters en esta caracterizacin es muy particular, pues las 14 cepas de
este inoculante estn definidas como cepas termfilas, pero en este
estidio probaron crecer bien en condiciones de mesofilia,
adicionalmente producen reguladores de crecimiento vegetal, y en el
bioensayo se confirm que pueden promover el desarrollo de plntulas
de lechuga. Todo esto implica que su actividad no solo aplica a nivel
de aceleracin del proceso de compostaje, si no tambin a nivel de
promocin de crecimiento vegetal. No se encuentran reportes de
bioinoculantes que tengan estas dos actividades.
125
9. REFERENCIAS
126
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133
ANEXO 1
COMPOSICION g/L
Glucosa 2,5
Peptona de casena 17
Peptona de soya 3
NaCl 5
K2HPO4 2,5
MEDIO B
COMPOSICION g/L
Glucosa 5
K2HPO4 1
NH4NO3 0,4
NaCl 0,2
MgSO47H2O 0,4
MEDIO BT (B MODIFICADO)
COMPOSICION g/L
Glucosa 5
K2HPO4 1
NH4NO3 0,4
NaCl 0,2
MgSO47H2O 0,4
Triptona 20
134
ANEXO 2
Azotobacter vinelandii
1. Montaje 1
PRODUCCION DE AIA ug/ ml A. vinelandii en medio BT PRODUCCION DE AIA ug/ ml A. vinelandii EN MEDIO
TSB
CO N CEN TRACIO N AIA (u g/ m l)
8
7
6 10
(u g/ m l)
3
2
0
1
0 0 1 2 3 4 5 6 7
0 1 2 3 4 5 6 7 -5
TIEMPO (Das) TIEMPO (Das)
2. Montaje 3
PRODUCCION DE AIA A. Vinelandii EN MEDIO BT
Produccin AIA Azotobacter vinelandii en medio TSB
(Montaje 3) (Montaje 3)
40
Conce nt racin AIA (ug/ m l)
35
60
CONCENTRACION AIA (ug/ ml)
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10 5
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
Tiempo (Dias)
135
Azospirillum brasilense
3. Montaje 1
PRODUCCION DE AIA ug/ ml A. brasilense PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) A. brasilense EN MEDIO
TSB
4
5
CO N CEN TRACIO N AIA
3,5
(ug/ m l)
2 3
1,5 2
1
0,5 1
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6 8 10
TIEMPO (Das) TIEMPO (Das)
Cepas bioinoculante
4. CEPA 1
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 1
45,00
CONCENTRACION DEAIA
40,00
35,00
30,00
(ug/ ml)
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
5. CEPA 2
PRODUCCION DE AIA ug/ ml CEPA 2
60,00
CONCENTRACION DE AIA
50,00
40,00
(ug/ ml)
30,00
20,00
10,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
136
6. CEPA 3
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 3
45,00
CONCENTRACION DEAIA
40,00
35,00
30,00
(ug/ ml)
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
7. CEPA 4
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 4
30,00
CONCENTRACIO DEAIA ug/ ml
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
8. CEPA 5
PRODUCCION AIA (ug/ ml) CEPA 5
6
CONCENTRACION DE AIA
5
4
(ug/ ml)
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
137
9. CEPA 6
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 6
3,5
CONCENTRACION DE AIA
3
2,5
(ug/ ml)
2
1,5
1
0,5
0
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
10. CEPA 7
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 7
0,35
0,3
CONCENTRACION DEAIA
0,25
0,2
(ug/ ml)
0,15
0,1
0,05
0
-0,05 0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
11. CEPA 8
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 8
25,00
CONCENTRACION DEAIA
20,00
15,00
(ug/ ml)
10,00
5,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
138
12. CEPA 9
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 9
45,00
CONCENTRACION DEAIA
40,00
35,00
30,00
(ug/ ml)
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
13. CEPA 10
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 10
12,00
CONCENTRACION DEAIA
10,00
8,00
(ug/ ml)
6,00
4,00
2,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
14. CEPA 11
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 11
7
CONCENTRACION DE AIA
6
5
(ug/ ml)
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
139
15. CEPA 12
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 12
4,50
CONCENTRACION DE AIA
4,00
3,50
3,00
(ug/ ml)
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
16. CEPA 13
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 13
35,00
CONCENTRACION DE AIA
30,00
25,00
(ug/ ml)
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
17. CEPA 14
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 14
3,00
CONCENTRACION EN AIA
2,50
2,00
(ug/ ml)
1,50
1,00
0,50
0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO (Das)
140