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ISSN: 0120-2804
orodriguez@unal.edu.co
Universidad Nacional de Colombia
Colombia
Orgnica y Bioqumica
PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE a-AMILASA
DE PENICILLIUM COMMUNE PRODUCIDA MEDIANTE
FERMENTACIN EN FASE SLIDA
1 Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot. Bogot, Colombia.
2 Direccin actual Colegio Marruecos y Molinos IED, SED. Bogot, Colombia. neespinelb@unal.edu.co
3 melopezr@unal.edu.co
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diminuram 25% e 40% respectivamente. natural de hongos filamentosos como Pe-
Os valores de Km e Vmx foram calculados nicillium commune, lo que genera
usando a linearizao de Linewea- mayores rendimientos en la produccin
ver-Burk, obtendo Km = 0.48 mg/mL e de enzimas y la mnima degradacin por
Vmx = 5.85 mmol glucosa/min. Entre os accin de proteasas (5).
principais produtos de hidrlises do ami-
do de mandioca encontram-se a maltosa e Cada una de las aplicaciones industria-
glucosa; este resultado proporciona evi- les de las a-amilasas requiere propieda-
dencia de que a enzima capaz de romper des nicas respecto a especificidad, esta-
os enlaces glucosdicos a-1,4 do amido, bilidad, temperatura y dependencia del
comportamento caracterstico de uma pH (6), y la bsqueda de enzimas que pre-
a-amilasa. senten propiedades diferentes a las cono-
cidas se mantiene como un tema de inte-
a-amilasa, Penici- rs en investigacin.
llium commune, fermentao em fase s-
lida, mandioca branca colombiana. Recientemente se ha reportado la pro-
duccin de a-amilasa por hongos del g-
nero Penicillium (7, 8), sin embargo, en
estos trabajos no se lleva a cabo la purifi-
Las a-amilasas son enzimas que catalizan cacin y posterior caracterizacin de la
al azar la hidrlisis de enlaces glicosdi- enzima, etapas fundamentales para esta-
cos a-1,4 de polisacridos como el almi- blecer su potencial en aplicaciones bio-
dn y el glicgeno, para producir malto- tecnolgicas.
sa, oligosacridos de diferentes tamaos En esta publicacin se describe la pro-
y cadenas ms o menos ramificadas lla- duccin, purificacin y caracterizacin ci-
madas dextrinas lmite (1). Son de gran ntica de una a-amilasa obtenida a partir
importancia en la industria alimenticia, de una cepa nativa de Penicillium commu-
textil, papelera y farmacolgica, y aun- ne mediante fermentacin en fase slida,
que las fuentes productoras de a-amilasas empleando yuca blanca colombiana (Ma-
incluyen plantas, animales y microorga- nihot esculenta crantz) como soporte.
nismos, son las enzimas microbianas las
que encuentran mayor demanda en apli-
caciones industriales (2). Tradicional-
mente la produccin de a-amilasas se ha
llevado a cabo mediante procesos de fer-
mentacin lquida sumergida (FLS) debi- Una cepa de Penicillium sp. fue donada
do al mayor control de factores ambienta- por el laboratorio de microbiologa del de-
les como temperatura y pH, sin embargo, partamento de farmacia de la Universidad
la fermentacin en fase slida (FFS) Nacional de Colombia. El microorganis-
constituye una alternativa interesante mo se mantuvo a temperatura ambiente en
puesto que los metabolitos se concentran, medio Saboraud agar-maltosa 4%. El al-
y los procesos de purificacin son menos midn de yuca empleado fue adquirido en
costosos (3, 4). Los medios empleados en Ciacomeq Ltda., Bogot, Colombia. La
FFS son semejantes en textura al hbitat yuca (Manihot esculenta Crantz) fue com-
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por 30 min a 8 000 rpm, el sobrenadante
constituy el extracto crudo. Se tomaron
10 mL de cada extracto crudo y se diali-
zaron contra agua destilada para realizar
Para medir la actividad a-amilasa se utili-
medidas de concentracin de protena y
z el mtodo de Nelson-Somogyi (12). La
actividad enzimtica.
mezcla de reaccin contiene 1 mL de so-
lucin de almidn soluble al 1% (p/v),
El trabajo se continu empleando la
200 mL de una dilucin apropiada de la
FFS con yuca rallada, por ser el medio
muestra que contiene la enzima, y 800
en el cual se obtuvo la mayor produccin
mL de CaCl2 5mM. Luego de 20 min de
de enzima.
reaccin a 37 C, se adicionan 500 mL
del reactivo de Somogyi y se lleva la mez-
cla a un bao Mara a temperatura de ebu-
llicin. Pasados 10 min, se retira la mez-
cla del bao y se adicionan 500 mL del
Se emplearon bandejas de aluminio reactivo de Nelson, se completa el volu-
(22,50 cm X 16,50 cm X 2,50 cm), en men a 10 mL con agua destilada y se reali-
cada una se puso una capa de 1 cm de es- za la determinacin colorimtrica a 500
pesor aproximadamente de la mezcla de nm (espectrofotmetro Genesys 5).
100 g de yuca rallada y 100 mL de solu-
cin de sales. Las bandejas con el medio Una unidad de actividad enzimtica se
se esterilizaron a 121 C y 15 psi durante define como la cantidad de enzima que li-
15 min y se inocularon con 3 mL de la bera 1 mg de glucosa por minuto bajo las
suspensin de esporas. La incubacin se condiciones del ensayo, 37 C, pH 6,0.
realiz a 22 C durante siete das. Para La actividad especfica se define como las
obtener el extracto crudo se aadieron unidades de actividad por miligramo de
150 mL de buffer fosfato 0,1 M pH 7,0, protena.
se agit mecnicamente durante una hora La concentracin de protenas fue de-
a temperatura ambiente en un agitador de terminada por el mtodo colorimtrico de
placa MLW modelo Thys 2 a 80 oscila- Bradford (13), empleando albmina sri-
ciones completas por minuto, y se filtr la ca bovina como protena patrn.
solucin sobre algodn para retirar los
slidos gruesos. Al residuo se le realiz
una segunda extraccin bajo las mismas
condiciones y se juntaron los dos extrac- Precipitacin con sulfato de amonio
tos. El filtrado total se centrifug a 8 000
rpm por 30 min, en una centrifuga MLW El extracto crudo fue sometido a precipi-
modelo T52, el precipitado se descart y tacin fraccionada con sulfato de amonio.
se obtuvo un sobrenadante con un volu- La fraccin con la protena de inters pre-
men de 2085 mL. De este sobrenadante se cipit entre 50 y 80% de saturacin. Este
tomaron 100 mL para realizar ensayos precipitado se disolvi en el mnimo volu-
preliminares de precipitacin fraccionada men de agua destilada, se dializ 24 h
con sulfato de amonio. contra agua destilada y se liofiliz.
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Efecto de la temperatura sobre la nes metlicos fue definida como de
actividad y la estabilidad de la enzima 100%. Para medir los efectos de EDTA y
SDS, la enzima fue incubada con el com-
La temperatura ptima de la enzima fue ponente respectivo por 30 min a 37 C,
determinada en un rango de temperatura luego se realiz la medicin de actividad
entre 0 y 92 C en buffer fosfato 100 mM, enzimtica residual bajo las condiciones
pH 6,0. El efecto de la temperatura sobre normales del ensayo. La concentracin
la estabilidad fue establecido incubando final en la mezcla de reaccin para ambos
por 1 h la enzima en buffer fosfato 100 compuestos fue 10 mM. La actividad en
mM, pH 6,0 en un rango de temperatura ausencia de EDTA y SDS fue considera-
entre 40 y 92 C. La actividad residual da como de 100%.
fue determinada bajo las condiciones nor-
males del ensayo.
Capacidad para hidrolizar el almidn
de yuca y productos de hidrlisis
Efecto de la concentracin de sustrato
Los productos finales de hidrlisis luego
Se utilizaron siete concentraciones dife- de 10, 20, 30 y 60 min de incubacin fue-
rentes de almidn soluble (0,2-1,4 ron evaluados segn Hmidet et al. (15),
mg/mL). Las mediciones de actividad se mediante comparacin con patrones de
realizaron bajo las condiciones normales glucosa y maltosa en una cromatografa
del ensayo. La mezcla de reaccin conte- de capa delgada (silica gel 60 F254
na 100 mL de enzima purificada; 100 mL Merck), la fase mvil fue clorofor-
de CaCl2 5 mM; 800 mL de buffer fosfato mo/actico/agua (70:60:10, v/v/v) y el
100 mM, pH 6,0, y 1 mL de solucin de revelado se hizo con H2SO4/metanol
almidn. La estimacin de Km y Vmx se (5:95, v/v). Los productos de hidrlisis
realiz a partir de la linealizacin de Li- fueron observados como manchas oscu-
neweaver-Burk. ras luego de adicionar el revelador y ca-
lentar a 120 C por 3 min.
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Actividad a-amilasa durante cultivos en FFS (-) y FLS () usando almidn de yuca (O) y yuca ralla-
da (p) como sustrato. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.
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Resumen de la purificacin de a-amilasa de Penicillium commune.
co pico con actividad a-amilasa luego de con NaCl al 1%. El perfil cromatogrfico
la adicin de buffer fosfato 50 mM, pH (Figura 3) mostr un nico pico de activi-
6,0 NaCl 0,2 M. Las fracciones del pico dad a-amilasa, las fracciones del pico ac-
con actividad fueron reunidas en el pool tivo fueron reunidas en el pool G-75 pico
DEAE-pico II, el cual fue dializado con- II, el cual fue dializado contra agua desti-
tra agua destilada y liofilizado, alcanzan- lada y liofilizado, con este paso se alcan-
do un grado de purificacin de 10,53. z un grado de purificacin de 28,75.
Este pool fue aplicado a una columna El pool G-75 pico II se disolvi en
de Sephadex G-75, la elusin se realiz buffer fosfato 50 mM, pH 7,0, y fue apli-
Perfil de elusin sobre DEAE-Sephadex A-50. (O) Absorbancia 280 nm; (p) actividad enzimtica.
Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.
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Perfil de elusin sobre Sephadex G-75. (O) Absorbancia 280nm; (p) actividad enzimtica. Cada
punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.
cado a una columna de CM Sephadex 10 y 210 kDa (2), sin embargo, la mayo-
C-50. El perfil de elusin (Figura 4) mos- ra de las a-amilasas microbianas tienen
tr un nico pico con actividad a-amilasa su peso molecular entre 30 70 kDa, ran-
luego de la adicin de buffer fosfato 50 go en el que se encuentra la a-amilasa de
mM, pH 7,0 NaCl 0,1 M. Las fracciones P. commune.
con actividad fueron reunidas en el pool
CM- pico I, el cual fue dializado contra
agua destilada, liofilizado y disuelto en
buffer fosfato 50 mM, pH 7,0, alcanzan-
do un grado de purificacin final de
61,85. Este pool mostr una sola banda Cuando la actividad de la enzima fue en-
en la electroforesis SDS-PAGE (Figura sayada con diferentes valores de pH, la
5), indicando la purificacin hasta la ho- mxima actividad se obtuvo con pH 6,0.
mogeneidad de la enzima.
En otros estudios, el pH ptimo de la
a-amilasa de Penicillium chrysogenum
fue de 5,0 (7) y el de la a-amilasa de Peni-
La comparacin de la movilidad electro- cilium griseofulvum de 5,5 (8). Aunque el
fortica de la a-amilasa de P. commune pH ptimo para las a-amilasas vara entre
con la de los marcadores de peso molecu- 2,0 y 12,0 (2), la mayora de las a-amila-
lar en una electroforesis SDS-PAGE (Fi- sas microbianas tienen su pH ptimo en el
gura 6) permite establecer un peso mole- rango ligeramente cido a neutro, rango
cular de 35 kDa. El rango de peso en el que se encuentra el pH ptimo de la
molecular para las a-amilasas oscila entre a-amilasa de Penicillium commune.
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Perfil de elusin sobre CM Sephadex C-50. (O) Absorbancia 280nm; (p) actividad enzimtica.
Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.
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Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de a-amilasa de Penicillium commune. Cada punto ex-
perimental corresponde al promedio de dos determinaciones.
Grfica de Arrhenius. Se observan dos lneas rectas con cambio de pendiente cerca de los 50 C.
Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.
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Efecto de algunos iones metlicos, del EDTA y del SDS sobre la actividad enzimtica. La activi-
dad fue determinada luego de la incubacin de la enzima por 30 min a 37 C con diferentes sales, EDTA y
SDS. La concentracin final de los iones metlicos fue 1 mM, la de EDTA y SDS 10 mM. Al control no se le
adicionaron sales, EDTA o SDS.
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Cromatografa de capa delgada de los productos de hidrlisis de almidn de yuca por a-amilasa de
Penicillium commune. Las muestras fueron removidas con intervalos determinados de tiempo.
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cromatografa de capa delgada sobre sili- bacterial a-amylase and fungal glu-
ca gel. coamylase system and its suitability
for the hydrolysis of wheat starch.
Process Biochemistry. 2003. :
185-192.
A la profesora Pilar Melndez del depar- 5. Hlker, U.; Lenz, J. Solid- state fer-
tamento de farmacia de la Universidad mentation Are there any biotechno-
Nacional de Colombia por el suministro logical advantages? Current Opinion
de la cepa de Penicillium sp. y al Sr. Gre- in Microbiology. 2005. : 301-306.
gorio Medina del laboratorio de micro-
biologa del Instituto de Ciencia y Tecno- 6. McTigue, M. A.; Kelly, C. T.; Doy-
loga de Alimentos (ICTA) de la le, E. M.; Fogarty, W. M. The alka-
Universidad Nacional de Colombia por el line amylase of the alkalophilic Baci-
servicio de liofilizacin. llus sp. IMD 370. Enzyme and
Microbial Technology. 1995. :
A las profesoras Luisa Castiblanco y 570-573.
Silvia Restrepo, del laboratorio de mico-
loga y fitopatologa (LAMFU) de la Uni- 7. Balkan, B. y Ertan, F. Production
versidad de los Andes de Bogot, por su and properties of a-amylase from
valiosa colaboracin en la identificacin Penicillium chrysogenum and its ap-
del Penicillium commune. plication in starch hydrolysis. Prepa-
rative Biochemistry and Biotechno-
logy. 2005. : 169-178.
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