Manual de procedimientos microbiolgicos

Procedimientos de muestreo para alimentos, leches y productos lcteos

El objetivo de un muestreo es obtener una muestra representativa del alimento a
examinar, por lo tanto las unidades muestreadas debern remitirse al laboratorio,
tomando las precauciones necesarias a fin de que las condiciones bacteriolgicas
no se alteren.
Se recomienda tomar las medidas necesarias para prevenir cualquier
contaminacin de las muestras durante el transporte al laboratorio, el
almacenamiento y las manipulaciones subsiguientes.
1. Materiales:
1.1. Recipientes de muestreo: utilizar recipientes limpio, secos y esteriles;
de boca ancha y con tapa. Debeen ser de acero inoxidable u otro
material adecuado, con capacidad para una unidad de muestra (min.
225g).pueden utilizarse tapones de jebe, plstico o corcho , pero
deben estar cubiertos con un materialinerte, como por ejemplo papel
de aluminio anes de ser colocados en el recipiente.
1.2. Instrumentos de muestreo:
pipetas,esptulas,cucharas,tijeras,cuchillos,bisturs,sondas u otros
dispositivos necesarios, previamente esterilizados.
1.3. Marcadores, plumones, papel engomado, etiquetas suficientemene
grandes para anotar datos.
1.4. Equipo estrilizante: autoclave,horno bactereologico capaz de
alcanzar una temperatura de 180C.
1.5. Refrigerador, capaz de enfriar las muestras da 0-5 C en pocas horas
como aditamento indispensable el congelador para el
almeacenamiento de muestras congeladas.
1.6. Agente esterilizante : Alcohol etlico (Merck, Art. N 983 ) o alcohol
isopropilico (Merck, Art N 9634 ).
1.7. Termometro, de 20 a 100 C con sub-divisiones de 0.1 C.
2. Preparacin y dilucin de la muestra
Metodo recomendado por el Estndar methods for the examination for
dairy products (hausler, 1972) y por el AOAC(1975), con escepcion de que
este ultimo utiliza como diluyente la solucin de tampn fosfato.
2.1. Aparatos y Materiales
2.1.1. Licuadora de 2 velocidades o de velocidad simple controlada por
restato.
2.1.2. Vasos de licuadora de vidrio o meal de un litro de capacidad, con
tapas, resistentes a temperaturas de autoclavado. Se debe
utilizar un vaso esteril.
2.1.3. Balanza con pesas (capacidad 2500g) sensibilidad 0.1g.
 2.1.4. Isntrumentos para la preparacin de muestras cuchilllos,
tenedores, pinzas tijeras, cucharas esptulas, etc. Esterilizados
previamente por autoclave o aire caliente.
2.1.5. Pipetas de 1, 10 y 11 ml (especificaciones de dilucin de leche;
hausler 1972).
2.1.6. Refrigerador a 2-5C.
2.1.7. Diluyentes:
a. Agua protonada(Strake y Stokes, 1957)
Disolver 1 g de peptona en un litro de agua destialda.
Llenar los frascos o tubos de dilucin de volmenes
predeterminados de modo que despus del autoclavado
(121Cx15min) el volumen sea mas o menos 2% del
deseado, si los recipientes son calibrados reajustar el
volumen.
b. Agua peptonada salina
Formula (g por litro)
Peptona 1
NaCl 8.5
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y
ajustar el Ph a 7.0 +/-0.1
Seguir el procedimiento descrito anteriormente para el
llenado de frascosy tubos de dilucin.
Segn especificaciones de Hausler, 1972
para cada unidad de muestra 450ml en
frascos o botellas 90 o 99 ml en botellas de
dilucin o recipientes similares para leche.
2.2. Procedimiento:

2.2.1. Empezar tan pronto como sea posible despus que la muestra ha
sido tomada. Refrigerar la muestra 1-5 C cuando el anlisis no se
pueda efectuar inmediatamente.
Si la muestra esta congeladad, en su base original (o en el
recipiente en el cual ha sido recibida en el laboratorio) por un
mximo de 18 horas en refrigerador a 2-5 C si la muestra
congelada puede ser fcilmente dividida (ejemplo:helados)
proceder sin descongelar.
2.2.2. Tapar el vaso de licuadora esteril. Luego pesar 50+/-0.1g de
muestra representativa (ICMSF, 1974) si el contenido del envase
no es homogneo (como por ejemplo una comida congelada),
tomar una muestra de 50 g de un homogenizado de toda la
muestra o analizar cada porcin de alimento diferente por
separado, dependiendo del propsito de la prueba.
 2.2.3. Adicionar al vaso de licuadora 450 ml del diluyente recomendado
una dilucin de 10^-1.
2.2.4. Licuar el alimento y diluirlo rpidamente. Comenzar a velocidad
baja luego pasar a mas alta velocidad entre algunos segundos o
gradualmente en pocos segundos incrementando a mximo
voltaje. Un tiempo prudencialde licuado permitido es de dos
minutos a velocidad (para ciertos alimentos espumosos tales
como pasteles de crema un minutos de licuado es suficiente).
Esperar 2-3 minutos para dispersar la espuma.
Sin embargo una vez que el diluyente ha sido adicionado a la
muestra no se debe permitir demorar innecesarias.
2.2.5. Medir un ml de dilucin 10^-1 del material licuado, evitando la
espuma, en frascos de dilucin de 99 ml o 10 ml en frascos de 90
ml. Agitar esta dilucin y las subsiguientes vigorosamente por lo
menos 25 veces en un arco de 30 cm, repetir este procedimiento
utilizando las diluciones 10^-2,10^-3,10^-4,10^-5 o un numero de
dilucin que la experiencia indica como deseables para el
alimento en examen.
2.3. Determinacin del nmero de microorganismos aerobios
Se utilizan comnmente tres mtodos para la numeracin de
microorganismos aerobios mesofilos:
(i) Recuerdo Standard en placa el cual es tambin llamado
recuento de aerobios en placa o Pour Plate revisao por
Hartman y Hutsberger.1961; Angelotti,1969(ii)Recuento por
extensio en superficie o mtodo del Spread drop. (iii) Metodo
de recuento por gotas en superficie (miles y Misra.
1938;Sharpe y Kilsby,1971).
(ii) El etodo Plate Loop es tambin ahora ampliamente utiliado
para leches (D.I. Thompson y col, 1960). Ninguno de los
procedimientos sealados es capaz de enumerar todos los
tipos de microorganismospresentes en la muestra. Muchas de
las clulas pueden no desarrollar debido a condiciones
desfavorables de nutricin, aereacion, temperatura o duracin
de la incubacin.
(iii) En los mtodos de recuento de microrganismo en placa se
debe especificar la temperatura de incubacin en atencin a
que los distintos grupos de microorganismos tienen diferentes
rangos de temperaturas de crecimientopara los psicrotrofos de
0-7 C,mesofilos 30-35 C y termfilos 55 C. La temperatura
ser seleccionada de acuerdo con el propsito de la prueba
:por ejemplo, para averiguar la calidad bactereologica de la
leche refrigerada que proviene de los establos y /o la
efectividad y duracin de su refrigeracin se aconseja realizar
 un recuetno de microorganismo psicrotrofos a 7 C durante 10
dias; un recuento a 25 -30 C dara una mejor informacin
aceca de la sanitacin de la planta; un recuento a 35-37 C
reflejara el grado de contaminacin por mesofilos, pero 55 C
ser la temperatura de incubacin preferida para la
determinacin termofilica en el equipo de blanqueado o de
bombas de calentamiento en un sistema conductor del
alimento.
Por otra parte, el recuento de microorganismos
termoduricosmide el numero de microorganismos que
sobreviven al procedimiento de pasteuriazacion a 63C durante
3 minutos.
El mtodo que se describe a continuacin es el mas difundido
y esta recomendado para productos lacteos por el Estndar
Methods for the Examnation of Dairy Products.
2.4. Mtodo del recuento Standard en placa
2.4.1. Aparatos y materiales
Placas de Petri, de vidrio (100x15mm) o de
plstico (90x15mm).
Pipetas bactereologicas de 1.5 y 10 ml (
especificaciones para dilucin de leche,
Hausler 1972).
Bao de agua o incubador de aire a una
temperatura de 44 46 C para mantener el
agar.
Incubador a 29-39 C.
Contador de Colonias ( modelo de campo
oscuro).
Contometro.
Agar Plate Count ( Agar peptona de
casena-glucosa-extracto de levaduras)
(Merck,Art. N5463).
2.4.2. Procedimiento
Preparar la muestra por el procedimiento
recomendado en el capitulo de
preparacin y dilucin de la muestra.
Pipetear, por duplicado a placas Petri
esteriles, alcuotas de 1 ml a partir de la
dilucin 10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5 y
una alcuota de 0.1 ml de la dilucin 10^-5
para obtener 10^-1 a 10^-6 g de muestra
de alimento por placa Petri.
 Licuar el Agar Plate count en un bao de
vapor o bao de agua hirviente sin
exponerlo a demasiado calor o de
periodos prolongados de calentamiento.
Temperar el agar a 44 -46C y controlar su
temperatura cuidadosamente para evitar la
muerte de las bacterias en la muestra
diluida, Agregar rpidamente a las placas
Etri 10-15 ml de agar licuado y temperado.
Eltiempo trnascurrido desde la preparacin
de la dilucin del agar no se debe exceder
los 26 minutos, se recomienda de
preferencia que sean menos de 10
minutos. Mezclar bien por rotacin.
Una vez solidificado el agar, invertiras placas
e incubarias a 29-31 C durante4+/- 3 horas.
Computar el recuento Estndar em placa o el
estimado del recuento en placa.
2.5. Computo del recuento Standar

 Determinacin del Nmero de Microorganismo

50g o ml

450ml
10ml 10ml 10ml

1ml 1ml 1ml

1ml 1ml 1ml 1 ml 1ml

1. Agar plate count (Agar peptona de casena-glucosa- extraxto de levaduras,
Merck, Art. N 5463).
2. Agar cuenta grmenes Estndar (Merck, Art N1621)
3. Agar recuento libre de azucares Fil- IDF (Merck, Art N 10878)
4. Gelatina nutritiva especial para el recuento electrnico de
microcolonias(Merck, Art N 4067).
5. En el caso de alimentos solidos, homogenizar a 15000-20000rpm por un
tiempo no mayor a 2.5 minutos.