DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD CATALTICA DE LA

PAPANA A PARTIR DE LA PAPAYA (Carica papaya)

Briceo Sevilla Josselyne Michelle

Departamento de Ciencias Exactas, Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE

Sangolqu, Ecuador

jmbriceno@espe.edu.ec

Abstract- Papain is an enzyme of wide industrial use, with extremely optimum properties that confer stability and ease of
production. Its enzymatic activity has been observed in the following investigation as a function of milk decomposition, an increase
in its viscosity and specific analyzes that quantitatively determine the change made by the enzymatic reaction. In this way, the use of
numerical methods such as linear adjustments, interpolations, derivatives, helped in this work to determine the variability, the
relationship and the behavior of the analyzed variables such as reaction rate, substrate concentration, absorbances, viscosity,
reaction time. Concluding that the method used is applicable and reproducible.

Key words: Enzymes, hydrolysis, reaction rate, viscosity, data adjustments.

Resumen- La papana es una enzima de amplio uso industrial, con unas propiedades sumamente ptimas que le confieren
estabilidad y facilidad de obtencin. Su actividad enzimtica ha sido observada en la siguiente investigacin en funcin de la
descomposicin de la leche, un aumento en su viscosidad y anlisis especficos que determinen cuantificativamente el cambio
realizado por la reaccin enzimtica. De esta manera el uso de mtodos numricos como lo es ajustes lineales, interpolaciones,
derivadas, ayudaron en este trabajo a determinar la variabilidad, la relacin y el comportamiento de las variables analizadas como
la velocidad de reaccin, concentracin de sustrato, absorbancias, viscosidad, tiempo de reaccin. Concluyendo que el mtodo
usado es aplicable y reproducible.

Palabras clave: Enzimas, hidrlisis, velocidad de reaccin, viscosidad, ajustes de datos.

I. INTRODUCCIN La importancia ejercida principalmente en enzimas de este tipo

La papana es una proteasa que tiene la capacidad de hidrolizar
los enlaces peptdicos siendo anloga a la pepsina. Entre sus
propiedades, al ser moderadamente soluble en agua y glicerol e
insoluble en prcticamente la mayora de los solventes
orgnicos, se aprovechan estas caractersticas para su
extraccin y purificacin, sin embargo, su tiempo de vida til
es corto, por lo que se la debe mantener en ambientes secos y
fros para su conservacin(Gutirrez & Cruz, 2017).
Su forma de extraccin y aislamiento est basada en la
obtencin de un slido cristalino el cual es obtenido mediante
tcnicas en juego de sus propiedades y pH, usando la pulpa de
la papaya, una fruta originaria de regiones tropicales de
Latinoamrica, junto al extracto de sus semillas. El extracto
obtenido, con una buena actividad sirve para la industria textil,
farmacutica, alimentaria y otras(J. Quino Favero, Bernal
Portilla, & Ycono Llanos, 2008).
es principalmente por el hecho del volumen del mercado
mundial, en donde dos terceras partes son consumidas para la
elaboracin y el control de alimentos. Biotecnolgicamente
estas reas se utilizan como una de las formas ms antiguas de
industrializacin (J. M. Quino Favero, Ycono Llanos, &
Zelada Chvez, 2010).
La actividad de la papana se realiza mediante utilizacin en
sustratos, como casena, leche o descomposiciones crnicas, en
donde ha determinado una actividad mxima de 0.125mg/mL,
tomando en cuenta esos factores que terminan por afectar la
actividad proteoltica como lo es la edad, el sexo del fruto, la
hora de recoleccin, adicin de agentes qumicos, etc
El uso de software que faciliten la determinacin de estos
factores, anlisis de actividades enzimticas en donde las
variables a analizar sern las absorbancias vs tiempo usadas de
sustrato, la viscosidad vs tiempo, la velocidad de reaccin vs el
tiempo de accin y el tiempo de tratamiento de extraccin de la
enzima, por lo que la metodologa numrica es de gran ayuda
en los anlisis (Meja Aguilar & Vega Rmos, 2010).
I. METODOLOGA
i. Obtencin del fruto de Papaya (Carica papaya)
La seleccin de materia prima se realiz tomando en cuenta
caractersticas de la fruta, como el olor fuerte, el color de la
pulpa y la cscara, siendo la variedad Tainung 1 (Formosa)
comercializada en Ecuador, utilizando 4 papayas en total en
estado semi maduro (color verde de la cscara)(J. M. Quino
Favero et al., 2010).
ii. Extraccin de la papana
Se utiliz agua destilada para lavar la fruta y eliminar cualquier
tipo de contaminante, para su posterior desinfeccin con
alcohol al 70%. El fraccionamiento se realiz mediante cortes
longitudinales de la fruta, separando cscara, pulpa y corazn,
seguido de la molida de pulpa en una trituradora y las pepas en
un mortero para la extraccin del lquido. Se realizaron 2
filtrados, inicialmente usando una cernidera seguido del paso
de la solucin por papel filtro para descartar cualquier resto o
contaminante(J. M. Quino Favero et al., 2010).
Se realiza la medicin del volumen de la pulpa obtenida, dado
que el volumen obtenido se lo multiplica por 1.5 mL y esa
cantidad se aade de etanol al 96%. Se congela la mezcla en
frascos cerrados de 50 mL a -20C durante 3 das (J. M. Quino
Favero et al., 2010).
Se procede a la centrifugacin a 4 500 rpm durante 20 minutos,
se elimina el sobrenadante y el precipitado se recolecta para su
posterior centrifugacin.
iii. Purificacin enzimtica
Se coloca el precipitado por una solucin de sulfito de sodio
para obtener una enzima ms purificada, durante 30 minutos,
en donde se elimina el sobrenadante y se recolecta el
precipitado.
El procedimiento de concentracin se realiza mediante la
colocacin del precipitado en cpsulas de porcelana a 40C por
18h en una estufa controlada. Se procede a moler usando un
mortero y pistilo hasta obtener un polvo completamente
pulverizado con 0% de humedad.
Se coloca el polvo obtenido a 5 C en refrigeracin para evitar
la prdida de la actividad.
iv. Determinacin de la actividad proteoltica de la
papaya
a. Absorbancias vs tiempo
El mtodo para la determinacin de la actividad enzimtica fue
una adaptacin del propuesto por Balls & Hoover, en donde se
determina la absorbancia y la viscosidad de los sustratos frente
a la su concentracin y descomposicin.
En una balanza analtica se pes 15.5g de leche en polvo y se
mezcl con 108mL de agua destilada a una temperatura de 40
C para garantizar su total disolucin, manteniendo agitacin
constante de 100rpm. La disolucin de la enzima se realiza
colocando 100mL de vinagre en 0.1g del concentrado
protenico de papana obtenido, pasndolo por constante
agitacin a 100rpm, hasta su homogeinizacin (J. M. Quino
Favero et al., 2010).
Se coloca en cubetas espectrofotomtricas usando un blanco
inicial el cual se coloc a una lectura de longitud de onda de
610nm para continuar las mediciones. Se coloc las 15 muestra
de soluciones a diferentes tiempos y se realiz la lectura que
ayud a determinar el control de la actividad. Se utiliza la
siguiente ecuacin para determianar la concentracin del
sustrato:
= (Ec.1)
Dnde:
A= absorbancia; C=concentracin; =coeficiente de extincin
molar; l=longitud de la celda= 1cm.
b. Viscosidad vs tiempo
Se usa el mismo principio inicial para la medicin de las
absorbancias.
Se regul la temperatura a 20C en un bao termosttico y se
midieron los tiempos transcurridos que demoraba cada muestra
aumentar su viscosidad.
Se realiza el clculo de la constante de viscosidad (Ec.2) y
viscosidad (Ec.3) usando la densidad de la leche y el tiempo de
reaccin, usando las ecuaciones siguientes que permiten la
recoleccin de datos a analizar:
 (Ec.2)
Curva [Pi] vs abs
Donde k es la constante de viscosidad, la viscosidad, la 1
1, 0.928
densidad de la leche (1030[kg/m3]) 0.8

(Ec.3) 0.6

Abs
0.4
0.2
c. Determinacin de la velocidad de reaccin y
cintica enzimtica. 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Se realizaron los clculos utilizando la ecuacin inicial de y = 0.8408x + 0.0371 [Pi]
Michaelis & Menden y la ecuacin de los dobles inversos R = 0.9821
para la medicin de la actividad enzimtica, utilizando los
mtodos de ajuste lineal e interpolacin de Lgrange. Se Ilustracin 2 Curva de relacin de las absorbancias frente a la
aplic de igual manera los mtodos de derivacin, concentracin del producto de la reaccin
integracin y ecuaciones diferenciales para el ejercicio, La curva de relacin permite determinar la normalidad de los
que ayuden a predecir los resultados en prximas datos frente a la concentracin de la muestra blanco, de esta
investigaciones (J. M. Quino Favero et al., 2010). manera concluir que existe dependencia entre la absorbancia de
las muestras y la concentracin de leche en las disoluciones.
II. RESULTADOS

a. Absorbancias vs tiempo

Tabla 1 Curva de calibracin del blanco de leche en polvo a 610nm

CURVA DE CALIBRACION

Leche en polvo g/mL Abs

0,04 0,035
0,08 0,159
0,1 0,172
0,2 0,18
0,3 0,274
0,4 0,345
0,6 0,52
0,83 0,706
1 0,928 Ilustracin 1 Grfica obtenida por el mtodo de Lagrange, usando el
software MatLab

La ilustracin 3 muestra la grfica de comparacin obtenida por

En la Tabla 1 se pueden observar los resultados de la curva de
el programa realizado en MatLab, muestra una aproximacin
calibracin realizada a partir de las muestras de la solucin de
grfica de ajuste de datos en donde se puede observar que en
la leche en polvo a diferentes concentraciones. A partir de esta
concentraciones de 0.01 a 0.3, las absorbancias tienen valores
tabla se ha realizado el ajuste lineal de los datos para obtener el
aproximados ascendentes dada que la turbidez de la muestra va
valor de correlacin y la ecuacin lineal de ajustes.
ascendiendo.
Ilustracin 4 Coeficiente de correlacin entre los datos analizados

El coeficiente de correlacin obtenido comparado con el valor

terico, indica que los datos siguen una correlacin normal, de
esta manera, que existe la dependencia de las variables de
concentracin y absorbancias, concluyendo que al aumentar la
concentracin de leche, las absorbancias aumentan.

Ilustracin 7 Obtencin de la ecuacin general usando el mtodo de

derivacin centrada

Como se muestra en la ilustracin 7, no existe segunda

derivada a la funcin, debido a que la segunda derivada
Ilustracin 5 Curva de relacin de las absorbancias frente a la expresa en qu grado cambia la funcin respecto a la variable
concentracin del producto de la reaccin, analizada en MatLab. independiente. Tomando en cuenta que la primera derivada es
un valor constante, no existen cambios extremos en la funcin.
La ilustracin 5 muestra la curva de relacin de ajuste lineal de
los datos experimentales, observando una distribucin normal
de los datos.

iii. Derivacin centrada

[Pi]
d Abs

[Pi] Ilustracin 8 Grfica de la ecuacin general usando el mtodo de

Ilustracin 6 Derivacin centrada de la calibracin del blanco de la
recta
La derivacin de la ecuacin de ajuste lineal, ayuda a
determinar en qu grado la absorbancia va a cambiar frente a la
variacin de la concentracin, la cual siendo una ecuacin de
primer grado, esta resultar en una recta constante.
Gauss Legendre
La ilustracin 8 ex presa el anlisis del rea bajo una curva,
mediante el uso del mtodo de Gauss Legendre, la cual como
se muestra en la ilustracin 8, el rea bajo la lnea recta
obtenida por el mtodo de Lagrange, nos muestra como
resultado 0.4575, en un rango de absorbancias de 0 a 1.
Tabla 2 Distribucin de absorbancias y concentraciones del blanco, lo que determina que ha cierto tiempo la enzima pierde
producto de la reaccin enzimtica frente a diferentes la actividad.
concentraciones de sustrato en 3 tiempos de accin

Abs vs t S + E => P + E
[S] (%) [P] (%) [P] (%) [P] (%)
5 min 10 min 15 min
Leche 5min 10min 15min
0.1 0.45 0.266 1.064 1.868 3.161 0.790
0.1 0.4 0.264 1.065 2.102 3.185 0.789
0.1 0.48 0.267 1.065 1.752 3.149 0.789
0.25 0.818 0.596 1.403 1.028 1.411 0.599
0.25 0.85 0.597 1.4 0.989 1.408 0.601
Ilustracin 10 Obtencin de la grfica de desarrollo del flujo de
0.25 0.83 0.59 1.408 1.013 1.425 0.597
Absorbancias VS tiempo, por el mtodo de mnimos cuadrados
0.5 1.219 1.096 1.786 0.690 0.767 0.471
0.5 1.225 1.094 1.79 0.686 0.769 0.470 En la Ilustracin 10 se observan los resultados experimentales
de las absorbancias versus el tiempo de reaccin en la muestra
0.5 1.205 1.095 1.786 0.698 0.768 0.471
control en comparacin con la ilustracin 9 mostrando
0.75 1.564 1.522 1.846 0.538 0.552 0.455
concordancia de los datos
0.75 1.56 1.52 1.85 0.539 0.553 0.454
0.75 1.562 1.519 1.849 0.538 0.554 0.455
1 1.579 1.591 1.858 0.532 0.528 0.453
1 1.575 1.596 1.854 0.534 0.527 0.454
1 1.58 1.593 1.852 0.532 0.528 0.454

En la tabla 2 se muestran los resultados de concentraciones

finales a partir de la reaccin enzimtica utilizando la enzima
proteasa de la papaya. Ilustracin 11 Obtencin de la grfica de desarrollo del flujo de
Absorbancias VS tiempo, por el mtodo de mnimos cuadrados

Se observa de igual manera los resultados analizados a partir

del segundo 30 a 42, en donde se observa una buena actividad
enzimtica debido a la disminucin de absorbancias, por lo que
se concluye un a degradacin de protenas y una solucin
menos turbulenta.

b. Viscosidad vs tiempo

Tabla 3 Datos de desarrollo de viscosidad de la muestra frente al

tiempo de accin

Tiempo k P
Ilustracin 92 Diagrama de flujo de absorbancias VS tiempo, Leche t(min) u[mPa*s]
transcurrido [m3*mPa/Kg] [Kg/m3]
(decresin de las absorbancias antes de la reaccin y aumentos, 0 108 2.84E-05 1030 3.16
despus de la reaccin) 2 114.5 2.84E-05 1030 3.35
4 123.5 2.84E-05 1030 3.61
La absorbancia de los tratamientos medidos dependiendo del 6 134.5 2.84E-05 1030 3.93
8 151.5 2.84E-05 1030 4.43
tiempo en que se ha realizado la reaccin enzimtica se 10 169.8 2.84E-05 1030 4.97
muestran en la ilustracin 9 de control terico, en donde se 12 189.5 2.84E-05 1030 5.55
observa en la primera curva, absorbancias constantes dada la 14 204.5 2.84E-05 1030 5.99
16 211.5 2.84E-05 1030 6.19
inexistencia de enzima, contraria a la segunda curva donde se 18 215.8 2.84E-05 1030 6.32
observa un aumento de las absorbancias, hasta llegar al valor
 20 219 2.84E-05 1030 6.41 La representacin de la viscosidad frente al tiempo de datos
20 219 2.84E-05 1030 6.41
experimentales, se puede observar en la comparacin con la
ilustracin 12, que existe una correspondencia de los datos
En la Tabla 3 se observan los datos de desarrollo de viscosidad experimentales, demostrando la validez del mtodo usado, y
frente al tiempo de reaccin, lo que determina que a medida una correcta actividad enzimtica frente al tiempo de accin en
que el tiempo de contacto entre la muestra de leche y papana, presencia del sustrato.
aumenta la viscosidad que concluye en la descomposicin de
protenas por la propiedad de hidrlisis.

Ilustracin 14 Representacin de la viscosidad VS el tiempo de

accin de la enzima usando una aproximacin polinomial

Ilustracin 3 Diagrama de ajuste lineal de la viscosidad VS el tiempo
de accin
La ilustracin 12 muestra el ajuste lineal de los datos de
viscosidad frente al tiempo tericos de actividad demostrando
que existe una distribucin normal entre los datos y una
correlacin del 0.9704, de la grfica realizada en Excel.
Un ajuste cuadrtico explica de mejor manera la correlacin de
las variables de viscosidad y tiempo de actividad con un valor
de 0.9743, asemejndose mejor a la curva de datos tericos en
la Ilustracin 14.
Viscosidad

Tiempo de actividad

Ilustracin 15 Grafica de la representacin de la viscosidad VS el

tiempo de accin de la enzima usando una aproximacin polinomial
Ilustracin 13 Representacin de la viscosidad VS el tiempo de Una representacin de datos experimentales en un ajuste
accin de la enzima
cuadrtico se puede observar en la Ilustracin 15, en
comparacin con la Ilustracin 14, se observa una
correspondencia de los datos mayor que el ajuste lineal.

Ilustracin 16 Grfica de la representacin de la viscosidad VS el

tiempo de accin de la enzima usando una aproximacin polinomial
en el software MatLab

La Ilustracin 16 muestra la representacin de la relacin de Ilustracin 4 Grfica de la representacin de la derivada de la

tiempo VS viscosidad en un modelo cuadrtico analizado
mediante el mtodo de mnimos cuadrados, mostrando
dependencia entre las variables de viscosidad y tiempo de
actividad.
dviscosidad
viscosidad VS el tiempo de accin de la enzima.
Como se muestra en la ilustracin 18, no existe segunda
derivada a la funcin, debido a que la segunda derivada
expresa en qu grado cambia la funcin respecto a la variable
independiente. Tomando en cuenta que la primera derivada es
un valor constante, no existen cambios extremos en la funcin.

[Pi]

Tiempo de actividad

Ilustracin 17 Grfica de la representacin de la viscosidad VS el

tiempo de accin de la enzima usando una aproximacin polinomial
en el software MatLab

La derivacin de la ecuacin de ajuste lineal, ayuda a Ilustracin 19 Grfica de la representacin de la integracin de la

determinar en qu grado la viscosidad va a cambiar frente a la funcin de la viscosidad VS el tiempo de accin de la enzima
variacin del tiempo de actividad enzimtica al que la muestra
est expuesta, la cual siendo una ecuacin de primer grado, esta La ilustracin 19 expresa el anlisis del rea bajo una curva,
resultar en una recta constante. mediante el uso del mtodo de Gauss Legendre, la cual como
se muestra en la ilustracin 10, el rea bajo la lnea recta
obtenida por el mtodo de Lagrange, nos muestra como
resultado 0.0526, en un rango de absorbancias de -6 a 6.
c. Determinacin de la velocidad de reaccin y
cintica enzimtica.
Ilustracin 20 Grfica de la representacin de las absorbancias VS la
concentracin observando el grado de correlacin.
En la Ilustracin 20 se muestran las relaciones de absorbancias
VS concentracin para determinar la velocidad de reaccin de
la enzima frente a la solucin de leche descremada. Se
observan 3 curvas, pertenecientes a los 5, 10, 15 minutos de
reaccin en resultados tericos.
Ilustracin 21 Grfica de la representacin de la abs VS
concentracin de [S] por medio del mtodo de Lagrange
La velocidad VS la concentracin del sustrato, ayudan a
determinar la velocidad mxima de la enzima, y la cantidad de
sustrato necesaria para tal actividad, se observa grficamente
en la Ilustracin 21 que el mximo de la velocidad enzimtica a
los 5 minutos, se aproxima a 0.027 mol/s
Ilustracin 225 Grfica de la representacin de la abs Vs [S], por el
tiempo de 5 minutos
La Ilustracin 22 exibe la relacin entre la abs VS la
concentracin en el tiempo de 5 minutos, se puede observar
que a medida que la concentracin aumenta, la absorbancia
aumenta debido a la reaccin de residuos con la solucin
reveladora de proteasas con un mximo de absorbancias de
1.600nm aproximdamente.
velocidad
[S]
Ilustracin 23 Grfica de la representacin de la variacin de la
velocidad en funcin de la [S]
La derivacin de la ecuacin de ajuste lineal, ayuda a
determinar en qu grado la viscosidad va a cambiar frente a la
variacin del tiempo de actividad enzimtica al que la muestra
est expuesta, la cual siendo una ecuacin de primer grado, esta
resultar en una recta constante.
Como se muestra en la ilustracin 24, no existe segunda
derivada a la funcin, debido a que la segunda derivada
expresa en qu grado cambia la funcin respecto a la variable
independiente. Tomando en cuenta que la primera derivada es
un valor constante, no existen cambios extremos en la funcin.

Ilustracin 24 Grfica de la representacin de la variacin de la
velocidad en funcin de la [S]
[Pi]
Ilustracin 25 Grfica de la representacin de la integral de la
funcin de relacin de la velocidad VS la [S] de sustrato en tiempo
de reaccin de 5 minutos.
La ilustracin 25 expresa el anlisis del rea bajo una curva,
mediante el uso del mtodo de Gauss Legendre, la cual como
se muestra en la ilustracin 10, el rea bajo la lnea recta
obtenida por el mtodo de Lagrange, nos muestra como
resultado 0.6446, en un rango de absorbancias de -6 a 6.
La Abs VS la concentracin del sustrato, ayudan a determinar
la velocidad mxima de la enzima, y la cantidad de sustrato
necesaria para tal actividad, se observa grficamente en la
Ilustracin 26.
Abs
[S]
Ilustracin 26 Grfica de la representacin de la abs VS
concentracin de [S] por medio del mtodo de Lagrange en tiempo
de 10minutos
El mximo de la velocidad enzimtica a los 10 minutos, se
aproxima a 0.003 mol/s tomando en cuenta que al cabo de
llegar a concentracin de 1, y tiempo de 10 minutos, la
actividad enzimtica de la papana empieza a disminuir.
Ilustracin 27 6 Representacin de la relacin de la abs VS la [S] de
sustrato en tiempo de reaccin de 10 minutos.
La Ilustracin 27 exhibe la relacin entre la abs VS la
concentracin en el tiempo de 10 minutos, se puede observar
que a medida que la concentracin aumenta, la absorbancia
aumenta debido a la reaccin de residuos con la solucin
reveladora de proteasas con un mximo de absorbancias de
1.60 nm aproximadamente.
 Velocidad
[S]
Ilustracin 287 Grfica de la representacin de la variacin de la
velocidad en funcin de la [S] a 10minutos
La derivacin de la ecuacin de ajuste lineal, ayuda a
determinar en qu grado la viscosidad va a cambiar frente a la
variacin de la concentracin a diferentes tiempo
correspondientes a la funcionalidad de actividad enzimtica al
que la muestra est expuesta, la cual siendo una ecuacin de
primer grado, esta resultar en una recta constante.
Ilustracin 29 Grfica de la representacin de la variacin de la
velocidad en funcin de la [S] a 10 minutos.
Como se muestra en la ilustracin 29, no existe segunda
derivada a la funcin, debido a que la segunda derivada
expresa en qu grado cambia la funcin respecto a la variable
independiente. Tomando en cuenta que la primera derivada es
un valor constante, no existen cambios extremos en la funcin.
[Pi]
Ilustracin 30 Grfica de la representacin de la velocidad VS la [S]
de sustrato en tiempo de reaccin de 10 minutos.
La ilustracin 30 expresa el anlisis del rea bajo una curva,
mediante el uso del mtodo de Gauss Legendre, la cual como
se muestra en la ilustracin 10, el rea bajo la lnea recta
obtenida por el mtodo de Lagrange, nos muestra como
resultado 1.1377, en un rango de absorbancias de -6 a 6.
Velocidad
[Pi]
Ilustracin 31 Grfica de la Representacin de la Velocidad en
funcin a la concentracin durante 15 minutos de reaccin.
El mximo de la velocidad enzimtica a los 10 minutos, se
aproxima a 0.036 mol/s tomando en cuenta que al cabo de
llegar a concentracin de 0.8 y tiempo de 15 minutos la
actividad enzimtica empieza a disminuir, ara tomar otro pico
de aumento de actividad hasta llegar a velocidad mxima.
 inhibicin por sustrato, hasta que la enzima pierda totalmente
su actividad.

Ilustracin 328 Representacin de la velocidad en funcin a la

concentracin durante 15 minutos de reaccin.

La Ilustracin 32 presenta la relacin entre la abs VS la
concentracin en el tiempo de 15 minutos, se puede observar
que a medida que la concentracin aumenta, la absorbancia
aumenta debido a la reaccin de residuos con la solucin
reveladora de proteasas con un mximo de absorbancias de 1.9
nm aproximadamente determinando que a tiempo de 15
minutos, es el mejor tiempo de actividad de la enzima.
Velocidad
Ilustracin 349 Grfica de la representacin de la variacin de la
velocidad en funcin a la concentracin durante 15 minutos de
reaccin.
Como se muestra en la ilustracin 34, no existe segunda
derivada a la funcin, debido a que la segunda derivada
expresa en qu grado cambia la funcin respecto a la variable
independiente. Tomando en cuenta que la primera derivada es
un valor constante, no existen cambios extremos en la funcin.

[Pi]

[S]

Ilustracin 32 Grfica de la representacin de la variacin de la

velocidad en funcin a la concentracin durante 15 minutos de
reaccin.
Ilustracin 35 Grfica de la representacin de la velocidad VS la [S]
La ilustracin 32 analiza los puntos de concentracin de 1 a 3, de sustrato en tiempo de reaccin de 15 minutos.
en donde como se puede observar la velocidad de reaccin va
disminuyendo, lo que demuestra que despus de cierto tiempo La ilustracin 35 expresa el anlisis del rea bajo una curva,
a una concentracin excesiva se producir posiblemente una mediante el uso del mtodo de Gauss Legendre, el rea bajo la
lnea recta obtenida por el mtodo de Lagrange, nos muestra
como resultado 1.1031, en un rango de absorbancias de -6 a 6.
i. Anlisis de velocidad VS concentracin
Ilustracin 3610 Grfica de la representacin de la viscosidad VS el
tiempo de accin de la enzima usando una aproximacin polinomial
en el software MatLab
En la Ilustracin 36 se pueden observar valores tericos en
funcin a una aproximacin polinomial con un factor de
correlacin de 0.9264, en funcin de la velocidad y la
concentracin a 5, 10 y 15 minutos. La ecuacin de la recta
obtenida equivalente a: y = 0.0112x + 0.027, permite
determinar valores aproximados de la funcin hasta llegar a un
punto mximo de la velocidad de 0.04 mol/s
aproximadamente.
Velocidad
Velocidad
[Pi]
Ilustracin 37 Grfica de la representacin de la Velocidad VS el [S]
de la enzima usando una aproximacin polinomial en el software
MatLab
En la Ilustracin 37 se pueden observar valores experimentales
en funcin a una aproximacin polinomial con un factor de
correlacin de 0.9264, en funcin de la velocidad y la
concentracin a 5, 10 y 15 minutos. La ecuacin de la recta
obtenida permite determinar valores aproximados de la funcin
hasta llegar a un punto mximo de la velocidad de 0.03 mol/s
aproximadamente, sin embargo en este punto, la velocidad
enzimtica tiende a descender por la actividad de proteasas
inhibidas a bajas temperaturas.
Ilustracin 3811 Representacin de la velocidad de accin en
funcin a la concentracin durante 15 minutos de reaccin.
La Ilustracin 38 presenta la relacin entre la velocidad de
accin VS la concentracin en el tiempo de 5, 10 , 15 minutos,
se puede observar que a medida que la concentracin aumenta,
la velocidad de accin hasta llegar a un punto estimado de
mxima accin de 0.03 mol/s , concordando con los datos
tericos de investigacin
[S]
Ilustracin 39 Grfica de la representacin de la velocidad VS el
tiempo de accin de la enzima usando una aproximacin polinomial
en el software MatLab

1/V
La ilustracin 39 analiza los puntos de concentracin de 0 a 2,
en donde como se puede observar la velocidad de reaccin va
aumentando, lo que demuestra que en cierto tiempo de rango a
una concentracin neutral se producir posiblemente una [Pi]
reaccin con sustrato de variacin de velocidad constante
frente a los 3 tiempos.

Ilustracin 41 Grfica de la representacin de la integracin de la

funcin de la [S] VS el tiempo de accin de la enzima

Dobles Inversos
600
y = 74.405x - 53.195
400 R = 0.9265

200
1/V

0
Ilustracin 40 Grfica de la representacin de la derivada velocidad -4 -2 0 2 4 6 8
VS [S] de accin de la enzima usando una aproximacin polinomial -200
en el software MatLab
-400
1/[S]
Como se muestra en la ilustracin 40, no existe segunda
derivada a la funcin, debido a que la segunda derivada
Ilustracin 42 Grfica de la representacin de los dobles inversos
expresa en qu grado cambia la funcin respecto a la variable
para determinar la velocidad mxima y la constante de disociacin
independiente. Tomando en cuenta que la primera derivada es del complejo Enzima, sustrato.
un valor constante, no existen cambios extremos en la funcin.
La Ilustracin 42 presenta una relacin de dobles inversos
tambin llamada ecuacin de Lineweaver and Burk, en donde
La ilustracin 41 expresa el anlisis del rea bajo una curva, los corte con los ejes de ordenadas y las abscisas, permitirn la
mediante el uso del mtodo de Gauss Legendre, el rea bajo la recoleccin de datos de Km, constante de disociacin del
lnea recta obtenida por el mtodo de Lagrange, nos muestra complejo enzima y sustrato y la velocidad mxima de accin
como resultado 0.0528, en un rango de absorbancias de -6 a 6. de la papana de los datos tericos.
 1/Velocida
1/[S]

Ilustracin 4312 Grfica de la representacin de la Ecuacin que

relaciona los inversos de la velocidad de reaccin con los inversos
del sustrato.

La Ilustracin 43 presenta una relacin de dobles inversos en

donde los cortes con los ejes de ordenadas y las abscisas,
permitirn la recoleccin de datos de Km, constante de
disociacin del complejo enzima y sustrato y la velocidad
mxima de accin de la papana de los datos experimentales
tomando en cuenta la ecuacin de la recta obtenida que permita
la prediccin de velocidades de accin a varias concentraciones
1/Velocidad
Ilustracin 45 Grfica de la representacin de la variacin entre los
inversos de la velocidad de reaccin en funcin a los inversos de la
concentracin
Como se muestra en la ilustracin 45, no existe segunda
derivada a la funcin, debido a que la segunda derivada
expresa en qu grado cambia la funcin respecto a la variable
independiente. Tomando en cuenta que la primera derivada es
un valor constante, no existen cambios extremos en la funcin.

1/[S]

1/[S]
Ilustracin 4413 Grfica de la representacin de la variacin entre
los inversos de la velocidad de reaccin en funcin a los inversos de
la concentracin

La ilustracin 44 analiza los puntos de concentracin de 3 a 5,
en donde como se puede observar la velocidad de reaccin va
en deceso, lo que demuestra que despus de cierto tiempo a una
concentracin excesiva se producir posiblemente una
inhibicin por sustrato, hasta que la enzima pierda totalmente
su actividad.
Ilustracin 46 Grfica de la representacin el rea bajo la curva de la
funcin de relacin entre los inversos de la velocidad de reaccin en
funcin a los inversos de la concentracin
La ilustracin 41 expresa el anlisis del rea bajo una curva,
mediante el uso del mtodo de Gauss Legendre, el rea bajo la
lnea recta obtenida por el mtodo de Lagrange, nos muestra
como resultado 669.035, en un rango de absorbancias de -6 a 6.
1/[S]
Ilustracin 47 Grfica de la representacin de la funcin de relacin
entre los valores la velocidad de reaccin en funcin a los valores de
la concentracin mediante el mtodo de Euler mejorado.
La ilustracin 47 expresa el anlisis la ecuacin diferencial,
que expresa en qu grado se va a dar la variacin de la variable
dependiente frente a la independiente, dando como resultado la
ecuacin perteneciente a Michaelis and Menden.
III. DISCUSIN
La utilizacin de la enzima papana libre e inmovilizada, se
hace con el objeto de determinar si hay disminucin de la
actividad proteolitica en el proceso de inmovilizado, frente a la
enzima libre. Existe un llamado proceso semicontinuo, se le
coloca un volumen del sustrato proteico y se realizan lecturas a
diferentes tiempos, dando como resultado que a los 45 minutos
se dio una disminucin del contenido de protenas igual al que
se dio a las 24 horas (inicial de 0.040 y la final de 0.016)
(Meja Aguilar & Vega Rmos, 2010).
Se determin realizar este proceso (semicontinuo), debido a
que se invierte un menor tiempo para la hidrlisis de las
protenas y as se pueden realizar un nmero mayor de
procesos de hidrlisis en las muestras con el mismo resultado
que si estuviera en contacto por 24 horas, as se ahorra tiempo
y dinero (Aguirre, 2010).
Los factores que influyen para la ptima extraccin y actividad
de la papana son, humedad, temperatura adecuada, oxgeno y
tiempo para desarrollarse del fruto. La temperatura ptima de
extraccin est en el rango de 30 a 60C. La presencia de un
alto contenido de humedad, provoca que el sustrato se
compacte, ocasionando que no haya una adecuada penetracin
de oxgeno y poca oxidacin. Las papana producida por la
papaya, son enzimas intracelulares lo que para facilita su
extraccin, es necesaria una ruptura de membranas por
contacto, en este caso se realiz la tcnica de molienda por
mortero y postilo, seguida de una centrifugacin para la
obtencin de la misma (Yugcha, 2010).
En la investigacin se us como sustrato la leche en polvo,
Segn Pandey, A., Soccol, R. R., & Larroche, C. (2008), para
que el sustrato pueda ser hidrolizado por papana debe estar en
un pH entre un rango de 6 a 7, es as que para medir la
actividad enzimtica el uso de buffer fosfato 0,2 M pH 6.5 es
primordial e importante (Industrial, 2010).
El mtodo analtico empleado para medir la actividad de la
enzima papana fue el que considera el uso del reactivo de
Taussky-Shorr, que permite detectar el casena, seguido de la
formacin de un complejo azul de Pi-molibdato reducido, cuya
absorbancia se mide a 610 nm despus de 1 hora que haya
precipitado o luego de centrifugar (Voet & Voet, 2006).
Donarey, J. (2007), menciona que la velocidad de hidrlisis
enzimtica se expresa como la cintica de Michaelis-Menten,
ya que la liberacin de casena es dependiente de la
concentracin de sustrato utilizado, especie evaluada,
diferentes pH y temperaturas. Siendo la enzima de
investigacin un tipo A, con un periodo de produccin de 5 a 8
das y ph de 5 segn Rutherfurd, S. (2004).
Enfocndose en la cintica, referente a la filtracin simple del
inoculo , en la grfica velocidad en funcin del sustrato de la
ilustracin 5 se observ que la curva con mayor produccin de
papana corresponde a la del da 7, ya que podemos observar
que los coeficientes cintico, respeto a la inoculacin dan un
km = 3.26 (umol) y Vmax= 0.0398 (umol/min)
correspondientes a los datos ms altos de la tabla 13, cabe
recalcar que para el clculo de estos se utiliz las absorbancias
de tiempo 60 min , como muestra la tabla 10 ya que en este
tiempo es donde se encontr mayor actividad
La Tabla 2 muestran velocidades mximas de 0.0154
(umol/min), 0.0468 (umol/min), 0.0724 (umol/min) y Km de
1.4709 (umol), 1.0792 (umol), 1.9359 respectivamente. En
base a estos resultados se observa que la mayor actividad
corresponde al minuto 10 (Marcial & Cristina, 2011).
Los mtodos numricos empleados han servido de ayuda, pues
han facilitado la obtencin del tipo de representacin que
conocemos como Teora de los Sistemas Bioqumicos (TSB),
que se basa en la posibilidad de expresar las ecuaciones de
velocidad de las reacciones y otros procesos bioqumicos como
un producto de funciones exponenciales. Matemticamente
este tipo de representacin se apoya en el teorema de Taylor,
que permite la aproximacin de funciones con polinomios
(Cascales & Inmaculada, 2008).
Las caractersticas numricas de la aproximacin dependen del
punto de operacin. Porejemplo, el orden cintico en el caso de
la ecuacin de Michaelis-Menten disminuye desde 1 a 0 si se
elige un punto de operacin con concentracin ms alta de
sustrato. En particular, para el caso en que X0 = KM el orden
cintico es 0.5.Una caracterstica fundamental de esta
aproximacin es que se puede generalizar a cualquier caso sin
importar el nmero de elementos (Cascales & Inmaculada,
2008).
Ocurre que, mientras que los valores numricos de los rdenes
cinticos y de las constantes de velocidad cambian con el punto
de operacin elegido, la estructura de la aproximacin es
siempre la misma. Este hecho implica que es posible construir
un modelo sustentado en esta representacin simblicamente,
sin necesidad de conocer la estructura exacta del proceso, como
es el caso del estudio con los mtodos implicados en
resultados, observando que la actividad enzimtica se
encuentra en el rango de lo ptimo con una actividad
observable (Aguirre, 2010).
IV. CONCLUSIONES
Al realizar el mtodo modificado de Kunitz, se determin que
a unatemperatura constante de 400C, la enzima libre e
inmovilizadapresentaban casi las mismas caractersticas de
actividad proteoltica,indicando as que el inmovilizado en gel
no afecta en gran medida su actividad. La enzima Papana
present una mayor actividad a un pH =6.0, por lo tanto se
trabaj a este pH ya que presenta un 100% de actividad
proteoltica. A un pH constante de 6.0, la temperatura a la que
la enzima Papanapresenta un 100% de actividad proteoltica es
de 60C. Debido a que la enzima Papana presenta una mayor
actividad a una temperatura de 60C, podemos decir que la
ezima muestra gran estabilidad al exponerla a altas
temperaturas, aunque tambin es estable a temperatura
ambiente. El ensayo de actividad proteolitica de la enzima
Papana se realiz a temperatura ambiente y no a la
temperatura ptima de 60C debido a que no contbamos con
un equipo adecuado que nos garantizara tener esa temperatura
durante el ensayo. Se determin realizar el ensayo de actividad
de la enzima con el proceso semicontinuo, debido a que se
invierte un menor tiempo para la hidrlisis de las protenas y se
obtiene el mismo resultado que si estuviera en contacto durante
24 horas. Para determinar la cantidad de protenas presentes en
una muestra, se utiliz el mtodo de turbidez por protena, en el
cual se lee la absorbancia de la muestra a una longitud de onda
de 610 nm. El tiempo de actividad de la enzima Papana
inmovilizada con la muestra de la Industria de Embutidos fue
menor, debido a que se realiz lavados con agua estril despus
de cada tratamiento porque quedaban trazas en la columna que
podan alterar al tratamiento siguiente, y debido a que la
enzima es soluble en agua, con cada lavado se perda una
cantidad de enzima inmovilizada.
V. REFERENCIAS
Aguirre, A. (2010). Extraccin y estudio comparativo de las enzimas
protelticas. Escuela Superiro Politcnica Litoral. Recuperado a
partir de
https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/7532/1/Extra
ccion%20y%20Estudio%20Comparativo%20de%20las%20Enzima
s%20Proteol%C3%ADticas.pdf
Cascales, R., & Inmaculada, M. (2008, mayo 23). Extraccin de compuestos
fenlicos de la uva al vino. Papel de los enzimas de maceracin
(Ph.D. Thesis). Universidad de Murcia. Recuperado a partir de
http://www.tdx.cat/handle/10803/11064
Gutirrez, A., & Cruz, C. S. (2017). ACTIVIDAD DE PAPANA DEL
LTEX DE VASCONCELLEA CANDICANS (A. GRAY) A. DC
1864 MITO Y ANLISIS BIOMTRICO DEL FRUTO. The
Biologist, 14(2). https://doi.org/10.24039/rtb2016142108
Industrial, L. D. B. (2010, domingo, de agosto de). Extraccin y purificacin
de papaina obtenida a partir de carica papaya. Recuperado a partir
de
http://biotecnologia1tecnoparque.blogspot.com/2010/08/extraccion-
y-purificacion-de-papaina.html
Marcial, V., & Cristina, M. (2011). Extraccin, concentracin y cuantificacin

de la actividad enzimtica de la papana a partir de la papaya (carica

papaya). Recuperado a partir de

http://repositorio.uta.edu.ec/jspui/handle/123456789/5226

Meja Aguilar, R. B., & Vega Rmos, C. X. (2010, abril). Medicin de la

actividad proteoltica de la enzima papaina natural extrada del

latex de papayo (carica papaya) e inmovilizada en gel de agar

(bachelor). Universidad de El Salvador. Recuperado a partir de

http://ri.ues.edu.sv/2516/

Quino Favero, J., Bernal Portilla, N., & Ycono Llanos, J. C. (2008). Diseo de

un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada.

Ingeniera Industrial, (26). Recuperado a partir de

http://www.redalyc.org/resumen.oa?id=337428492011

Quino Favero, J. M., Ycono Llanos, J. C., & Zelada Chvez, M. (2010).

Purificacin de papana a partir de ltex seco: Un estudio piloto.

Ingeniera Industrial, (28). Recuperado a partir de

http://www.redalyc.org/resumen.oa?id=337428494011

Yugcha, A. (2010). Estudio del proceso de secado de Ltex de Papaya,

deshidratado por Aspercin. Escuela Superiro Politcnica Litoral.

Recuperado a partir de

https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/24551/1/Est

udio%20del%20procedo%20de%20secado%20de%20l%C3%A1tex

%20de%20papaya%20deshidratado.pdf