ESCUELA DE BIOLOGA, FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMTICA

UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR
ESCUELA DE BIOLOGIA
CATEDRA DE BIOQUIMICA /CICLO II 2016
LIC. MIGUEL MORENO
BR. SERGIO VSQUEZ
BR. ROBERTO NAVARRO

PRCTICA N 6
EVIDENCIA DE ACTIVIDAD FOTOSINTETICA (Reaccin de Hill) AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Y
CUANTIFICACION DE PIGMETOS FOTOSINTETICOS (por espectrofotometra).
Introduccin
La fotosntesis se define como dos conjuntos de reacciones. Al inicio del proceso se da la oxidacin del agua hasta O2 (fotolisis del agua)
con la consecuente transferencia de electrones que son acarreados hasta el NADP al tiempo que se genera ATP. En un segundo momento se
da la reduccin del carbono inorgnico (CO2 ) en carbono orgnico (CH2 O). La primera etapa, como puede observarse es dependiente de la
luz (fase clara), mientras que la segunda no (fase oscura), conocida como ciclo de Calvin.
En este sentido, los organismos capaces oxidar el agua hasta O2 y reducir el CO2 hasta azucares (elaborar sus propios nutrientes orgnicos
a partir de los tipos de molculas ms simples como el CO2 como fuente principal de carbono) se denominan auttrofos. La elaboracin de
molculas complejas a partir del CO2 requiere el ingreso de grandes cantidades de energa. En el curso de la evolucin se desarrollaron dos
tipos principales de auttrofos que pueden distinguirse por su fuente de energa. Los quimioauttrofos (quimiosintticos) que utilizan
energa almacenada en molculas inorgnicas (amonio, sulfuro de hidrogeno o nitritos) para reducir el CO2 (todas son bacterias) y los
auttrofos (fotosintticos) que emplean la energa radiante del sol para el mismo propsito (incluyen plantas evolutivamente organizadas,
algas, varios protistas flagelados, bacterias prpuras azufradas y no azufradas, bacterias verdes y cianobacterias). La fotosntesis es un
proceso en el cual los electrones de energa relativamente bajas son transferidos de un compuesto donador y convertidos en electrones de
alta energa como resultado de la absorcin de la luz. Estos electrones de alta energa se utilizan en la fotosntesis para reducir el CO2 en
C(H2 O)n hidratos de carbono o carbohidratos.
Es probable que los primeros grupos de fotoauttrofos que aparecieron en la tierra utilizaron H2S (sulfuro de hidrgeno) como fuente
de electrones para realizar la fotosntesis.
Luz
CO2 + 2H2S -------------------------> (CH2 O) +H2 O +2S (anoxignica)

Posteriormente apareci un Nuevo tipo de procarionte fotosinttico capaz de utilizar una fuente ms abundante de electrones, es decir,
el agua.
Luz
CO2 + H2 O -------------------------> (CH2 O) +O2 (oxignica)

La fotosntesis comparte muchas caractersticas con la respiracin aerobia, incluyendo un sistema de transporte de electrones que
consta de citocromos, quinonas y protenas de hierro y azufre, el establecimiento de un gradiente electroqumico de protones y el
empleo de este gradiente para efectuar la sntesis de ATP a travs de una ATP sintasa homologa a la observada en la mitocondria.
Para evidenciar la fase clara de la fotosntesis en 1939 Robin Hill diseo un experimento con una suspensin de cloroplastos aislados y
not que estos puede desprender O2 en presencia de luz, por lo tanto si se suministra un compuesto oxidado capaz de aceptar electrones
procedentes de la fotolisis del agua se podra evidenciar este flujo electrnico. La Reaccin de Hill bsicamente evidencia que en la hoja
intacta, los principales aceptores naturales de electrones son la ferredoxina y el NADP, estos inactivan durante el proceso de
aislamiento de los cloroplastos. in vitro, estos aceptores naturales pueden sustituirse por el 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP). Este
compuesto es oscuro en forma oxidada (quinona) pero se decolora lentamente cuando se reduce (fenol). La reaccin que tiene lugar
es la siguiente:
Luz
DCPIP(oscuro) + H2 O---------------------- DCPIP-H ( plido) + O2
H2O + DCPIP DCPIP (reducido) + O2 en presencia de luz y de PSII

Cuantificacin de pigmentos fotosintticos: un pigmento es cualquier sustancia que absorbe luz, el color de un pigmento es el
resultado de la longitud de onda reflejada (no absorbida). En los organismos fotosintticos estos muy importantes ya que determina la
capacidad de absorcin de energa para ponerla a disposicin y realizar sus actividades metablicas. Cuando una molcula de clorofila
capta un fotn de luz, un electrn pasa de su estado basal a otro excitado, de mayor nivel energtico. Este estado excitado de la clorofila
es estable por muy poco tiempo e inmediatamente pueden suceder una de estas tres transiciones: transferir la energa a otra molcula
de clorofila y as sucesivamente hasta que se alcanza el centro de reaccin del fotosistema correspondiente (PSI o PSII) y el electrn
pueda ser utilizado en el proceso fotoqumico, retornar a su nivel bsico emitiendo la energa en forma de calor y no emitiendo ningn
tipo de fotn, o en lugar de volver a su estado bsico emitiendo calor emitir un fotn de mayor longitud de onda que la absorbida en un
proceso que se conoce como fluorescencia. Cualquiera de estas tres transiciones tiene como consecuencia la disipacin de la energa
absorbida. La mayor parte de la fluorescencia que es emitida por la clorofila proviene de la clorofila a del PSII. La cantidad de
fluorescencia emitida es una forma de medida de la eficiencia de la transferencia de los electrones; sta incrementa si la transferencia
o el proceso fotoqumico est limitado por algn factor, existen distintos tipos de pigmentos muy importante como la a clorofila que
bsicamente es una molcula compleja, formada por cuatro anillos pirrlicos, un tomo de magnesio y una cadena de fitol larga
(C20H39OH) los pigmentos fotosintticos se encuentran en los cloroplastos lugar donde se realiza la sntesis de ATP, para evaluar
cuantitativamente se utilizan diversos mtodos de extraccin que se basan en la diferencia de solubilidad, la clorofila no es soluble en
agua solo en solventes orgnicos como alcohol etlico y acetona y pueden haber variantes como la aplicacin de temperatura o la
separacin por medios mecnicos. La manera en que se cuantifica es por espectrofotometra de absorcin esta tecnica usualmente
usada con molculas disueltas en un solvente transparente. La absorbancia o densidad ptica (OD) de un soluto depende linealmente de
la concentracin y por consiguiente la espectrofotometra de absorcin es ideal para hacer mediciones de este tipo.

Objetivos
1. Evidenciar la actividad fotosinttica en una solucin de cloroplastos aislados atreves de la Reaccin de Hill
2. Determinar la actividad fotoqumica de los cloroplastos en presencia o ausencia de luz.
3. Extraer los de pigmentos de cloroplastos por dos protocolos y cuantificar clorofilas totales por medio de mediciones de
densidad ptica
MATERIALES Y EQUIPO

MATERIALES Y REACTIVOS EQUIPO APORTE DE ESTUDIANTES

Soluciones de sucrosa 0.5M -Centrifuga *Hojas sanas de espinacas mantenidas (de

Solucin amortiguadora - Espectrofotmetro preferencia mantenidas en la oscuridad)
de cloroplastos: (Ver componentes al final) Longitudes de onda: *2 cubetas de lectura para
Propilenglicol 10% 520nm espectrofotmetro
Acetona 80% 645nm * 2 Gasas
Etanol 80% 630nm *Papel aluminio
Morteros y pistilos refrigerados -Lampara * Tijeras
Tubos de ensayo * Hielo en cubitos
Embudo de vidrio * cubeta o bandeja profunda
Solucin de 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP) * trozo de papel de aluminio
Gradillas * bistur
Papel parafilm * tirro
* papel toalla
*guantes y gabacha

Soluciones a preparar
10 ml de solucin de sacarosa 0.5 M
10ml de 2,6 diclorofenolindofenol DCPIP
6ml de propilenglicol
12 ml de etanol 80%
12 ml de acetona 80%
40 ml de solucin amortiguadora de cloroplastos
** Preparacin de 500 ml de Solucin amortiguadora de cloroplastos:
- EDTA: 9.25 g
- TRIS BASE: 0.6 g
- SACAROSA: 20 g
- pH 7.4

PROCEDIMIENTO

I. ACTIVIDAD FOTOSINTETICA
Aislamiento de cloroplastos.
1. Pesar 6 g de hojas de espinaca previamente desnervada y lavadas dos veces con agua destilada fra. Cortar las hojas en
pequeos trozos y macerar en un mortero agregar 2ml de sacarosa 0.5 M e ir completando paulatinamente hasta 10 ml con
la misma solucin. (procesar en cadena de frio).
2. Filtrar con gasa obtenido y recogerlo sobre un tubo de centrfuga.
3. Centrifugar el filtrado durante 10 min a 1000 r.p.m. (5)
4. Traslade el sobrenadante a otro tubo volver a centrifugar 10 min a 2500 r.p.m. (7)
5. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene los cloroplastos aislados en 6 ml de propilenglicol al
10% agitando con una varilla o un pincel.
6. Cubra el tubo con papel aluminio.

Reaccin de Hill.
1. Preparar 2 tubos de ensayo siguiendo el esquema que a continuacin se expone. (rotule cada tubo)
N de Sol
Agua destilada Cloroplastos Indicador Condicin
tubo amortiguadora
1 1.5 4 1 0.5 OSCURAS
2 1.5 4 1 0.5 LUZ
**Tratar de hacerlo ms rpido posible y cubra ambos tubos con papel aluminio.

2. TUBO 1: Tome 1ml y colquelo en una cubeta de espectroscopia y cbrala o colquela en un lugar donde no penetre la luz.
3. TUBO 2: Tome 1ml y colquelo en la cubeta de espectroscopia colquelo frete a la lmpara
4. Medir con el espectrofotmetro a una longitud de onda de 520nm (absorbancia y tramitancia)
5. Realice para cada tuvo una medicin inicial, y luego realice otras 4 con intervalo de 5 minutos

Tubos 1
Tiempo 0 15min 10min 20min 25min
Absorbancia
Tramitancia
Tubos 2
Tiempo 0 15min 10min 20min 25min
 Absorbancia
Tramitancia
**Grafique los resultados y compare.

II. CUANTIFICACION DE PIGMETOS FOTOSINTETICOS

2.1. Extraccin de pigmentos:

PROTOCOLO 1: (Extraccin con ACETONA)

1. Pesar 0.5 g de hojas frescas de espinacas o de cualquier otro material verde
2. Macere el material vegetal en un mortero con 5 ml de acetona al 80% (agregar gradualmete y dejar una ltima parte para
lavar residuos en el pistilo),
3. Cuando la acetona este de color verde colquela en un tubo de centrfuga de plstico y se centrfuga a 2000 rpm durante 10
minutos (7).
4. Despus de centrifugar se obtiene un sobrenadante verde que contiene los pigmentos.
5. Ajustar el volumen final a 6 ml con acetona al 80%.

PROTOCOLO 2: (Extraccin con ETANOL)

1. Pesar 0.5 g de hojas frescas de espinacas o de cualquier otro material verde
2. Cortar las hojas en segmentos de aproximadamente 0.5 cm introducir en un tubo de ensayo
3. Agregar al tubo 6 ml de etanol al 80% de modo que los segmentos queden bien sumergidos.
4. Incubar durante 20 minutos en un bao a 80 para que las clorofilas salgan al exterior y se disuelvan en el etanol. (Al cabo
de este tiempo los segmentos debern quedar parcialmente decolorados y el etanol queda de color verde.

2.2. Cuantificacin de clorofila:

1. Se toman 0.5 ml del sobrenadante de cada uno de los extractos y se diluye hasta 5 ml con acetona al 80% en la extraccin
con acetona (protocolo 1) y con etanol al 80% en la extraccin con etanol (protocolo 2).
2. Despus se mide en un espectrofotmetro a longitudes de onda de 645 y 663 nm.
3. Tome como blanco el solvente respectivo para cada protocolo.

protocolo 1 protocolo 2
Longitud de onda 645nm 663nm Longitud de onda 645nm 663nm
Absorbancia (DO) Absorbancia (DO)

4. Introducir los valores de la densidad ptica en la formula parara Clorofila Total (Para cada uno de los protocolos de
extraccin) y compare los resultados

Clorofila total (g/ml o mg/l) = (20.2 DO645) + (8.02 DO663)

CUESTIONARIO

Qu es la fotosntesis?
Qu son reacciones dependientes de la luz y no dependientes de la luz
Cul es el papel de los cloroplastos en la fotosntesis?
Cul es el papel del colorante 2,6 diclorofenolindofenol?
Cmo se podra cuantificar otro tipo de pigmentos extracto?

BIBLIOGRAFIA

Marlene Toledo 2012 Diseo y aplicacin de una prctica de fotosntesis para estudiantes de biologa celular del IPC-UPEL
Revista de Investigacin N 76 Vol. 36.
Prcticas de Fisiologa Vegetal. Laboratorio de docencia de Fisiologa Vegetal Departamento de Biologa Vegetal