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DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

I. OBJETIVO:
- Determinar l actividad enzimtica de una amilasa extrada de trigo
germinado, usando almidn residual
- Determinar la actividad especfica de la amilasa vegetal.

II. MARCO TEORICO:


Las enzimas son catalizadores orgnicos que disminuyen la energa de
activacin de las reacciones metablicas, por lo que aumentan la velocidad, y
permiten que se produzcan a temperaturas y presiones a las que
normalmente no tendran lugar. En una curva de saturacin de una reaccin
enzimtica, al inicio, la velocidad permanece constante denominndose
velocidad inicial (Vo), la cual va disminuyendo hasta llegar a un plateau que
da a conocer una saturacin de la enzima por el sustrato.
AMILASA:
Cataliza la hidrlisis al azar los enlaces -1,4 glucosidicos de la regin central
de la cadena de amilosa y amilopeptina, exceptuando las molculas cercanas
a la ramificacin, obteniendo como resultado maltosa y oligosacridos de
varios tamaos. La actividad de la enzima se determina cualitativamente
mediante la disminucin de la capacidad de la solucin de almidn para
formar el color azul caractersticos con el yodo o midiendo la disminucin de
la viscosidad de la suspensin de almidn.
La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la
ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores
(endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce
como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina,
acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa.

ALMIDON DE CEBADA:
El almidn es un polmero semicristalino de glucosa de gran abundancia en la
naturaleza. La cantidad de almidn contenido en el grano de cereal varia, pero
generalmente oscila entre el 60 y 75 % del peso del grano. El almidn presente
en los granos es el ms importante de los carbohidratos para fines industriales
resultando preciso degradarlo enzimticamente con una gelatinizacin previa 1
por accin de calor o sometindolo a un intenso trabajo mecnico. El almidn
consta de dos fracciones: amilosa y amilopectina.
III. MATERIALES:
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Equipos:

- Estufa
- Espectrofotmetro

Materiales y reactivo:

- Germinados: trigo y cebada


- Solucin de almidn 0.1%
- cido clorhdrico 0.5N
- Lugol
- Reactivo de Biuret
- Tubos de ensayo
- Embudos
- Mortero
- Pipetas de 1,5,10 ml

IV. PROCEDIMIENTO:
- Extraccin de la amilasa:

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Germinar 50 semillas de trigo Triturar las semillas,


y cebada por 3 dias. adicionando 10 ml de buffer
+ cloruro de calcio
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Filtrar en gasa o algodn.

- Demostracin de la actividad enzimtica: armar el siguiente sistema.

ALMIDON
ALMIDON RESIDUAL
TUBOS (ml) INICIAL
I II III IV
SUSTRATO 1.0 1.0 1.0 1.0
Incubar: 30C 5 min.
EXTRACTO DE ENZIMA --- 0.1 0.2 0.3
Incubar: 30C 15 min.
ACIDO CLORHIDRICO 0.5N 1.0 1.0 1.0 1.0
Reposar: T. ambiente 5 min.
AGUA DESTILADA 9.9 9.8 9.7 9.6
LUGOL 0.5 0.5 0.5 0.5

Medir las absorbancias despus de 5 min a 6.20nm

- Determinacin de la actividad especfica:


Determinar el contenido proteico del extracto crudo de la enzima con el
reactivo de Biuret de acuerdo al siguiente esquema:

TUBO (ml) I II III IV


Preparado enzimtico --- 0.2 0.1 0.05
Agua destilada 1.0 0.8 0.9 0.95
Reactivo de Biuret 4.0 4.0 4.0 4.0

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Mezclar e incubar por 30 min a 37C.

V. CALCULOS Y RESULTADOS:

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- Determinacin de la actividad enzimtica:

ABSORVANCIA
N TUBO
TRIGO CEBADA
I 0.872 0.063
II 0.526 1.197
III 1.860 1.587
IV 3.054 2.792

CALCULO: Determinar la concentracin del almidn (mg/ml) multiplicando

Concentracin (mg/ml)
N TUBO
TRIGO CEBADA
I 8.72 0.63
II 5.26 11.97
III 18.60 15.87
IV 30.54 27.92
Promedio 18.13 18.59
la absorbancia por el factor de calibracin. Obtener el promedio

Unidad enzimtica (mg/min)


N TUBO
TRIGO CEBADA
I 0.5810 0.0420
II 0.3507 0.7980
III 1.2400 1.0580
IV 2.0360 1.8613
PROMEDIO 1.2089 1.2391

CALCULO: Calcular Las Unidades De Enzima (U) De La Siguiente Forma.

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CALCULO: Determinar mg de protena /ml = absorbancia x factor

ACTIVIDAD ENZIMATICA
N TUBO
TRIGO CEBADA
I 0.06662844 0.06666667
II 0.066673 0.06666667
III 0.06666667 0.06666667
IV 0.06666667 0.06666547

CALCULO: determinar la actividad especfica de la siguiente manera.

- ELABORA UN DIAGRAMA DE FLUJO DE LA OBTENCION DE LA AMILASA

50 Semillas de trigo TRIRUTAR (Mortero)

Buffer: 10 ml
Cloruro de Calcio AGREGARProtena (mg/ml)
N TUBO
TRIGO CEBADA
I 8.72 0.63
Buffer:
II 10 ml 5.26 11.97
FILTRAR (Embudo 5
CloruroIIIde Calcio 18.60 15.87 + gasa)
IV 30.54 27.92
Promedio 18.13 18.59

AMILASA
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VI. DISCUSION:

(Almonte, 2010) La alfa-Amilasa se encuentra ampliamente distribuida en el


reino vegetal, particularmente en la semillas con reservas de hidratos de
carbono como el trigo, la cebada, de donde ha sido posible aislarla en forma
pura. Su peso molecular es alrededor de 60.000, esta se secreta al
endospermo amilceo de las semillas de cereales por dos tejidos, el cotiledn
y la capa de aleurona, degradando las macromolculas de amilosa y
amilopectina en pequeos fragmentos de 6 a 7 unidades de glucosa.

(Barbado, 2001) La amilosa se colorea de azul en presencia de yodo, debido a


la absorcin o fijacin del yodo en la superficie de la molcula de amilosa, lo
cual solo ocurre en frio. Es conveniente aclarar que este proceso no es una
reaccin qumica, ya que no se producen sustancias nuevas, como reactivo
para identificar el almidn se usa una solucin denominad lugol.

(Lopez, 2006) La prueba del Lugol se realiza para identificar la presencia de


polisacridos, si despus de aadir los digeridos a los tubos de lugol se
observa que tiene un color azul ,eso significa que hay presencia de almidn
por lo tanto la reaccin no tuvo lugar, por otro lado si la reaccin da un color
amarillo intenso, eso quiere decir que no hay presencia de almidn por lo
tanto, hay si tuvo lugar la actividad de la enzima.

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(Foster,1998)La amilasa es una de las enzimas mas estudiadas debido a su rol
de degradacin del almidn, ya que permite una germinacin de las semillas,
el cual es degradado por los enlaces 1-4 del interior (endoamilasa) en

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diferentes dextrinas, que debido a su disminucin en tamao puede ser


hidrolizada por la B-amilasa, sin embargo la -amilasa es una enzima que se
encuentra regulada tanto por hormonas, o diferentes factores, tales como la
temperatura y el pH, adems posee un peso molecular de 50 Kda
aproximadamente .La germinacin se lleva con la hidratacin y posterior
liberacin de giberelinas, las cuales inducen la sntesis de las enzimas
hidrolticas, que hidrolizan el almidn que se encuentra el endosperma,
produciendo glucosa que es transportada por difusin, para generar energa.

VII. CONCLUSIONES:

Logramos determinar la actividad enzimtica


en las dos experiencias realizadas con
semillas germinadas de trigo y cebada, en los
cuatro tubos pudimos notar la formacin de
anillos y tambin la formacin de precipitado
en pequeas y grandes cantidades.

Identificamos y obtuvimos de los ndices de


absorbancia con la ayuda del espectrofotmetro en el caso del trigo fueron de
0.872; 1.860 entre otros y en el caso de la cebada fueron de 0.063; 1.587, estos
datos nos indican un comportamiento similar de la actividad enzimtica en
ambas semillas.

Logramos determinar la actividad especfica del preparado enzimtico del trigo,


y esto lo pudimos notarlo por la formacin de anillos de color anaranjado oscuro
y de color azul fuerte que se presento en el primer tubo.

Aprendimos el procedimiento que se debe utilizar para extraer la amilasa de


vegetales, en nuestro caso fue con las semillas de trigo y cebada, donde
utilizamos las races de las semillas adicionadas con reactivos que permitieron
obtener el preparado enzimtico para trabajar.

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VIII. CUESTIONARIO:

CUESTIONARIO
1.- En la sntesis de arginina a partir de acido glutmico se observaron las
siguientes reacciones

1 2 3 4
Glu ------ N ac. Glu ------ Orn ------ Cit ------ Arg

Siendo 1, 2, 3,4 enzimas

Indica cuales son los sustratos y productos correspondientes para estas enzimas
mediante un cuadro.

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2.-Por que se sometieron las raicillas del cereal a un proceso fsico y qumico en el
proceso de extraccin?

El proceso de extraccin se basa en la


obtencin de amilasa, por lo que es
necesario que las raicillas de los cereales
sufran un proceso fsico donde se van a
fragmentar en pedazos ms pequeos con la
ayuda de un mortero pero aun as siguen
conservando su naturaleza, luego se da el
proceso qumico donde se va a filtrar la
parte liquida que seria la amilasa de las
semillas con la ayuda de una gasa ,luego a este extracto se le van agregando una
seria de reactivos lo cual permitirn transformarla en un preparado enzimtico para
posteriormente utilizarla en diferentes pruebas.

3.- Si se te da una solucin que supuestamente contiene una enzima, Cmo


determinaras en la solucin la presencia de una enzima que cataliza la hidrolisis
de almidn?

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Para determinar la presencia de una enzima en una solucin y a la vez observar que
cataliza la hidrolisis de almidn solo se podra lograr a travs de una va ,la cual
consiste en agregar reactivos que permitan evidenciar tal presencia como es el caso
del lugol , adems porque mientras el color
de la mezcla sea mas intenso significa que
la actividad enzimtica que ejerce la
amilasa sobre el almidn ser un poco mas
baja , adems tambin la podemos notar ya
que en la solucin se va a observar la
formacin de anillos en la parte superior de
dicho liquido o sustancia.

4.- Represente mediante un flujograma el proceso de extraccin de una amilasa de una


fuente diferente a la utilizada en prctica.

RACES DE YUCA

Agua LAVADO Cascarilla

RALLADO

10
Agua TAMIZADO Afrecho

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SEDIMENTACION Mancha de agua
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5.- Como se puede incrementar la actividad especfica de una enzima?

La actividad especfica de las enzimas se calcula


dividiendo la actividad enzimtica (por ejemplo;
U/mL) entre la concentracin de protenas
(mg/mL). El resultado final indica la cantidad de
enzima por milgramos de protenas presente. Se
supone que si purificas la enzima normalmente
la actividad especfica de la misma debe
aumentar, ya que la proporcin de enzima del
total de las protenas presentes debe tambin
irse incrementando. A veces esto no ocurre. En
ese caso debe revisar el procedimiento otra vez ya que algo puede estar saliendo
mal. Por ejemplo que se desnaturalice la enzima en el proceso de purificacin por 11
empleo de algn solvente o pH o fuerza inica inadecuada. Tambin debe tener en

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cuenta si la protena en milimtrica, ya que la prdida de una subunidad puede


reducir significativamente su actividad.

IX. BIBLIOGRAFIA:
Foster, N; Burchett, L and Paulsen, Bioquimica,Editorial Reverte,
Espana,G. 1998.
Benech-Arnold, R. and Sanchez,Biologia de las Plantas,Primera
Edicion,Editorial Bermejo . 2004.
Almonte.Carlos,Manual de Quimica Organica,Quinta Edicion, 2010.
Barabado.Oscar,Microbiologia Alimentaria,Tercera Edicion,2001.

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