UNIVERSIDAD DE LAS

FUERZAS ARMADAS ESPE

Analisis de la viabilidad de
Saccharomyces cerevisiae empleada en
la fermentacion de cerveza en la empresa
Quinde Brewery Co. mediante pruebas
microbiologicas y fsico-qumicas para su
reutilizacion en nuevos procesos
fermentativos.

Autores: Tutores:
Yanara Naranjo Lcda. Silvana Granda
Carlos Caiza Ing. Marco Taipe

Departamento de Ciencias de la Vida

Carrera de Ingeniera en Biotecnologa

Sangolqu-Ecuador
Diciembre, 2014.
Indice general

Resumen IV

1. Introduccion 1

1.1. Ttulo del Protecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2. Definicion y justificacion del proyecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.3. Objeto de Estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.4. Campo de accion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.5. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.5.1. General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.5.2. Especficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.6. Hipotesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2. Marco Teorico 4

2.1. Levaduras cerveceras: Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.2. Recuperacion de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.3. Saccharomyces: dos grupos, dos estilos de cerveza . . . . . . . . . . . . . . 5

2.4. Fermentacion alcoholica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.5. Elaboracion de lotes de cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.5.1. Maceracion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.5.2. Filtrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

i
Contenidos ii

2.5.3. Lavado del grano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5.4. Hervido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5.5. Enfriado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5.6. Fermentacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5.7. Envasado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

3. Metodologa 9

3.1. Recoleccion de muestras de Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . 9

3.2. Recuperacion de colonias puras de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . 9

3.2.1. Tincion Gram: Identificacion morfologica . . . . . . . . . . . . . . 9

3.2.2. Aislamiento y purificacion de colonias . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.2.3. Siembra mediante diluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.3. Preparacion de medios de cultivo mnimos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.4. Inoculacion y crecimiento en medios de cultivo mnimos . . . . . . . . . . 11

3.4.1. Medio Solido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.4.2. Medio Lquido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.5. Recuento bacteriano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.5.1. Conteo en Camara de Neubauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.6. Estimacion de la viabilidad de celulas de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . 12

3.7. Elaboracion de lotes de cerveza con S. cerevisiae recuperadas . . . . . . . 12

3.8. Medicion de la densidad y pH de la cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.9. Estimacion de contenido de etanol en la cerveza . . . . . . . . . . . . . . . 13

4. Resultados y Discusion 14

4.1. Recuperacion y aislamiento de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4.2. Conteo celular en Camara de Neubauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.3. Viabilidad celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Contenidos iii

4.4. Analisis Fsico-Qumicos de Cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.4.1. Analisis de grados Brix en cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.4.2. Analisis de pH en cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.4.3. Analisis del contenido de alcohol en cerveza . . . . . . . . . . . . . 21

5. Conclusiones y recomendaciones 22
Resumen

Este proyecto presento el analisis y factibilidad para la reutilizacion de S. cerevisiae

recuperadas de los tanques fermentadores en la microcervecera Quinde Brewery Co.
ubicada en la parroquia de Conocoto, as como la evaluacion de la calidad de la cerveza
elaborada con estas hasta el tercer proceso de fermentacion.

S. cerevisiae se recolectaron de muestras lquidas que fueron debidamente almacenadas y

dirigidas al Laboratorio de Docencia de la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa donde
se las trato y analizo debidamente de acuerdo a protocolos estandarizados.

El primer paso en laboratorio fue la purificacion de las cepas de S. cerevisiae presentes

en todas las muestras recolectadas, para ello se utilizo medios selectivos para hongos y
levaduras; luego se procedio a la formulacion de medios de cultivo mnimos, tanto lquido
como solido. En dichos medios se inoculo las colonias puras y se incubo los cultivos por
siete das a temperatura ambiente (17 2 o C). Al cabo de los siete das de incubacion
los cultivos en medio solido sirvieron para la determinacion de la morfologa de Sac-
charomyces cerevisiae, mientras que los cultivos en medio lquido se utilizaron para la
cuantificacion del numero de celulas totales y el numero de celulas viables, posterior a
esto, el medio lquido inoculado, tambien fue utilizado para la realizacion de un nuevo
proceso de fermentacion en la microcervecera Quinde Brewery Co. Una vez que se con-
cluyo la etapa, nuevamente se procedio a tomar las muestras y repetir el proceso.

Al cabo de seis semanas de trabajo tanto en la planta cervecera como en el laboratorio

se obtuvo tres generaciones de levaduras recuperadas y tres lotes de cervezas elaboradas
con estas. A cada lote de cerveza se le realizaron pruebas fsico-qumicas para evaluar la
calidad del producto obtenido y se encontraron resultados positivos.

iv
Resumen v

Para la cuantificacion celular de cada generacion se demostro un 95.3 %, 91.4 % y 82.3 %

de celulas viables para la primera, segunda y tercera generacion de S. cerevisiae respec-
tivamente, datos que estan en el rango aceptable para levaduras recuperadas. Por otro
lado se concluyo que al cabo de siete das de incubacion el numero total de celulas de S.
cerevisiae, en promedio, fue del 20,8 millones, 12 millones y 8,33 millones de celulas por
mililitro de medio lquido en cada generacion; respecto a las pruebas fsicas y qumicas se
obtuvo que la densidad final de la cerveza expresada en grados Brix fueron de 6.2, 5.7 y
5.3 o Brix en la tercera, segunda y primera generacion, los valores de pH medios obtenidos
fueron de 4.3, 4,5 y 4.8 para la primera, segunda y tercera generacion y finalmente los
valores medios del contenido de alcohol para la primera, segunda y tercera generacion
fueron 5.2, 4.6 y 4.2 ABV respectivamente. Todos los valores obtenidos estan en el rango
permitido segun la normas para cerveza; por lo que se concluyo que la reutilizacion de
S. cerevisiae recuperadas de los tanques de fermentacion es una medida factible y viable
en una cervecera.
Captulo 1

Introduccion

1.1. Ttulo del Protecto

Analisis de la viabilidad de Saccharomyces cerevisiae empleada en la fermentacion de

cerveza en la empresa Quinde Brewery Co. mediante pruebas microbiologicas y fsico-
qumicas para su reutilizacion en nuevos procesos fermentativos.

1.2. Definicion y justificacion del proyecto

El uso de Saccharomyces cerevisiae en la produccion de cerveza se ha dado desde hace

varios miles de anos y hoy en da esta bebida alcoholica de moderacion es una de las
mas consumidas mundialmente. El desarrollo tecnologico ha permitido que en el ultimo
siglo se creen pequenas empresas, denominadas microcerveceras, encargadas de elabo-
rar cervezas de alta calidad pero a una escala mucho menor que las grandes cerveceras
industriales. En Ecuador, desde hace ya 25 anos, se han creado varias microcerveceras
las cuales ofrecen al mercado una amplia variedad de cervezas y, en los ultimos cinco
anos se ha experimentado un acelerado aumento de las mismas.

La recuperacion y reutilizacion de levaduras luego de varios procesos de fermentacion

es una practica que se ha implementado en la mayor parte de las grandes cerveceras a
nivel mundial y en una menor proporcion en las microcerveceras. En Ecuador existe una
compana multinacional, Cervecera Nacional, que produce el 98 % de cerveza consumida
(cerca de 300 millones de litros anuales, pero la produccion neta es de 450 millones de
litros por ano) y poco mas de 45 microcerveceras que generan aproximadamente 8 mi-
llones de litros al ano, la gran empresa multinacional tiene un programa de recuperacion

1
Introduccion 2

y reutilizacion de levaduras con lo cual puede ahorrar cerca de 45 millones de dolares

anuales mientras que las pequenas empresas no cuentan con este tipo de programas. El
proceso de recuperacion de levaduras es simple y representa un ahorro de diez centavos
por cada dolar de inversion para la elaboracion de cerveza, lo que genera una conside-
rable cantidad de dinero que podra ser destinado para otros procesos en las empresas
y, tambien se disminuye la produccion de desechos lquidos [?, ?, ?].

Segun varios autores, una compana cervecera puede reutilizar levaduras hasta por ocho
etapas de fermentacion siempre que se mantenga procesos muy bien controlados y el
almacenamiento de levaduras sea adecuado [?, ?].

Debido al aumento del consumo de cervezas de mejor calidad, es decir, cervezas elabo-
radas por microcerveceras; y en funcion del cambio de la Matriz Productiva Nacional
se ha pensado crear un protocolo para que estas pequenas empresas puedan aprovechar
levaduras recuperadas y utilizarlas en futuros procesos de fermentacion.

1.3. Objeto de Estudio

Saccharomyces cerevisiae empleadas en el proceso de fermentacion alcoholica en una

cervecera local.

1.4. Campo de accion

El proyecto se oriento en primera instancia al area microbiologica donde se desarrollo la

purificacion, conteo celular y analisis de la viabilidad de las celulas de levaduras recupe-
radas para posteriormente dirigirlo al area industrial cuando se optimizo el proceso de
fermentacion al reutilizar las levaduras recuperadas de procesos anteriores.

1.5. Objetivos

1.5.1. General

Analizar la viabilidad de Saccharomyces cerevisiae empleada en la fermentacion de cerve-

za en la empresa Quinde Brewery Co. mediante pruebas microbiologicas y fsico-qumicas
para su reutilizacion en nuevos procesos fermentativos.
Introduccion 3

1.5.2. Especficos

Recuperar muestras lquidas de Saccharomyces cerevisiae de la etapa final del

proceso de fermentacion como material de estudio del proyecto.

Determinar medios lquido y solido mnimos e ideales para el cultivo y propagacion

de Saccharomyces cerevisiae.

Identificar analisis microbiologicos adecuados para la determinacion de la viabili-

dad de las celulas de S. cerevisiae posterior a la fermentacion.

Plantear metodos de control de calidad para cerveza.

1.6. Hipotesis

Saccharomyces cerevisiae recuperada de los tanques de fermentacion puede ser reutili-

zada para nuevos procesos de elaboracion de cerveza.
Captulo 2

Marco Teorico

2.1. Levaduras cerveceras: Saccharomyces cerevisiae

La habilidad de S. cerevisiae para leudar y generar etanol en la fermentacion ha sido

aprovechada por la humanidad desde hace miles de anos. Ademas desde su identificacion
como responsable de estos y otros procesos han sido ampliamente estudiadas, y hoy en
da existen muchas aplicaciones de levaduras en diversas areas industriales, principal-
mente en el area de alimentos y bebidas [?].

El uso de S. cerevisiae para la produccion de bebidas alcoholicas, vinos y cervezas en

especial, ha constituido una empresa muy rentable. En la industria cervecera, estas le-
vaduras, constituyen un aspecto fundamental en el proceso de obtencion de productos
de buena calidad por ello que el estudio de esta especie se ha desarrollado enormemente
hasta el punto de manipulaciones a nivel genetico para el mejoramiento de cepas es-
pecficas de S. cerevisiae.

S. cerevisiae son organismos unicelulares de forma esferica, elipsoide u ovoide. Su ta-

mano vara con la edad de la celula pero generalmente oscila entre 4 y 14 micras que
toman azucares simples como glucosa o maltosa de su entorno y los utilizan como fuente
de energa para sobrevivir, como resultado de este proceso producen etanol y dioxido de
carbono [?].

4
Marco Teorico 5

2.2. Recuperacion de S. cerevisiae

S. cerevisiae recuperadas de los tanques de fermentacion pueden ser reutilizadas de

inmediato en nuevos procesos fermentativos sin necesidad de tratamientos, siempre y
cuando las condiciones de fermentacion y separacion hayan sido muy asepticas [?, ?].
Este proceso puede ser repetido hasta siete ocasiones pero en cada recuperacion se
obtienen generaciones distintas y con ello se tiene problemas para elaborar una misma
cerveza [?]. Esto se debe a la presencia de celulas de S. cerevisiae no viables, a las
mutaciones geneticas en las distintas generaciones y otros factores que hacen que las
nuevas generaciones no actuen de una manera homogenea.

2.3. Saccharomyces: dos grupos, dos estilos de cerveza

Se ha descrito el mecanismo de obtencion de etanol utilizando la especie S. cerevisiae que

es una levadura conocida como levadura tipo Ale. Este termino tiene su origen a prin-
cipios del siglo XIX en varios pases europeos donde se utilizaba estas porque trabajan
en rangos de temperatura que van desde 15 a 22 o C y por ello las llamaban levaduras1
de alta fermentacion. Existe otro tipo de levaduras, S. carlsbergensis por ejemplo, que
fermentan a temperaturas bajas, desde 8 a 12 o C, a estas se las conoce como levaduras
tipo Lager o de baja fermentacion [?, ?].

Las variedades de levaduras de alta y baja fermentacion, que han dado su fama a los
dos grandes grupos de cervezas Ale y Lager respectivamente, tienen una caractersti-
ca importante desde el punto de vista industrial y artesanal; al finalizar el proceso de
fermentacion estas tienden a agruparse y depositarse en el fondo del tanque, esta pro-
piedad se conoce como floculacion, esto se atribuye a la composicion de la pared celular
de estos microorganismos y su potencial hidrofobico. Gracias a esto es posible separar
a las levaduras por simple decantacion y con ello se las puede reutilizar en posteriores
fermentaciones [?].

2.4. Fermentacion alcoholica

Gracias al metabolismo de levaduras como S. cerevisiae se puede generar etanol a partir

de una fuente de compuestos de carbono. En el proceso de produccion de cerveza o vino
se utiliza ciertos cereales o frutas para obtener azucares simples, ademas se obtienen
1
La palabra levadura es ampliamente utilizada en referencia del organimo del genero Saccharomyces
Marco Teorico 6

otros compuestos nitrogenados y fosfatados, todos ellos estan presentes en el mosto o

caldo azucarado extrado de frutas y cereales, que sirve como medio de crecimiento para
las levaduras ya que este contiene todo lo necesario, fuente de carbono (azucares sim-
ples), protenas (compuestos nitrogenados) y gran variedad de sales (fosfatos, sulfatos,
etc.) para que estos microorganismos se multipliquen y generen etanol, dioxido de car-
bono y otros compuestos propios de las bebidas alcoholicas.

El proceso de conversion de azucar en etanol y dioxido de carbono se conoce como fer-

mentacion alcoholica, o simplemente fermentacion, y ocurre en recipientes donde se tiene
el mosto y las levaduras bajo ciertas condiciones controladas. Los recipientes adecuados
para este proceso son tanques fermentadores disenados especficamente para cuando el
proceso finalice se pueda separar el lquido fermentado y las levaduras. El proceso de
fermentacion tiene un tiempo de duracion que vara segun las condiciones de crecimien-
to y estado de las levaduras. En la produccion de cerveza el tiempo de fermentacion va
desde tres das hasta varios meses dependiendo del tipo y estilo de cerveza que se desea
obtener. Para cervezas Ale, elaboradas con levaduras de alta fermentacion, se puede fijar
el tiempo de fermentacion en siete das [?, ?, ?]. Al cabo de este tiempo se separan las
levaduras y, el lquido resultante se conoce como cerveza verde que se almacena en otros
fermentadores para su maduracion y posterior acondicionamiento. La levadura separada
puede ser tratada y almacenada en bancos criogenicos para posteriores fermentaciones
[?].

2.5. Elaboracion de lotes de cerveza

La elaboracion de cerveza es un proceso sencillo que consta de varias operaciones. Se

puede resumir brevemente dicho proceso en los siguientes pasos [?, ?, ?].

2.5.1. Maceracion

Aqu se mezcla los granos de cebada malteada previamente triturados con agua a 72 o C,
la mezcla se deja en agitacion por 90 minutos. En esta etapa las enzimas presentes en
los granos como beta-glucanasas, amilasas y maltasas se activan y degradan el almidon
en azucares simples como maltosa, glucosa, fructosa, maltotriosa, etc.; estos compuestos
son disueltos en el agua y forman una solucion azucarada conocida como Mosto.
Marco Teorico 7

2.5.2. Filtrado

Luego de la maceracion se debe separar o filtrar el mosto del grano. El lquido es con-
ducido a la olla de hervido. El proceso de filtardo se lo realiza gracias a un tamiz en el
fondo de la olla de maceracion.

2.5.3. Lavado del grano

El grano que se separo del mosto es lavado con agua caliente a 82 o C para recoger los
azucares restantes e inactivar las enzimas catalticas que aun se encuentren presentes.
Nuevamente se filtra el agua que es conducida a la olla de hervido.

2.5.4. Hervido

El mosto que se filtro es almacenado en una olla para someterlo a temperaturas elevadas
hasta alcanzar el punto de ebullicion, esta etapa puede durar entre dos a cinco horas
dependiendo del volumen manejado. La ebullicion debe mantenerse por al menos 70
minutos y durante este tiempo se anade dosis alternadas de flores de lupulo2 y se consigue
la esterilizacion completa del mosto.

2.5.5. Enfriado

Al terminar el proceso de ebuillicion el mosto se encuentra aproximadamente a 110 o C

por lo que es necesario enfriarlo rapidamente a temperaturas entre 25-30 o C para lo cual
se utilizan intercambiadores de calor de distintas formas segun sea el volumen, para el
caso de pequenas cerveceras los intercambiadores de placas son utilizados por su bajo
costo economico y alta eficiencia.

2.5.6. Fermentacion

Una vez que se tiene el mosto fro se lo inocula con una cantidad especfica de S. cerevisiae
para que esta transforme los azucares en etanol y dioxido de carbono. Este proceso puede
durar unos pocos das e incluso anos en funcion del estilo de cerveza que se desea obtener.
2
Planta trapadora de la familia de las cannabinaceas que otorga a la cerveza su amargor caracterstico.
Marco Teorico 8

2.5.7. Envasado

Finalizada la fermentacion se separa la levadura y la cerveza es almacenada, ya sea en

botellas o barriles, para que madure y gane dioxido de carbono y efervescencia.
Captulo 3

Metodologa

3.1. Recoleccion de muestras de Saccharomyces cerevisiae

La recoleccion de muestras de S. cerevisiae fue realizada directamente de los tanques de

fermentacion en la planta de operacion de la cervecera Quinde Brewery Co. y con la
ayuda del jefe de planta.
En frascos de plastico esteriles se tomo 100 mL de muestra lquida directamente de las
llaves de salida de los fermentadores, el uso de mascarilla y guantes es obligatorio, los
recipientes son sellados con parafilm y trasladados al laboratorio en un lapso no mayor
de una hora donde se los almacena en refrigeracion a 4 o C para realizar todas las pruebas
previstas.

3.2. Recuperacion de colonias puras de S. cerevisiae

Una vez que se tiene las muestras en el laboratorio primero se procede a identificar los
microorganismos presentes para luego aislar y purificar las cepas de S. cerevisiae.

3.2.1. Tincion Gram: Identificacion morfologica

Para la identificacion de microorganismos presentes en muestras de cerveza artesanal,

primero se debe identificar la morfologa general de los microorganismos de interes y
clasificarlos segun su respuesta a la tincion Gram. Las celulas de S. cerevisiae son orga-
nismos Gram Positivos y tienen una forma ovoide caracterstica [?].

9
Metodologa 10

3.2.2. Aislamiento y purificacion de colonias

Identificadas los organismos presentes en las muestras se preparo un medio selectivo para
hongos y levaduras para lograr aislar las colonias puras de S. cerevisiae y verificar que
no existen organismos contaminantes. El medio utilizado es conocido como PDA (por
sus siglas en ingles, Potato Dextrose Agar) [?, ?].

3.2.3. Siembra mediante diluciones

La tecnica de dilucion consiste en inocular 10 tubos de ensayo que contienen 9 mL agua

destilada. Se obtiene 1 mL de la muestra usando una micro pipeta esteril, se inocula el
primer tubo de ensayo, sin retirar la punta se agita el mismo luego se invierte y se retira
1 mL que se inocula en el segundo tubo de ensayo y as se sigue sucesivamente hasta
llegar al tubo 10. Cada una de los tubos con las distintas diluciones se agita y se toma 1
mL de esta solucion que se vierte en cajas de Petri que contienen el medio PDA solido
preparado.

Una vez que se inocula el medio con las diluciones se incuba las cajas de Petri por cinco
das a temperatura promedio de 172 o C. Finalmente se tiene colonias aisladas y puras
de S. cerevisiae para continuar con los analisis correspondientes.

3.3. Preparacion de medios de cultivo mnimos

Existen varios medios apropiados para el crecimiento de S. cerevisiae, sin embargo, en

el presente trabajo se quiere estandarizar un medio de cultivo mnimo. Este medio debe
poseer los nutrientes basicos y necesarios para el adecuado desarrollo y crecimiento de
S. cerevisiae como son una fuente de carbono (generalmente un disacarido), nitrogeno
y fosforo; a continuacion las tablas 3.1 y 3.2 muestran la composicion para los medios
lquidos y solidos, respectivamente:

Cuadro 3.1: Composicion de reactivos para un litro de medio lquido.

Reactivo Cantidad
Caldo Nutritivo 8 gramos
Sacarosa 20 gramos
Agua destilada 1000 mL
Metodologa 11

Cuadro 3.2: Composicion de reactivos para un litro de medio solido.

Reactivo Cantidad
Caldo Nutritivo 8 gramos
Sacarosa 20 gramos
Agar agar 15 gramos
Agua destilada 1000 mL

3.4. Inoculacion y crecimiento en medios de cultivo mni-

mos

3.4.1. Medio Solido

Al aislar y purificar correctamente colonias de S. cerevisiae se procede a preparar medio

solido en tubos de ensayo de 25 mL, estos se colocan de manera inclinada para conseguir
una buena area de sembrado. Los tubos son inoculados con la muestra recuperada y
la ayuda de una asa bacteriologica en forma de estras e incubados por siete das a
temperatura promedio de 172 o C y luego almacenados en refrigeracion a 4 o C. Estos
cultivos en medio solido sirviran posteriormente para llevar un control de la morfologa
de las levaduras y posibles contaminaciones a lo largo de todos los analisis.

3.4.2. Medio Lquido

En 250 mL de medio lquido se inocula 1 mL de la levadura recuperada. Estos medios se

incuban a temperatura de 172 o C en Erlenmeyer de 500mL con agitacion durante siete
das. Al finalizar la incubacion se debe tomar 50 mL de cultivo lquido para realizar las
pruebas de control, conteo y viabilidad de las celulas de S. cerevisiae, los restantes 200
mL seran trasladados a la planta de la cervecera con los cuales se elaborara cerveza.

3.5. Recuento bacteriano

Para el conteo del numero total de celulas de S. cerevisiae presentes en las muestras se
utiliza el metodo de recuento en Camara de Neubauer.

3.5.1. Conteo en Camara de Neubauer

El recuento en camara de Neubauer es un metodo directo ya que cuenta directamente las

celulas presentes en las diferentes diluciones. De las diluciones preparadas se toma una
Metodologa 12

pequena alcuota para colocarla sobre la camara de Neubauer, se cubre con un cubreob-
jetos y se lleva al microscopio donde se cuenta las celulas individuales a una amplificacion
de 40x. Se utiliza el metodo corto de conteo por el cual se cuenta unicamente las celulas
presentes en ciertos cuadrantes, al final del conteo se aplica una relacion numerica para
obtener el numero de celulas presentes en la muestra. La relacion utilizada es: [?]

Ncel
= Ncont n fd 103 (3.1)
mL

Donde, Ncel es el numero total de celulas presentes en la muestra, Ncont el numero de

celulas contadas en los cuadrantes, n es el numero de cuadrantes contados y fd el factor
de dilucion.

3.6. Estimacion de la viabilidad de celulas de S. cerevisiae

La viabilidad de las celulas de S. Cerevisiae es primordial para su utilizacion en nuevos

procesos de fermentacion, por ello se debe estimar su valor. Se encuentra la relacion
entre el numero total de celulas y el numero de celulas vivas presentes en las muestras
recolectadas. Para cuantificar el numero de celulas vivas se utiliza una modificacion
del metodo de conteo en Camara de Neubauer en el que se toma una alcuota de las
diferentes diluciones y se las tine con una solucion al 0.1 % de Azul de Metileno, luego
se cuenta de manera identica a la descrita en el apartado anterior, la diferencia es que
esta vez se debe contar unicamente las celulas coloreadas de azul ya que estas son las
que estan metabolicamente activas. El porcentaje de viabilidad se calcula como:

Nvivas
V = x100 (3.2)
Ncel

3.7. Elaboracion de lotes de cerveza con S. cerevisiae re-

cuperadas

Luego que las celuas de S. cerevisiae recuperadas son propagadas y cuantificadas en el

medio lquido por siete das deben ser trasladas a la planta de la cervecera en recipientes
de vidrio ambar esteriles y sellados donde se elabora un lote con cada generacion de
las mismas. Cada lote de cerveza contiene aproximadamente 18 litros los cuales son
preparados siguiendo la metodologa antes descrita y con los ingredientes que se muestran
en la tabla 3.3.
Metodologa 13

Cuadro 3.3: Cantidad de materias primas para elaborar 18 litros de cerveza.

Insumo Cantidad
Agua 26 L
Malta de cebada 5 Kg
Lupulo en pellets 40 g
Levadura lquida 150 mL

3.8. Medicion de la densidad y pH de la cerveza

Al finalizar la fermentacion se procede a tomar muestras de la cerveza para medir su

densidad y pH. Para la densidad se utiliza un metodo indirecto que consiste en medir
los grados Brix de la muestra con ayuda de un equipo calibrado llamado Brixometro,
para ello se toma una gota de muestra y se coloca en el lector optico del aparato, se
anota el valor marcado en grados Brix. Tambien se mide el pH en la muestra de cerveza,
para este paso se toma cerca de 50 mL de muestra y con el pH-metro se mide el valor
medido.

3.9. Estimacion de contenido de etanol en la cerveza

Para cuantificar la cantidad de etanol presente en las muestras de cerveza se realiza una
destilacion rapida en la cual se debe utilizar 100 mL de cerveza que se calienta en el
equipo destilador a 78 o C y por vaporizacion y condensacion se recolecta el etanol en
una probeta graduada. El porcentaje de etanol se lo estima con la relacion [?, ?]:

VetOH
ABV = x100 (3.3)
Vc

Donde, VetOH es el volumen de etanol recuperado en la destilacion y Vc es el volumen

de cerveza utilizado. Las siglas ABV significan el volumen de alcohol por volumen de
cerveza (Alcohol By Volumen, por sus siglas en ingles).
Captulo 4

Resultados y Discusion

4.1. Recuperacion y aislamiento de S. cerevisiae

En las figuras 4.1 y 4.2 se observa las colonias puras de S. cerevisiae aisladas y cultivadas
en medio selectivo PDA, as como la tincion Gram de dichas colonias.

Figura 4.1: S. cerevisiae aisladas en medio selectivo PDA (Caiza, 2014).

Figura 4.2: S. cerevisiae aisladas. 100x (Caiza, 2014).

14
Resultados y Discusion 15

Segun [?] y [?], el crecimiento de S. cerevisiae en medio de cultivo solido PDA es rapido
ya que las colonias empiezan a ser visibles aproximadamente a las 48 horas de ino-
culacion y la morfologa de estas es muy caracterstica, presentandose siempre como
discos redondos de color blanco y borde regular. De esta manera se logro tener una idea
concreta que los organismos que crecieron en tales medios, efectivamente eran levaduras.

La identificacion con tincion Gram permitio observar la morfologa de los organismos

que crecieron en el medio PDA, los mismos que presentaron formas ovoides de color
morado-azul demostrando que son microorganismos Gram Positivos. Las celuas de S.
cerevisiae poseen estas caractesticas inconfundibles bajo el microscopio a un aumento
de 100x [?, ?, ?].

4.2. Conteo celular en Camara de Neubauer

Al finalizar la etapa de purificacion y aislamiento de colonias de S. cerevisiae se inoculo es-

tas cepas en los medios mnimos preparados previamente como se muestra en la figura
4.3. La incubacion duro siete das y al cabo de esto se conto las celulas presentes en el
medio lquido.

Figura 4.3: Inoculacion de S. cerevisiae recuperadas en medios mnimos solido y lqui-

do (Caiza, 2014).

A continuacion en la figura 4.4 se muestra el conteo en Camara de Neubauer, para esto

se realizaron dilusiones consecutivas del medio lquido, se encontro que la dilucion 102
fue la mas apta para efectuar el conteo.

La tabla 4.1 muestra el conteo de celulas para la dilusion 102 , como se indico en la
metodologa, el conteo se realizo en cinco cuadrantes y se aplico la ecuacion 3.1 para
estimar el numero de celulas por mL.
Resultados y Discusion 16

Figura 4.4: Celulas de S. cerevisiae en Camara de Neubauer vistas al microscopio.

40x (Caiza, 2014).

Cuadro 4.1: Datos observados en Camara Neubauer para las celulas por mL.

fd Generacion Repeticion Ncont n Ncel

100 Primera 1 45 5 2,25 107
100 Primera 2 38 5 1,90 107
100 Primera 3 42 5 2,10 107
100 Segunda 1 24 5 1,20 107
100 Segunda 2 27 5 1,35 107
100 Segunda 3 21 5 1,05 107
100 Tercera 1 14 5 7,00 106
100 Tercera 2 19 5 9,50 106
100 Tercera 3 17 5 8,50 106

Como indica la tabla 4.1 el numero de de celulas de S. cerevisiae por mililitro disminuye
de una generacion a otra. Este resultado era de esperar, segun [?], [?] y [?] con cada
proceso fermentativo las celulas pierden la capacidad de multiplicacion por algunos fac-
tores como la mutacion espontanea o la temperatura de fermentacion.

El analisis estadstico muestra las diferencias que existen entre cada generacion de S.
cerevisiae recuperadas.
La figura 4.5 muestra graficamente como el numero de celulas de levadura disminuye en
cada generacion. El analisis de varianza ANOVA para este grafico se indica en la figura
4.6.

Se observa que hay diferencias significativas para las generaciones de S. cerevisiae (p-
valor=0.0001479) en relacion al numero de celulas presentes en las muestras, aunque la
segunda y tercera generacion resultan ser iguales estadsticamente hablando. La primera
generacion sera la mejor en relacion a este parametro.
Resultados y Discusion 17

Figura 4.5: Variaciones del numero de celulas por mL para las diferentes generaciones.

Figura 4.6: Analisis de la varianza para el numero de celulas de lS. cerevisiae.

Debido a esta diferencia se realizo una prueba de Duncan para las medias, la figura 4.7
muestra el rango de diferencias entre generaciones y ademas se observo que la primera
generacion presento el mayor numero de celulas por mL.

De acuerdo con la prueba de Duncan se obtuvo valores promedios de 20,8 millones, 12

millones y 8,3 millones de celulas de S. cerevisiae por mL. Dichos valores concuerdan
con datos rerportados por [?, ?, ?].

Ademas segun [?] y [?], el numero de celulas por mL aceptable para iniciar un proceso
fermentativo es de 10-20 millones, los datos reportados en el presente trabajo estan
Resultados y Discusion 18

Figura 4.7: Prueba Dunca para el numero de celulas de S. cerevisiae ( = 0,01).

dentro de este rango para la primera y segunda generacion de S. cerevisiae recuperadas.

4.3. Viabilidad celular

Posterior al conteo de celulas en los medios lquidos se tino una alcuota de muestra
de cada generacion de S. cerevisiae para estimar la viabilidad de celulas, es decir, para
estimar que porcentaje de celulas estuvieron metabolicamente activas. As la viabilidad
se calculo con la ecuacion 3.2 y los resultados se indican en la figura 4.8 y la tabla 4.2 .

Figura 4.8: S. cerevisiae tenidas con Azul de Metileno vista bajo el microscopio. 100x,
(Caiza, 2014).

La figura 4.9 muestra que el porcentaje de celulas vivas disminuye en cada generacion,
es decir, en cada proceso de recuperacion y fermentacion la supervivencia de las levadu-
ras es menor; en otras palabras con el transcurso del tiempo las celulas de S. cerevisiae
disminuyen sus procesos metabolicos y mueren rapidamente [?, ?].
Resultados y Discusion 19

Cuadro 4.2: Estimacion de la viabilidad celular.

Generacion Repeticion Ncel Nvivas V ( %)

Primera 1 2,25 107 2,10 107 93.3
Primera 2 1,90 107 1,85 107 97.4
Primera 3 2,10 107 2,00 107 95.2
Segunda 1 1,20 107 1,05 107 87.5
Segunda 2 1,35 107 1,30 107 96.3
Segunda 3 1,05 107 9,50 106 90.5
Tercera 1 7,00 106 6,00 106 85.7
Tercera 2 9,50 106 7,50 106 78.9
Tercera 3 8,50 106 7,00 106 82.4

Figura 4.9: Variaciones de la viabilidad para las diferentes generaciones.

Ademas el analisis de varianza ANOVA para el porcentaje de viabilidad V mostro que

existen diferencias significativas entre las generaciones de S. cerevisiae recuperadas (p-
valor=0.00954) segun la figura 4.10. Tambien se realizo la prueba de Duncan para esta
variable y se mostro que el mejor tratamiento se da en la primera generacion con un
mayor porcentaje de viavilidad de celulas, pero de acuerdo a [?], [?], [?] y [?] el por-
centaje de celulas vivas mnimo aceptado para un proceso de fermentacion es de 70 %
lo que significa que cualquiera de las tres generaciones de S. cerevisiae recuperadas son
aptas para un proceso de fermentacion ya que en promedio los porcentajes de viabilidad
Resultados y Discusion 20

obtenidos en este trabajo fueron de 95,3 %, 91,4 % y 82,3 % para la primera, segunda y
tercera generacion, respectivamente. Esto se muestra explcitamente en la figura 4.11.

Figura 4.10: Analisis de la varianza para la viabilidad de celulas de S. cerevisiae.

Figura 4.11: Prueba Dunca para la viabilidad de celulas de S. cerevisiae ( = 0,01).

4.4. Analisis Fsico-Qumicos de Cerveza

Con las tres generaciones de S. cerevisiae recuperadas se elaboro tres lotes de cerveza,
cada lote de aproximadamente 18 litros de cerveza. De cada lote se tomo tres muestras
que fueron analizadas en el laboratorio para medir los grados Brix, pH y porcentaje de
alcohol (ABV) y tener una referencia de la calidad de cerveza que se obtuvo con cada
generacion de S. cerevisiae. Los datos medidos se muestran en la tabla 4.3.

El comportamiento de las variables grados Brix, pH y porcentaje de alcohol (ABV) en

funcion de la generacion se muestra en las figuras 4.12, 4.13 y 4.14.
Resultados y Discusion 21

Cuadro 4.3: Analisis Fsico-Qumicos de la cerveza elaborada con S. cerevisiae.

Generacion Repeticion o Brix pH ABV ( %)

Primera 1 5.3 4.2 5.2
Primera 2 5.4 4.2 5.2
Primera 3 5.3 4.5 5.1
Segunda 1 5.5 4.3 4.8
Segunda 2 5.7 4.6 4.5
Segunda 3 6.0 4.6 4.5
Tercera 1 6.2 4.8 4.2
Tercera 2 6.2 4.7 4.3
Tercera 3 6.2 4.8 4.0

Figura 4.12: Porcentaje de etanol presente en las cervezas.

Las propiedades fsico-qumicas de la cerveza varan en relacion a la generacion utilizada

para su elaboracion. Segun [?], la capacidad fermentativa de S. cerevisiae disminuye en
cada generacion, es decir que S. cerevisiae de cada generacion asimilan en forma dife-
rente los compuestos presentes en el caldo a fermentar. Ademas el metabolismo de cada
generacion disminuye lo que explica las diferentes medidas de las variables estudiadas
[?, ?, ?, ?, ?].
Resultados y Discusion 22

Figura 4.13: Grados Brix medidos en las cervezas.

Figura 4.14: pH medido en las cervezas.

Resultados y Discusion 23

Gracias al analis estadstico se logro establecer claramente las diferencias que existen
entre cada generacion de S. cerevisiae y con ello determinar que generacion produjo una
mejor cerveza.

4.4.1. Analisis de grados Brix en cerveza

Para la variable de grados Brix las figuras 4.15 y 4.16 indican diferencias significativas
entre cada generacion de S. cerevisiae (p-valor=0.00118) para el analisis de varianza,
mientras que la prueba de Duncan indica que la gerneracion tercera presenta el mejor
valor medio. Se debe mencionar que respecto a la variable de grados Brix, los valores
mas bajos son los mejores ya que esto significa que la densidad de la cerveza es menor
para dichos valores.

Segun indica la figura 4.16 los valores medios para los grados Brix fueron de 6.2, 5.7
y 5.3 o Brix para la tercera, segunda y primera generacion. De acuerdo a [?], [?] y [?],
la densidad expresada en grados Brix al finalizar la fermentacion puede ir de 2.5 hasta
6.5 grados Brix por lo que los valores obtenidos de las muestras de S. cerevisiae en este
trabajo estan en el rango aceptable.

Figura 4.15: Analisis de la varianza para la densidad expresada en grados Brix.

Figura 4.16: Prueba Dunca para la densidad expresada en grados Brix ( = 0,01).
Resultados y Discusion 24

4.4.2. Analisis de pH en cerveza

Las figura 4.17 indica que no hay diferencias estadsticas (p-valor=0.0215) para el pH
entre las tres muestras de cervezas. Los valores medios obtenidos para esta variable
fueron de 4.3, 4,5 y 4.8 para la primera, segunda y tercera generacion respectivamente,
esto se muestra en la figura 4.18. La prueba de Duncan mostro claramente que las tres
generaciones de S. cerevisiae presentan valores de pH dentro de un mismo rango.

Figura 4.17: Analisis de la varianza para el pH de las cervezas.

Figura 4.18: Prueba Dunca para el pH de las cervezas ( = 0,01).

Los valores medidos para el pH de todas las muestras de cerveza estan de acuerdo con
la norma ecuatoriana para bebidad alcoholicas, donde se indica que el pH de cerveza
esta en el rago de 3.5 a 5.0, estos valores tambien se referencian en otros estudios y
normas internacionales [?, ?, ?].

4.4.3. Analisis del contenido de alcohol en cerveza

Finalmente se realizo una destilacion rapida con cada muestra de cerveza para estimar
el contenido de alcohol en la cerveza (ABV). Los resultados para la prueba de varianza
mostraron que s existen diferencias significativas (p-valor=0.000341) para cada lote de
cerveza elaborados con cada generacion de levadura, esto se indica el la figura 4.19. A
Resultados y Discusion 25

continuacion la figura 4.20 indica los valores medios del contenido de alcohol para la
primera, segunda y tercera generacion, los valores fueron 5.2, 4.6 y 4.2 ABV respectiva-
mente. Tambien se muestra que las generaciones estan distribuidas en distintos rangos,
siendo la primera generacion la mejor ubicada con el valor mas alto.

Segun [?], el rango permitido de alcohol en una cerveza va desde 2.0 a 5.0 ABV, esto
indica que solo las cervezas elaboradas con la segunda y tercera generacion estan del
rango permitido. Por otro lado, segun normas internacionales indicadas en [?], [?], [?],
[?], [?] y [?] los valores para el contenido de alcohol en cervezas van de 1 a 12 ABV.

Figura 4.19: Analisis de la varianza para el porcentaje de alcohol en cervezas.

Figura 4.20: Prueba Dunca para el porcentaje de alcohol en cervezas ( = 0,01).

Captulo 5

Conclusiones y recomendaciones

Saccharomyces cerevisiae es el organismo unicelular responsable de la fermentacion al-

coholica en la elaboracion de cerveza. Cada da hay mas demanda de esta levadura
debido al incremento de empresas cerveceras alrededor del mundo.

La recuperacion y posterior reutilizacion de esta levadura representa un ahorro de recur-

sos economicos para las empresas cerveceras multinacionales y para las microcerveceras.
Ademas el proceso para esta recuperacion y reutilizacion es sencillo pero requiere de un
correcto uso de tecnicas de asepsia y manejo adecuado de materiales de laboratorio.

En este trabajo se recupero y reutilizo levaduras de primera, segunda y tercera fer-

mentacion con las cuales se elaboro lotes estandar de cerveza, se encontro que existen
diferencias respecto a ciertos parametros fsico-qumicos evaluados en la cerveza, as co-
mo diferencias a nivel microbiologico en el crecimiento de las mismas.

Se estandarizo el protocolo para dos medios mnimos: uno solido y uno lquido, en los
cuales se realizaron todos los analisis. Estos medios contienen una fuente de carbono
20 gramos (sacarosa), fuente de nutrientes especficos 8 gramos (caldo nutritivo), agua
destilada 1000 mL y para el caso del medio solido agar 15 gramos.

Durante el trabajo se determino parametros necesarios en levaduras cerveceras y parame-

tros requeridos en la cerveza elaborada. Respecto al crecimiento celular se determino que
a los siete das de incubacion a 172 o C existan 20,8 millones de celulas por mL para
la primera generacion, 12 millones de celulas por mL para la segunda generacion y 8,33
millones de celulas en la tercera generacion, datos que estan en concordancia con otros

26
Conclusiones y recomendaciones 27

estudios y datos bibliograficos.

Respecto a la viabilidad se calculo 95.3 %, 91.4 % y 82.3 % para la primera, segunda y

tercera generacion de S. cerevisiae respectivamente. La viabilidad mnima recomendada
es de 70 %.

Los valores fsico-qumicos para la densidad final de la cerveza expresada en grados Brix
fueron de 6.2 5.7 y 5.3 o Brix en la tercera, segunda y primera generacion, los valores de
pH medios obtenidos fueron de 4.3, 4,5 y 4.8 para la primera, segunda y tercera genera-
cion y finalmente los valores medios del contenido de alcohol para la primera, segunda
y tercera generacion fueron 5.2, 4.6 y 4.2 ABV respectivamente.

Por lo tanto se pudo concluir que la recuperacion y reutilizacion de S. cerevisiae es

posible dentro de una cervecera local.

La recomendacion para un futuro proyecto esta en la recuperacion de S. cerevisiae de

hasta una octava generacion.