Clase 15 Coliforme Tecnica Filtracion Membrana

Universidad de El Salvador
Facultad Multidisciplinaria de Occidente

Departamento de Ingeniera
Curso : Ingeniera Sanitaria 1

Recuento de
Coliformes
Totales
Filtracin a
travs
de membrana 2
REQUISITOS DE CALIDAD MICROBIOLOGICOS
Tabla No 1 : Limites Mximos permisibles para Calidad Microbiolgica
Fuente : NSO 13.07.01 : 08 CONACYT
3
Recuento de Coliformes Totales Filtracin a travs de membrana
Los coliformes totales son las

Enterobacteriaceae lactosa-positivas y
constituyen un grupo de bacterias que se
definen ms por las pruebas usadas para
su aislamiento que por criterios
taxonmicos.
4
Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

y se caracterizan por su capacidad para
fermentar la lactosa con produccin de
cido y gas, ms o menos rpidamente, en
un periodo de 48 horas y con una
temperatura de incubacin comprendida
entre 30-37C.
5
Son bacilos gramnegativos, aerobios

y anaerobios facultativos, no
esporulados. Del grupo <<coliforme>>
forman parte varios gneros:
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella,
Citrobacter, etc
6
Se encuentran en el
intestino del hombre
y de los animales,
pero tambin en
otros ambientes:
agua, suelo, plantas,
cscara de
huevo,etc.
7
Una elevada proporcin

de los coliformes que
existen el los sistemas
de distribucin no se
debe a un fallo en el
tratamiento en la
planta, sino a un
recrecimiento de las
bacterias en las
conducciones 8
Dado que es difcil

distinguir entre
recrecimiento de coliformes
y nuevas contaminaciones,
se admite que todas las
apariciones de coliformes
son nuevas
contaminaciones, mientras
no se demuestre lo
contrario 9
Dentro del grupo de los coliformes totales existe

un subgrupo que es el de los Coliformes fecales.
10
Los coliformes fecales son coliformes totales que

adems fermentan la lactosa con produccin de
cido y gas en 24-48 horas a temperaturas
comprendidas entre 44 y 45C en presencia de
sales biliares.
11
Los coliformes fecales comprenden

principalmente
a) Escherichia coli y
b) Algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella.
12
Su origen es principalmente fecal y por esos se

consideran ndices de contaminacin fecal.
13
Pero el verdadero ndice de contaminacin

fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen
fecal es seguro.
Desde el punto de vista metodolgico

Escherichia coli es el Coliforme fecal que
adems es positivo a la prueba del Indol
14
Recuento de Coliformes
Totales por la Tcnica
de Filtracin a travs
de membrana
15
A. Filtros de membrana
Los filtros de membrana son filtros de superficie, que

muestran una estructura microporosa precisa.
16
A. Filtros de membrana
Durante la filtracin las partculas mayores que

los poros de la membrana son retenidas de
forma fiable en la superficie de la misma.
Las partculas ms pequeas pueden pasar el

filtro.
17
B. Filtracin a travs de membrana
El nmero de coliformes totales

presentes en el agua se determina
mediante la filtracin de volmenes
especficos de la muestra a travs de
filtros de membrana.
18
Por lo general, estn compuestos de steres

de celulosa, tpicamente con poros de 0,45
mm de dimetro que retienen los coliformes
totales y otras clases de bacterias presentes
en la muestra.
Despus se incuban las membranas vueltas

hacia arriba en un medio selectivo.
19
En la prctica, la tcnica de filtracin de membrana

ofrece resultados comparables a los que se obtienen
con el mtodo de tubos mltiples.
20
Una de las ventajas del mtodo de filtracin a travs

de membrana es la prontitud con que pueden
obtenerse los resultados y, en consecuencia, se
pueden llevar a cabo rpidamente acciones
correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en
forma normal.
21
Esta tcnica puede aplicarse en el anlisis de casi

todos los tipos de agua, tambin se utiliza en el
anlisis de leche y otros alimentos lquidos.
22
c. Aparatos y tcnicas de filtracin
El aparato de filtracin consiste de un

disco incrustado (portafiltros) sostenido
por soporte de goma o caucho y que se
ajusta a una base donde puede fijarse un
embudo graduado o una rampa mltiple
de filtracin. 23
24
El disco incrustado o perforado (portafiltros) sostiene el filtro de
membrana.
25
El portafiltros se coloca encima de un soporte de filtracin
bien sea nico o colector mltiple (rampas de filtracin
para varias muestras a la vez) conectado a un sistema de
vaco.
26
D. Volumen de agua
analizada
El volumen de muestra a
filtrar es generalmente de
100 ml, excepto para aguas
envasadas, en las que se
recomienda analizar
muestras de 250 ml.
27
D. Volumen de agua analizada
Sin embargo, en aguas

superficiales y en general en
aguas naturales sin tratar, el
nmero de bacterias en 100 ml
puede variar desde pocas
decenas hasta cientos de
millares.
28
Tipos de agua Coliformes totales

Potable de consumo pblico 100 ml
Envasadas 250 ml
Manantiales 15; 60; 100 ml
Lagos, depsitos 4; 15; 60; 100 ml
Acometidas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De playas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De ros 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales cloradas 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
0,0001; 0,0003; 0,001;
Residuales sin tratar
0,003; 0,01 ml
29
Preparacin de diluciones
Para realizar una dilucin 1/10

(10-1), se pipetea
aspticamente 1 ml de
Muestra Diluyente Dilucin
muestra en un tubo con 9 ml + =
1 ml 9 ml 1/10 (10-1)
de solucin tamponada estril
y se agita.
Para realizar una dilucin

1/100 (10-2), se pipetea 1 ml Dilucin Diluyente Dilucin
de la dilucin 1/10 en otro + =
tubo con 9 ml de solucin 1/10 (10-1) 9 ml 1/100 (10-2)
tamponada estril y se agita.
As sucesivamente se van haciendo las diluciones que se necesiten, dependiendo del grado de
contaminacin esperado de la muestra.
30
E. Toma de muestra
La tcnica de muestreo depende del
lugar donde se realiza dicho
muestreo, para conocer los detalles
sobre la toma de muestras de aguas
para anlisisi microbiolgicos haga
clic sobre esta frase.
31
F. Material y equipo
Membranas filtrantes de 0,45 m de tamao de
poro
Soporte del filtro con embudo
Sistema de vacio
Pipetas estriles de 10 y 1 mL.
Estufa de cultivo
Asa de siembra
Pinzas estriles
32
G. Medio de cultivo selectivo para Coliformes Totales:
Caldo Endo, MF
Se utiliza el Caldo Endo para el recuento de coliformes

totales.
Este es un medio para el aislamiento selectivo de los
coliformes totales pues lleva inhibidores para el resto de
microorganismos.
33

Caldo Endo, MF
El lauril sulfato y desoxicolato que forman parte de la frmula

del medio permite crecer a los coliformes lactosa positivo pero
inhibe el crecimiento del resto de bacterias acompaantes.
Las colonias lactosa positivo se colorean de rojo por la

liberacin de fucsina del sulfato de fucsina.
Las colonias de E. coli y de los coliformes muestran

generalmente un brillo metlico.
34
Se utiliza este medio para la identificacin y recuento de coliformes en

agua, leche y otros lquidos mediante filtracin sobre membrana y esta
incluido en las recomendaciones de la APHA "American Water Works
Association and Water Pollution Control Federation: Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater, 2004 ".
Medio slido selectivo, que se prepara en placas para filtracin de

membrana.
Medio lquido selectivo, que se deposita en placas de cultivo que llevan

una almohadilla absorbente (aproximadamente 2 mL por placa).
35
Se deposita en placas
de cultivo que llevan
Medio lquido selectivo Endo-MF una almohadilla
absorbente 36
Aproximadamente se colocan 2 mL
de medio de cultivo por placa
37
Composicin:
Peptona de casena 10,0 g,

Peptona de carne 10,0 g,
Extracto de levadura 1,5 g,
Lactosa 12,5 g,
Cloruro sdico 5,0 g,
Fosfato potsico 5,75 g,
Lauril sulfato sdico 0,05 g,
Desoxicolato sdico 0,10 g,
Sulfito sdico 2,10 g
Fuscina bsica 1,05 g,
Agua destilada 1 L .
pH: 7,2 aproximadamente a 25 C 38

En la placa se coloca sobre el medio de cultivo el

filtro de membrana (una vez filtrada el agua).
39
H. Tcnica de filtracin sobre membrana
Desenvolver el filtro de la envoltura con la que se ha esterilizado
40
Separar el embudo de la base del filtro.
41
Colocar la membrana filtrante de 0,45 m de tamao de poro sobre el
portafiltros de las base del mismo.
El manejo de las membranas se debe realizar con pinzas de punta

plana o guantes de goma para no lesionarlas.
42
Colocar el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la

membrana y que esta quede bien centrada. La membrana filtrante
queda ahora situado entre el embudo y la base-soporte del filtro.
43
Filtrar 100 mL de la muestra de agua a travs del filtro. Poner en marcha

el sistema de vacio
44
Una vez filtrada toda la muestra, parar el sistema de vacio y separar el

embudo de la base del filtro.
45
Retirar con pinzas estriles o flameadas la membrana filtrante.

46
Colocar la membrana sobre la placa con la almohadilla absorbente y el

caldo Endo, de forma progresiva para evitar que queden burbujas entre
la membrana y el medio y que quede asegurado el contacto entre la
membrana y el medio. 47
Colocar la tapa de la placa de Petri, invertir la placa e incubar en estufa

a 37C durante 24 horas
48
En este medio todos los COLIFORMES crecen formando colonias de

COLOR ROJO OSCURO con el caracterstico brillo metlico de
Escherichia coli de color verde-azulado aunque en los gneros
Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter no es tan intenso como en
Escherichia y puede pasar desapercibido.
Los resultados se expresan en UFC/100 mL.

49
Expresin de los resultados

Cuando se obtienen recuentos de ms de 200
colonias sobre una misma membrana pueden
dar resultados errneos debido a la
superpoblacin, ya que lo que aparece como una
colonia puede ser originado por varias bacterias
bajo condiciones de hacinamiento. En estos
casos debemos volver a muestrear el agua y
analizar muestras ms diluidas.
50
Expresin de los resultados
Por otra parte, un nmero de colonias inferior a 10

20 por membrana es poco fiable como base para
establecer cuantitativamente la concentracin
bacteriana de la muestra. Por ejemplo, la obtencin
de 2 colonias a partir del anlisis de 1 ml de un agua,
no nos permite afirmar que ese agua contena 200
colonias en 100 ml. En estos caso conviene repetir
el anlisis filtrando un volumen de muestra mayor
51
I. Entrenamiento en la interpretacin de los resultados y los clculos
El resultado del anlisis de esta

muestra es de :
a) ausencia de UFC de coliformes
totales en 100 mL de agua problema
b) 2 UFC de coliformes totales por
100 mL de agua problema
c) 20 UFC de coliformes totaless por
d) 200 UFC de coliformes totales por
e) ms de 100 colonias. Repetir la
filtracin con menor volumen de agua
Ejemplo # 1 Agua de una fuente 100 mL 52
El resultado del anlisis de esta muestra es

de :
a) ausencia de UFC de coliformes totales en
b) ausencia de UFC de coliformes totales en
c) 4 UFC de coliformes totales por 100 mL de
agua problema, para cuantificar, repetir el
anlisis filtrando un volumen mayor
d) 4 UFC de coliformes totales por 250 mL
de agua problema, para cuantificar, repetir el
anlisis filtrando un volumen mayor
e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin
con menor volumen de agua
Ejemplo # 2 Agua embotellada 250 mL filtrados 53


de :
totales en 1.000 mL de agua problema
b) ausencia de UFC de coliformes
c) 2 UFC de coliformes totales por 100
mL de agua problema
d) 2 UFC de coliformes totales por 250
mL de agua problema
Ejemplo # 3 Agua embotellada 250 mL filtrados 54


de :
b) ausencia de UFC de coliformes
c) 15 UFC de coliformes totales por 100
mL de agua problema
d) 15 UFC de coliformes totales por 250
mL de agua problema
Ejemplo # 4 Agua de piscina 100 mL filtrados 55

J. Supuesto prctico
En tres muestras de agua, se han
filtrado diferentes cantidades de
agua . En cada muestra, interprete la
fotografia de la placa y conteste a la
pregunta, teniendo en cuenta el
volumen de agua filtrado, y el
nmero y tipicidad de las colonias de
las colonias 56
J. Supuesto prctico
muestra es de :
a) ausencia de UFC de
coliformes totales en 100 mL de
agua problema
b) 12 UFC de coliformes totales
por 100 mL de agua problema
c) 120 UFC de coliformes totales
d) 1.200 UFC de coliformes
totales por 100 mL de agua
problema
e) ms de 100 colonias. Repetir
la filtracin con menor volumen
de agua
Muestra # 1 Agua de una fuente 100 mL filtrados 57
J. Supuesto prctico
muestra es de :
coliformes totales en 100 mL
por 100 mL
por 100 mL
d) 2.900 UFC de coliformes
totales por 100 mL
de agua
Muestra # 2 Agua de balneario 10 mL filtrados 58
J. Supuesto prctico
muestra es de :
coliformes totales en 1.000 mL de
agua problema
por 1.000 mL de agua problema
d) 50 UFC de coliformes totales
de agua
Muestra # 3 Agua residual 10 mL filtrados 59
J. Supuesto prctico
muestra es de :
coliformes totales en 1.000 mL de
agua problema
b) ausencia de UFC de
coliformes totales en 250 mL de
agua problema
por 1.000 mL de agua problema
d) 20 UFC de coliformes totales
de agua
Muestra # 4 Agua embotellada 250 mL filtrados 60
61
62
63
64
Universidad de El Salvador
Facultad Multidisciplinaria de Occidente
Santa Ana, El Salvador. C.A.
Departamento de Ingeniera
Hacia La Libertad por la Cultura

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Los coliformes totales son las

Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos gramnegativos, aerobios

Una elevada proporcin

Dado que es difcil

Dentro del grupo de los coliformes totales existe

Los coliformes fecales son coliformes totales que

Los coliformes fecales comprenden

Su origen es principalmente fecal y por esos se

Pero el verdadero ndice de contaminacin

Desde el punto de vista metodolgico

Los filtros de membrana son filtros de superficie, que

Durante la filtracin las partculas mayores que

Las partculas ms pequeas pueden pasar el

B. Filtracin a travs de membrana

El nmero de coliformes totales

B. Filtracin a travs de membrana

Por lo general, estn compuestos de steres

Despus se incuban las membranas vueltas

B. Filtracin a travs de membrana

En la prctica, la tcnica de filtracin de membrana

B. Filtracin a travs de membrana

Una de las ventajas del mtodo de filtracin a travs

B. Filtracin a travs de membrana

Esta tcnica puede aplicarse en el anlisis de casi

c. Aparatos y tcnicas de filtracin

El aparato de filtracin consiste de un

c. Aparatos y tcnicas de filtracin

Sin embargo, en aguas

D. Volumen de agua analizada

Tipos de agua Coliformes totales

D. Volumen de agua analizada

Para realizar una dilucin 1/10

Para realizar una dilucin

Se utiliza el Caldo Endo para el recuento de coliformes

G. Medio de cultivo selectivo para Coliformes Totales:

El lauril sulfato y desoxicolato que forman parte de la frmula

Las colonias lactosa positivo se colorean de rojo por la

Las colonias de E. coli y de los coliformes muestran

Se utiliza este medio para la identificacin y recuento de coliformes en

Medio slido selectivo, que se prepara en placas para filtracin de

Medio lquido selectivo, que se deposita en placas de cultivo que llevan

Peptona de casena 10,0 g,

pH: 7,2 aproximadamente a 25 C 38

En la placa se coloca sobre el medio de cultivo el

Desenvolver el filtro de la envoltura con la que se ha esterilizado

Separar el embudo de la base del filtro.

El manejo de las membranas se debe realizar con pinzas de punta

Colocar el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la

Filtrar 100 mL de la muestra de agua a travs del filtro. Poner en marcha

Una vez filtrada toda la muestra, parar el sistema de vacio y separar el

Retirar con pinzas estriles o flameadas la membrana filtrante.

Colocar la membrana sobre la placa con la almohadilla absorbente y el

Colocar la tapa de la placa de Petri, invertir la placa e incubar en estufa

En este medio todos los COLIFORMES crecen formando colonias de

Los resultados se expresan en UFC/100 mL.

Expresin de los resultados

Expresin de los resultados

Por otra parte, un nmero de colonias inferior a 10

I. Entrenamiento en la interpretacin de los resultados y los clculos

El resultado del anlisis de esta