CURSO: MICROBIOLOGA AMBIENTAL

LABORATORIO 5:
SIEMBRA, AISLAMIENTO, TRASPLANTE Y OBTENCIN DE
CULTIVOS PUROS DE MICROORGANISMOS
PROFESOR:
MARTINEZ VILA, ALVARO MARTIN

ALUMNA:

HERNNDEZ HUAMAN, MILUSKA

ESPECIALIDAD:
INGENIERA DE HIGIENE Y SEGURIDAD INDUSTRIAL
CODIGO:
20152028J
LIMA-PERU

2015
 LABORATORIO 5
SIEMBRA, AISLAMIENTO, TRASPLANTE Y OBTENCIN DE CULTIVOS
PUROS DE MICROORGANISMOS

I. OBJETIVOS

Aprender los diferentes mtodos de sembrar colonias en medios adecuados para

su desarrollo
Obtencin de colonias de cultivos puros.
Aprender a trasplantar colonias de un medio solido o lquido a otro slido como
es el EMB ENDO, TSA, TSI, caldo nutritivo, agar plate count,etc.

II. FUNDAMENTO TERICO

OBTENCION DE CULTIVOS PUROS: SIEMBRA Y AISLAMIENTO

SIEMBRA O CULTIVO: es la operacin que consiste en depositar aspticamente
microorganismos en un medio de cultivo
Principios Generales
1. Practicar la siembra en medios de cultivos previamente esterilizados y adecuados para
la bacteria que se desea aislar 2. Emplear instrumentos estriles 3. No contaminar ni
destruir los microorganismos 4. Depositar los microorganismos aspticamente en los
medios de cultivo 5. Esterilizar los instrumentos empleados, inmediatamente despus de
cada operacin
Los instrumentos empleados corrientemente en la siembra son:
1. Asa de Siembra: se utiliza alambre de platino, o alambre de una aleacin niquel-cromo
(nicrom) que tiene propiedades semejantes a la primera, con la ventaja de ser de menor
costo. Este alambre tiene un dimetro de 0,3 a1 mm y esta sujeto a un mango o porta asa
metlico o de vidrio. El alambre puede ser totalmente recto (asa en punta o aguja), recto
con un anillo de aproximadamente 3 mm de dimetro en la extremidad (asa) o aplastado
en el extremo (esptula). Puesto a la llama del mechero alcanza rpidamente el rojo blanco
( 1.300C ) y tambin rpidamente se enfra.

2. Pipeta Pasteur: es un tubo de vidrio con una extremidad afilada u cerrada. La otra
extremidad que se encuentra abierta est protegida por una mota de algodn card o
hidrfobo.
La tcnica general de siembra depender de:
a) Estado fsico del material a sembrar (slido o lquido ) b) Estado fsico del medio
de cultivo ( agar o caldo ) c) Ambiente en el cual crece el microorganismo (
aerobiosis, micro aerofilia o anaerobiosis )
SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS
Los medios de cultivo para las bacterias anaerobias poseen en general las mismas
sustancias nutritivas que para las bacterias aerobias, pero es necesario privarlos del O2
libre o en disolucin mediante distintos mtodos:

1.- Mtodos Fsicos:

a) Expulsin del aire por ebullicin: antes de efectuar la siembra, los medios lquidos y
slidos se llevan a ebullicin en bao Mara con el fin de eliminar el aire. Este proceso se
denomina regeneracin de los medios. Esto evita el reoxigenamiento de los medios
lquidos.
b) Reemplazo del aire por gases inertes: este mtodo consiste en la eliminacin del aire,
mediante bomba de vaco, del recipiente que contiene los medios sembrados y su
reemplazo por Hidrgeno, Nitrgeno, CO2, etc.
2. Mtodos Qumicos:
a) Sustancias reductoras txicas para las bacterias, por cuyo motivo no se adicionan a los
medios de cultivo, sino que en un lugar adecuado del recipiente que contiene los tubos
sembrados. Se utiliza principalmente Acido Piroglico o Hidrxido de potasio
b) Sustancias reductoras no txicas que se agregan directamente a los medios de cultivo,
por ejemplo Glucosa al 1-2%, Tioglicolato de sodio 0. 1 0.2%, Cistina al 0.05% entre
otros.

3. Mtodos Biolgicos:
a) Tejidos animales que se adicionan a los medios de cultivo, como por ejemplo: carne
picada, cerebro, hgado, etc.
AISLAMIENTO Y TRANSPLANTE (TRASPASO)
Cuando se realiza una siembra en medios slidos es deseable obtener las bacterias en
forma asiladas. Sin embargo, generalmente las muestras tienen una flora mixta, que se
manifiesta por el desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprfitas (flora
normal) o contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol
patgeno.
Para realizar diagnsticos microbiolgicos el organismo debe ser primero aislado y
mantenido puro en condiciones de laboratorio.
Si en la placa de agar ha crecido ms de un tipo de bacterias, se debe realizar el
aislamiento de 1 colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.
Si fuese necesario las colonias se sometern a uno o ms re-aislamientos, hasta obtener
cultivos puros; es decir, presenten la misma morfologa y microscpicamente
correspondan a un solo tipo de bacteria.
Slo en este momento se puede proceder a la identificacin de la especie bacteriana
mediante el traspaso de 1 sola colonia a una batera de medios diferenciales.
El aislamiento de los microorganismos se puede conseguir por los siguientes
procedimientos:

1. Mtodos Mecnicos
1.1. Aislamiento por diseminacin o agotamiento: consiste en efectuar estras sobre la
superficie del agar, utilizando un asa de cultivo, sin pasar 2 veces por el mismo lugar.
Tcnicas de aislamiento por estriacin:
Uno de los mtodos utilizados es el siguiente (Figura 10): - El inoculo se extiende sobre
una pequea superficie del agar - Se flamea el asa y se trazan 3 lneas oblicuas a partir
del depsito original ( sin pasar el asa 2 veces por el mismo sitio ) - Flamear el asa, girar
la placa levemente en sentido de las manecillas del reloj y volver a trazar 3 lneas de la
misma forma anterior - Flamear el asa, girar la placa levemente en sentido de las
manecillas del reloj y volver a trazar 3 lneas de la misma forma anterior - Flamear el asa,
girar la placa levemente en sentido de las manecillas del reloj y volver a trazar 3 lneas de
la misma forma anterior - Flamear el asa y trazar una estriacin en forma de zig-zag sobre
la superficie del agar que ha quedado libre.

III. MATERIALES

Tubos de ensayo
Asa de siembra
Mechero
Incubadora
Placas Petri
Medios de cultivo (nutritivo, TSA, EMB, ENDO, Manitol Salado, Enterococo)

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1) Trasplantar del caldo nutritivo al agar TSA (medio solido), previamente habiendo
esterilizado el asa de Siembra con el mechero y siempre teniendo fuego cerca para
evitar la contaminacin con el medio ambiente.

Las muestras del caldo nutritivo son las que se realizaron en el laboratorio
04.RIO 04 MICRO
Los tubos con el agar TSA ya haban sido preparadas, y para aislar las colonias
trasplantadas dentro del agar se usa el mtodo de aislamiento por estras en la
superficie.
 2) Sacar los medios (preparados por el profesor) del bao mara:

AGAR NUTRITIVO
MANITOL SALADO
EMB
ENDO
ENTEROCOCO
Luego es llevado a la incubadora por 48 horas a 35 37 C.

2.1) Verter una cierta cantidad de agar en cada una de las placas Petri dadas por
el profesor. A partir de los 11 tubos Positivos y la muestra bucal obtenidos del
laboratorio 03.Rotular.

Medios N de placas

2.2) Usar la Tcnica De Aislamiento Por Estras (mtodo explicado en el

fundamento terico) en cada seccin de la placa a usar.
Esterilizar siempre el asa de siembra.
Tener el mechero encendido.
Cada vez que terminamos con un sector volver a esterilizar.
Hacer el mismo procedimiento para cada muestra de la misma manera para
cada placa.

3) Una vez terminado, voltear las placas Petri y llevar a la incubadora por 48 horas a
35 37 C.

Disponibles
(Grupo de carne)

Tipo de Nutritivo Manitol EMB ENDO Enterococo

medio Salado

Secciones a 3O4 3 O4 43 4O3 4O3

dividir
(con ayuda
de un
marcador)
ATORIO

V. BIBLIOGRAFA

https://es.wikibooks.org/wiki/Microbiolog%C3%ADa/Obtenci%C3%B3n_
de_cultivos_puros:_siembra_y_aislamiento