OBJETIVOS

Determinar el comportamiento y la variabilidad enzimtica de la tirosinasa, bajo diferentes

parmetros fsicos y qumicos (pH, temperatura y concentracin)

MARCO TERICO

Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin. Actan en
condiciones muy suaves, a temperatura por debajo de 70C, con un PH de 7.Tienen un alto
Grado De Especificidad, solamente catalizan la reaccin en que participa un sustrato o un grupo
de sustratos con ciertas caractersticas qumicas y geomtricas comunes.

Sustrato es una molcula sobre la que acta una enzima. El sustrato se une al sitio activo de la
enzima, y se forma un complejo transformado en enzima-sustrato. El sustrato por accin de la
enzima es producto y es liberado del sitio activo, quedando libre para recibir otro sustrato.

ESPECIFICIDAD, SITIO ACTIVO Y GRUPOS CATALTICOS

Las enzimas se unen a los sustratos por medio de interacciones hidrofbicas y electrostticas,
puentes de hidrgeno y fuerzas de van der Waals. Los residuos de aminocidos de la enzima
que participan en la interaccin con el sustrato estn alejados unos de otros; pero como
resultado de la unin del plegamiento de la protena, se agrupan para formar el sitio activo de la
enzima. Algunos residuos participan solo en la unin del sustrato y definen una regin del sitio
activo que se llama sitio de fijacin o de unin de los sustratos. Los catalticos (residuos), se
encargan de la transformacin del sustrato en producto. Normalmente, el nmero de residuos
que intervienen en la unin del sustrato es mayor que el de residuos catalticos. Debido al
plegamiento de la protena, su localizacin se encuentra en los surcos o huecos de la superficie
de la encima.
COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO

La unin del sustrato a la enzima se puede explicar por medio de dos mecanismos:

Modelo De La Llave Y La Cerradura: Considera que el sitio activo de la enzima est

preformado, de tal manera que los residuos de aminocidos mantienen una posicin fija y
complementaria a los grupos del sustrato.
La isoenzima presente en las lgrimas es capaz de hidrolizar uno de los polisacridos presentes
en las paredes bacterianas, es uno de los pocos casos que se adapta a este modelo

Modelo Del Ajuste Inducido: Se propone que al interactuar el sustrato con la enzima se
inducen cambios conformacionales en sta, que dan lugar a la formacin del sitio activo. Se
ha dicho que la enzima asemeja a un guante vaco, y la presencia del sustrato equivale a
introducir la mano en el guante, con lo que da la forma precisa al sitio activo.

CINETICA ENZIMATICA

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de
la especificidad del enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede
medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el
enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia
de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la
velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede
determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en funcin del

tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccin, o simplemente, la cintica de la
reaccin. A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va
disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reaccin. Para evitar esta
complicacin se procede a medir la velocidad inicial de la reaccin (v0). La velocidad inicial de la
reaccin es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta forma, la medida
de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda
considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Adems, en estas
condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa, ya que la cantidad de producto
formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican
enormemente las ecuaciones de velocidad.
TIROSINASA

En esta prctica, se va a extraer la enzima tirosinasa y se har el estudio de sus parmetros

cinticos. Esta es slo una de miles de enzimas que trabajan dentro de las clulas, pero que
fcilmente se muestran las caractersticas principales de la cintica enzimtica. Esta prctica
implica el aislamiento (extraccin) de la enzima tirosinasa a partir de la papa y la posterior
medicin de su actividad. La tirosinasa es una enzima de tipo oxidorreductasa la cual cataliza la
hidroxilacin de monofenoles y la oxidacin de o-difenoles a o-quinoles, reacciones que
convierten a la enzima en clave para la sntesis de pigmentos, como es el caso de la melanina,
tanto en eucariotas como en procariotas.

El pardeamiento enzimtico es una reaccin de oxidacin en la que interviene como sustrato el

oxgeno molecular, catalizada por un tipo de enzimas que se puede encontrar en prcticamente
todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre. En el hombre es la responsable de la
formacin de pigmentos del pelo y de la piel. En los cefalpodos produce el pigmento de la
tinta, y en los artrpodos participa en el endurecimiento de las cutculas del caparazn, al
formar quinonas que reaccionan con las protenas, insolubilizndolas. En los vegetales no se
conoce con precisin cul es su papel fisiolgico.

El enzima responsable del pardeamiento enzimtico recibe el nombre de polifenoloxidasa,

fenolasa o tirosinasa, en este ltimo caso especialmente cuando se hace referencia a animales,
ya que en ellos la tirosina es el principal substrato1. Tambin se ha utilizado el trmino
cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. Se descubri primero en los championes, en los
que el efecto de pardeamiento tras un dao mecnico, como el corte, es muy evidente.

En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimtico puede ser un problema muy serio en
frutas, championes, papas y otros vegetales, y tambin en algunos crustceos, e incluso en la
industria del vino, al producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los
productos, o incluso los hacen inaceptables para el consumidor. Estas prdidas son muy
importantes en el caso de las frutas tropicales y de los camarones, productos trascendentales
para la economa de muchos pases poco desarrollados.

A pesar del nombre genrico de pardeamiento, los colores formados son muy variables,
marrones, rojizos o negros, dependiendo del alimento y de las condiciones del proceso. En
algn caso, como en las pasas, otras frutas secas, la sidra, el t o el cacao, el pardeamiento
enzimtico contribuye al desarrollo de los colores caractersticos de estos productos, aunque
como se ha indicado, en otros muchos constituye un problema grave. Adems de la alteracin
del color, los productos formados pueden reaccionar con las protenas, insolubilizndolas. Por
otra parte, puede producirse tambin una prdida nutricional, ya que aunque la
polifenoloxidasa no oxida directamente al cido ascrbico, esta vitamina puede destruirse al
reaccionar con intermedios de la reaccin.

El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce fundamentalmente mediante

la compartimentalizacin de los sustratos. El enzima se encuentra en los plstidos y cloroplastos
(en los vegetales superiores), y tambin en el citoplasma celular, mientras que los compuestos
fenlicos que pueden servir de sustratos se acumulan en vesculas. Cuando se rompe la
compartimentalizacin por un dao mecnico, como el triturado, corte o congelacin y
descongelacin, la reaccin de pardeamiento se puede producir. Tambin se produce la
inhibicin del enzima por los productos de la reaccin.

Adems de manteniendo la compartimentalizacin, la reaccin de pardeamiento se puede

frenar actuando sobre diferentes factores:

Evitando el contacto del oxgeno con la superficie de corte

Bajando al temperatura
Reduciendo el pH
Desnaturalizando el enzima
 DATOS Y RESULTADOS

Absorbancia Mililitros de extracto enzimtico

Tiempo (seg) 1,0 1,5 2,0 2,5

0 0,164 0,088 0,49 0,37

20 0,178 0,199 0,542 0,444

40 0,182 0,259 0,537 0,439

60 0,186 0,293 0,528 0,436

80 0,193 0,304 0,518 0,437

100 0,179 0,305 0,509 0,429

120 0,170 0,294 0,498 0,423

150 0,161 0,284 0,491 0,421

180 0,144 0,272 0,482 0,412

Actividad enzimatica - Diferentes concentraciones de enzima

0.6

0.5

0.4 Actividad
Absorbancia

enzimatica normal
0.3 1.5 ml

0.2
2.0 ml

0.1
2.5 ml
0
0 50 100 150 200
Tiempo (seg)
 PH

Absorbancia

Tiempo (seg) 3,0 6,0 10,0

0 0,326 0,106 0,626

20 0,347 0,156 0,703

40 0,371 0,217 0,755

60 0,394 0,239 0,768

80 0,404 0,249 0,831

100 0,413 0,269 0,853

120 0,420 0,311 0,868

140 0,427 0,354 0,878

160 0,434 0,371 0,883

180 0,326 0,106 0,626

Actividad enzimatica - Diferentes pH

1
0.9
0.8
0.7
Absorbancia

0.6 pH 3.0
0.5 pH 6.0
0.4 Actividad enzimatica normal
0.3
pH 10.0
0.2
0.1
0
0 50 100 150 200
Tiempo (Seg)
 Absorbancia Temperatura

Tiempo (seg) 2C 37C 60C

0 0,323 0,059 0,626

20 0,474 0,146 0,703

40 0,558 0,188 0,755

60 0,610 0,207 0,768

80 0,623 0,213 0,831

100 0,624 0,211 0,853

120 0,621 0,202 0,868

150 0,620 0,190 0,878

180 0,619 0,164 0,883

Actividad enzimatica - Diferentes temperaturas

1
0.9
0.8
2C
0.7
Absorbancia

0.6
Actividad
0.5
enzimatica normal
0.4
0.3 37C
0.2
0.1
60C
0
0 50 100 150 200
Tiempo (Seg)
 DISCUSION DE RESULTADOS

Al analizar las diferentes graficas resultantes de los datos obtenidos durante la experimentacin
con la tirosinasa y los diferentes factores que podran provocar la alteracin de su actividad
enzimtica, se puede apreciar una variacin demasiado grande entre la actividad enzimtica
normal y los dems experimentos tanto en la grafica de la influencia de la temperatura, como
en la grafica de la influencia del PH, en el caso de la variacin por concentracin de enzima no se
ve un resultado esperado, que la variacin de la actividad enzimtica va creciendo a mayor
concentracin de la enzima, esto no se dio, ya que un grupo realizo la extraccin de la enzima
con otra papa diferente a la usada por los de mas grupos, por esta razn no se da el
comportamiento esperado en la experimentacin (grfica 1 - concentracin de enzima 2.5);
donde la actividad de la enzima no fue creciendo a mayor concentracin de la enzima

Para las otras dos graficas esta gran variacin podra explicarse debido a que fue realizada por
diferentes grupos de trabajo por lo cual a pesar que se utilizaron iguales volmenes, la
concentracin del extracto enzimtico podra variar al igual que las condiciones a las cual se
mantuvo este antes de iniciar las mediciones en el espectrofotmetro y las medidas todas
realizadas en diferentes espectrofotmetros, la suma de todas estas diferentes condiciones
puede explicar porque varia de forma tan significativa la actividad enzimtica normal con las
dems condiciones, cuando a pesar que debera haber una modificacin no debera ser tan
grande.

En el caso del pH es tambin un resultado esperado pues a pesar que la curva para el PH bsico
est por encima de las dems, la pendiente de la curva que hace referencia a la actividad
enzimtica es superior para el PH de 6 y la tirosinasa lo cual est dentro del rango de PH optimo
para la tirosinasa.

Para el caso de la Temperatura se observa un crecimiento y posterior decrecimiento en todas

las curvas aunque con mayor evidencia en el comportamiento a baja temperatura, a pesar que
en este caso se esperaba un resultado similar por datos reportados de experimentos anteriores
no hay claridad en el porqu de estos resultados ya que a una baja temperatura la enzima se
debera ver inhibida en su gran mayora y en las corvas de temperatura ambiente y temperatura
fisiolgica, es poco comn que se observe un decrecimiento en la actividad enzimtica aunque
como se presento solo en las mediciones hechas con uno de los espectrofotmetros esto puede
deberse a una falla instrumental.
Podemos darnos cuenta de que en la grafica que corresponde a los 2C no obtuvimos una lnea
recta sino una curva, lo que hace suponer que en un principio, cuando la muestra se encuentra
a bajas temperaturas se produce un incremento de absorbancia, y con el transcurso de la nueva
medida de absorbancia, la muestra alcanza nuevamente la temperatura ambiente, por lo tanto
hay una disminucin de absorbancia, lo que indica un aumento en la actividad enzimtica. De
acuerdo a esto y a las lneas que en la grfica corresponden a 37 y 60C afirmamos que la mayor
actividad se lleva a cabo en la muestra sometida a 60C, (a pesar de que esta medida se tomo
de la extraccin de otra papa diferente a la trabajada por los dems grupos), como era de
esperarse.
 PREGUNTAS

1. La enzima acta mejor a pH cido, bsico o neutro?

La actividad enzimtica a diferentes PH es muy diferente para los diferentes tipos de enzimas,
existen enzimas que presentan mayor actividad a PH acido, esto depende de la cantidad de
grupos amino que posea , y existen enzimas que operan mejor a PH bsico, esto depende de la
cantidad de grupos carboxilo que existen en la enzima que es superior a cualquier otro grupo
funcional; cada enzima adems posee un PH optimo donde presenta su mayor actividad
enzimtica; para el caso especfico de la tirosinasa aunque presenta mayor actividad enzimtica
en PH acido no es un valor muy bajo (PH aprox. 5.5) pues en PH bsicos se disminuye su
actividad enzimtica pero a un PH demasiado acido tambin se ve disminuida de forma
significativa su actividad enzimtica.

2. Explique cmo afecta la concentracin de enzima la actividad enzimtica

La concentracin de enzima afecta la actividad enzimtica de forma directamente proporcional,

ya que entre mayor es la cantidad de enzima, se ve aumentada la cantidad de sustrato que
puede reaccionar simultneamente.

3. La enzima acta mejor a temperaturas bajas, ambiente o fisiolgicas?

La actividad enzimtica se ve afectada por la temperatura de igual manera para cualquier

enzima, aunque la temperatura optima de cada enzima es diferente, siempre presenta un
comportamiento similar, por debajo de la temperatura optima va disminuyendo su actividad
hasta llegar a la inhibicin total de la enzima y cuando se supera la temperatura optima se
empieza a presentar un desdoblamiento en la enzima lo cual genera que se desactive de forma
permanente.

4. Documntese sobre el mecanismo cataltico de la tirosinasa y responda lo siguiente:

Como pueden los pH cidos y bsicos influenciar sobre la actividad Enzimtica?

Muchas enzimas presentan su actividad mxima en estrechos intervalos de pH, la exposicin a

valores de pH por fuera del intervalo, puede conducir a la prdida irreversible de actividad.

Algunos factores importantes a tener en cuenta al momento de escoger la solucin

amortiguadora para la extraccin de la enzima son los siguientes:
 El intervalo de pH en donde la enzima tendr su mayor actividad
La fuerza inica y la temperatura que pueden afectar la solucin buffer.
La solucin no debe afectar la actividad de la enzima ya sea por efectos quelantes o por
interferencias en etapas posteriores de purificacin.
La solucin buffer no debe interferir con el mtodo de cuantificacin.

Tanto un pH cido uno bsico afectaran los grupos funcionales de la Tirosinasa (Histidina), y
oxidar o reducir el Cobre, que se encuentra en el ncleo de esta enzima, lo cual afectara su
actividad enzimtica.
 BIBLIOGRAFA

Christopher K. Mathews, Kevin G. Ahern, K. E. Van Holde 2002 Bioquimica, 3a edicin,

Madrid.
Koolman R. Rohm K. Bioqumica, Texto y atlas. Tercera edicin. Editorial medica
panamericana.
Sadava D. Vida, la ciencia de la biologa. Octava edicin. Editorial medica panamericana.
S. Tuncagil, S.K. Kayahan, G. Bayramoglu, M.Y. Arica, L. Toppare, l-Dopa synthesis using
tyrosinase immobilized on magnetic beads. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 58
(2009) 187-193.
Solari, A. J. Gentica humana: Fundamentos y aplicaciones en medicina. 3era Ed. Buenos
Aires: Mdica Panamericana 2007. Pg 463.