TECNOLGICO NACIONAL DE MXICO

INSTITUTO TECNOLGICO DE OAXACA

DEPTO. DE INGENIERA QUMICA Y BIOQUMICA

Microbiologa ambiental
COF16101

PRACTICA 4&5

Aislamiento de microorganismos por el mtodo de diluciones:

Empleando mtodos de cultivo agar cuenta estndar, y agar dextrosa
saboroad

Jimarez Rodrguez Mara Magdalena

Hernndez Gaytn Miguel David

Martnez santos Gabriel

Buy Ponce Diego

 Grupo QA

Octubre de 2017
OBJETIVO:

Realizar la teora bsica de diluciones decimales en aislamiento de

microorganismos del suelo (bacterias) en un agar cuenta estndar
Realizar la teora bsica de desarrollo para la siembra por diluciones en medio
selectivo por hongos en un agar de dextrosa saboroad.

INTRODUCCIN:

Fundamento
En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se encuentran
diversos microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es
decir la separacin de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra.

Existen diversos mtodos para conseguir esta separacin, la mayora de ellos basados
en la inmovilizacin de las clulas microbianas en la superficie de los medios de cultivo
slidos. Al depositar una clula bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo,
sta quedar inmovilizada en ese punto y en l se reproducir por absorcin de los
nutrientes del medio. Las nuevas clulas generadas permanecern igualmente inmviles y
tras sucesivas generaciones conformarn lo que denominamos una "colonia" que no es
ms que un montn de clulas derivadas de una sola clula madre inicial, es decir, un clon
de la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es visible al ojo humano y
presenta diferentes caractersticas segn el microorganismo que la genera. Esto nos
permite distinguir las diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en la muestra
sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un nuevo medio de cultivo
estril, a estos cultivos los consideraremos "puros" por poseer un slo tipo de
microorganismo. (El fundamento es vlido teniendo en cuenta slo microorganismos
cultivables)
Objetivos

Distinguir los conceptos de cultivo puro y cultivo mixto.

Aplicar tcnicas de aislamiento para la localizacin de microorganismos concretos en
muestras contaminadas o con flora mixta.
Aplicar las tcnicas del agotamiento y las estras escocesas como las ms habituales en
aislamiento de microorganismos cultivables.
Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los microorganismos.

Tcnicas de aislamiento. Se realiza un aislamiento de los microorganismos presentes en

un cultivo mixto en caldo ordinario, sobre agar nutritivo. Se siembran dos placas de agar
nutritivo, una mediante la tcnica del agotamiento de asa y otra mediante la de estras
escocesas.

Estas tcnicas pretenden diluir la carga microbiana que se deposita sobre el medio de
cultivo de forma que, en los ltimos trazos de la siembra, haya tan pocas clulas que queden
suficientemente separadas unas de otras y puedan desarrollar colonias independientes.

Tcnica de aislamiento y recuento: el banco de diluciones. Se realizan una serie de

diluciones seriadas a partir del cultivo mixto Con esta tcnica conseguimos adems de
aislar colonias, obtener un recuento del nmero de bacterias que tenemos en el cultivo

(Sites-Google, 2011)

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por

una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo
al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como

mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern
necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de
estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de
electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne,

extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas
sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los factores
nutritivos lbiles.

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar

peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn
ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas
naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de
nitrgeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos
medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser
necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,
manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de
naturaleza vitamnica.

Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de
ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores
selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos

como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o
slido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de
fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero
hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el
laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal.
Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los
microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una
atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos
microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin
de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo
capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible
para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que
prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C
proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para
el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia

de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos
fotosintticos.

6- pH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro,
aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la
presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano
pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C.

Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los termfilos a 80C o incluso a temperaturas
superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos
de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saprofitos tienen rangos ms
amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de
formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para
esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como
agente esterilizante) (Wilkinson, 1976)

ACTIVIDADES

Vaciar medio de cultivo agar cuenta estndar con la caja Petri

Asilar microorganismos del suelo por el mtodo de disolucin

Pesar un gramo de suelo

Marcar tubos de ensaye a utilizar

 Agregar 1 gr de suelo al tubo marcado 1

Hacer disoluciones decimales en los dems tubos.

DESARROLLO:

Materiales a utilizar:

Material esterilizado: Pipetas, cajas Petri, tubos de ensaye (con 4.5 ml) de
agua estril.

Mechero de alcohol

Alcohol, algodn para asegurar el rea.

Campana de flujo.

PROCEDIMIENTO:

Se prepararon dos medios de cultivo, uno empleando agar cuenta estndar y otro
agar dextrosa saboroad. Ambos son vertidos en cajas Petri, anteriormente en este
laboratorio ya se haban generado tales procesos para as tener listos nuestras
cajas Petri.

Para el agar cuenta estndar, se pesa 0.5 g de suelo, para el agar dextrosa
saboroad se pesa 1 g de suelo.
En agar cuenta estndar se emplean 4 tubos de ensaye con 4.5 ml de agua
destilada los cuales previamente haban sido ingresados en el autoclave, para agar
dextrosa saboroad se emplean 4 tubos pero con 9 ml de agua, de igual manera
previamente usando el uso correcto y practico del autoclave.
Teniendo nuestros tubos enumerados del uno al cuatro. En el tubo nmero uno se
agrega toda la tierra que se pes, en cuenta estndar tubo uno de 4.5 ml se agregan
los 0.5 g de suelo mientras en agar dextrosa saboroad el tubo uno de 9 ml se agrega
el suelo pesado de 1 g.

En esta parte se debe tener mucho cuidado y poner atencin, ya vaciado el suelo
se generaran alcuotas similares apoyndose de las pipetas (De igual manera
previamente esterilizadas en el autoclave), en el tubo 2 se agregan 0.5 de solucin
del tubo 1. En el tubo 3 se agregaran 0.5 de solucin del tubo 2, y finalizando en el
tubo 4 se agregan 0.5 de solucin del tubo 3, esto es para el caso del suelo
empleado en el cultivo del agar cuenta estndar. Para el agar dextrosa saboroad se
repite el mismo procedimiento, solo que; las alcuotas extradas del tubo anterior al
tubo siguiente sern de 1 ml de solucin.

Se procede a usar la campana de flujo, primero se esteriliza con la ayuda de algodn

y alcohol industrial.

Dentro de la campana usando las pipetas se tomara una gota de solucin de cada
tubo, para cada caja Petri.
En el caso de los tubos 2 para agar cuenta estndar y agar dextrosa saboroad se
generara un cultivo. Para los tubos 3 y 4 de agar cuenta estndar y agar dextrosa
saboroad se harn dos cultivos.

Entonces se toma una muestra, todo este proceso dentro de la campana de flujo
donde se asegura que es un medio aislado. Se deposita en la caja Petri la muestra,
y teniendo el mechero adentro, con una placa de vidrio se pone al fuego, se espera
a que se enfri y entonces se distribuye la muestra por todo el agar con la placa de
vidrio, poner de nuevo la placa al fuego para que, por medio de la esterilizacin
directa de incineracin sea efectiva. El
paso se repite, y los cultivos estn
listos. Se depositan en una zona
segura o en una cmara especial que
resguarde nuestras muestras. Para
una mayor vialidad se recubren las
cajas Petri con papel plstico o un
material capaz de asegurar un cierre

hermtico.

RESULTADOS:

Despus de un da transcurrido de haber

empleado el cultivo en ambos agares podemos
denotar, la generacin de colonias en ambos
agares.
Conclusiones:

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia

en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los
primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios
de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos
de inflexin en su evolucin. Los medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio
de Bacteriologa, son instrumentos de suma importancia en la dignosticacin de
bacterias patgenas dentro de los individuos. Los medios de cultivo son un mtodo
fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o en la
superficie de un medio
REFERENCIAS:

Sites-Google. (2011). Practicas de Laboratorio. Obtenido de

https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/tecnicas-de-
aislamiento

Wilkinson, J. F. (1976). Introduccin a la Microbiologa . Madrid: H. Blume Ediciones.