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Microscopa confocal

Juan Carlos Rodrguez [1] Roy Sols Snchez [2] John Steven Umaa [3]
jcrodruf5@gmail.com1 /royxno308@gmail.com2/jsteuma@gmail.com3
Instituto Tecnolgico de Costa Rica
Capas Delgadas y Procesamiento de Semiconductores
II Semestre 2017, Profesor: Jos Alberto Ramrez

Resumen

Se realiz un estudio de los principales aspectos de la microscopa confocal, sus fundamentos fsicos,
variables y aplicaciones. Adems, se estudiaron los principales componentes de los microscopios
confocales, as como, las distintas variaciones que estos presentan. Finalmente se hizo un recuento
de las principales aplicaciones en las que se puede utilizar este tipo de microscopa.

Abstract
A study was made of the main factors of confocal microscopy, its physical foundations, variables and
applications. In addition, it was studied the main components of confocal microscopes, as well as the
various variations they present. Finally, an account was made of the main applications in which this
type of microscopy can be used.
Introduccin exploracin de alta eficiencia, fibra ptica de
La microscopa confocal es una poderosa alto rendimiento, mejores recubrimientos
herramienta que crea imgenes ntidas de un dielctricos de pelcula delgada y detectores
espcimen que de otro modo aparecera con caractersticas de ruido reducidas.
borrosa cuando se mira bajo un microscopio Adems, se comenzaron a sintetizar
convencional. Esto se consigue excluyendo la fluorocromos que estaban ms
mayor parte de la luz de la muestra que no es cuidadosamente adaptados a las lneas de
del plano focal del microscopio. La imagen as excitacin lser. Junto con el avance rpido de
obtenida tiene menos turbidez y mejor las velocidades de procesamiento de la
contraste que la de un microscopio computadora, las pantallas mejoradas y la
convencional y representa una seccin delgada tecnologa de almacenamiento de gran
de la muestra. La microscopa confocal de volumen que surgieron a finales de los 90, se
barrido por lser se ha convertido en una estableci el escenario para una explosin
herramienta invaluable para la obtencin de virtual en el nmero de aplicaciones que
imgenes de secciones pticas delgadas en podran ser dirigidas con microscopa confocal
especmenes vivos y fijos con un espesor de de barrido lser. [1,2]
hasta 100 micrmetros. De hecho, el
microscopio confocal suele ser capaz de
revelar la presencia de una sola molcula. Los
microscopios confocales modernos han
mantenido los elementos clave del diseo de
Minsky: las aberturas de pinole y la
iluminacin punto a punto del espcimen.
Durante los aos noventa, los avances en
ptica y electrnica proporcionaron lseres
ms estables y potentes, unidades de espejo de
microscopio confocal se logra escaneando uno
o ms haces de luz enfocados, usualmente
desde un lser o una fuente de descarga de
arco, a travs de la muestra. Este punto de
iluminacin es llevado a enfocar en el
espcimen por la lente de objetivo, y
escaneado lateralmente usando algn tipo de
dispositivo de exploracin bajo control por
ordenador. Las secuencias de puntos de luz de
la muestra son detectadas por un tubo
fotomultiplicador (PMT) a travs de un
agujero de alfiler (o en algunos casos, una
Figura 1: imagen de una capa delgada de hendidura) (Fellers y Davidson, 2007), y la
grafeno crecida por CVD con microscopio salida de la PMT se construye en una imagen y
confocal. [2] que se muestra en el ordenador. [2]

Los microscopios confocales modernos Aunque los especmenes sin color pueden ser
pueden ser considerados como sistemas vistos usando la luz reflejada de ella, la
electrnicos completamente integrados donde mayora de las veces los especmenes estn
el microscopio ptico desempea un papel marcados con una o ms sondas fluorescentes.
central en una configuracin que consiste en Se utiliza un lser para proporcionar la luz de
uno o ms detectores electrnicos, un excitacin (con el fin de obtener intensidades
ordenador (para la visualizacin de la imagen, muy altas). La luz lser se refleja en un espejo
procesamiento, salida y almacenamiento) y dicroico golpea dos lentes montadas en los
varios sistemas lser combinado con motores. Estos espejos exploran el lser a
dispositivos de seleccin de longitud de onda y travs de la muestra, el tinte en la muestra
un conjunto de exploracin de haz. En la fluoresce y la luz emitida es descentrada por
mayora de los sistemas avanzados, la los mismos espejos que se usan para escanear
integracin entre los varios componentes es la luz de excitacin del lser. La luz emitida
tan minuciosa que el microscopio confocal pasa a travs del espejo y se centra en el
entero a menudo se refiere colectivamente agujero. La luz que pasa a travs del orificio es
como una imagen digital o video, capaz de medida por un detector, es decir, un tubo
producir imgenes electrnicas. Estos fotomultiplicador. Por lo tanto, nunca hay una
microscopios se estn utilizando ahora para las imagen completa de la muestra en un instante
investigaciones de rutina sobre las molculas, dado; slo se ve un punto de la muestra. El
las clulas y los tejidos vivos que no eran detector est conectado a una computadora
posibles hace apenas unos aos. [1] que construye la imagen, un pxel a la vez. [3]

Principio fsico Anteriormente, una formacin de imagen de


512x512 pxeles podra hacerse probablemente
Los instrumentos actuales estn altamente 3 veces por segundo debido a la limitacin en
modificados desde las primeras versiones, los espejos de exploracin. Posteriormente,
pero el principio de la imagen confocal para acelerar el escaneado se utiliz un
desarrollado por Marvin Minsky se emplea en deflector ptico acstico especial (AOD) en
todos los microscopios confocales modernos lugar de uno de los espejos. AOD utiliza una
(Minsky 1961, 1988). La imagen en un onda de sonido de alta frecuencia en un cristal
especial para crear una rejilla de difraccin, pueden daar la muestra y, en el caso de la
que desva la luz lser. Variando la frecuencia fluorescencia, degradar tambin la fluorforo.
de la onda sonora, el AOD cambia el ngulo [4]
de la luz difractada, permitiendo as una
exploracin rpida que conduce a imgenes de Por otra parte, se ha demostrado que la
512x480 pxeles 30 veces por segundo. Si uno seccin ptica no mejora considerablemente
mira un campo de visin ms pequeo, con el tamao del orificio por debajo de un
entonces el proceso puede ser an ms rpido lmite, que se aproxima al radio del primer
(hasta 480 fotogramas por segundo). [3] cero del disco Airy. Por lo tanto, una
aproximacin fina es hacer el agujero de alfiler
sobre el tamao del disco Airy. La imagen de
fluorescencia confocal usando el agujero de
alfiler junto con la ptica anterior redujo
significativamente la intensidad de la emisin
que llega al detector. Con el avance en la
tecnologa, el uso de fotodetectores para
capturar la luz de la sensibilidad de la imagen
confocal se ve reforzada. Por lo tanto, la
sensibilidad del detector y el comportamiento
del ruido son de vital importancia. La
sensibilidad se caracteriza por la eficiencia
cuntica. Es decir, la precisin de la medicin
se mejora al aumentar el nmero de fotones
que llegan al detector. [4]
Figura 2: Diagram bsico de un microscopio
lser confocal Aplicaciones

La capacidad de corte ptico (la velocidad a la Las aplicaciones de la tcnica son muy
que la intensidad detectada disminuye en la numerosas principalmente dentro de la ciencia
direccin axial) de un microscopio confocal biomdica: biologa celular, biologa molecular,
depende del agujero de alfiler y su capacidad fisiologa, etc. Ya que permite identificar y
para rechazar los rayos de luz fuera de foco, es localizar componentes moleculares especficos
decir, la resistencia de la seccin ptica con la particularidad de que al no ser una
depende fuertemente del tamao del agujero tcnica destructiva permite una observacin in
de alfiler. Por lo tanto, se puede suponer que vivo [5]. Adems, permite un nuevo
hacer el agujero de alfiler tan pequeo como conocimiento de la estructura celular y sus
sea posible es la mejor manera de mejorar el procesos. Entre
corte ptico. Sin embargo, a medida que se otras aplicaciones la microscopa confocal se
reduce el tamao del agujero, se bloquea un utiliza en: estudios de estructura celular y
gran nmero de fotones que llegan al detector citoesqueleto, medida de actividad intracelular
desde la muestra. Esto puede conducir a una (pH e iones), produccin de reconstrucciones
relacin seal-ruido reducida. Para compensar tridimensionales, etc [6].
la seal ms dbil se necesita ms fluorescencia
de la muestra pero esto se puede hacer hasta Dentro de la ciencia de materiales tambin
un lmite (elevando la intensidad de la luz de encuentra aplicacin en la observacin de la
excitacin), por el contrario altas intensidades morfologa o los defectos en slidos como
componentes microelectrnicos, polmeros, necesidad de realizar complejas preparaciones.
resinas, depsitos, minerales, cermicas,
metales, etc. As como el estudio de perfiles de Para realizar secciones transversales de calidad
superficie y rugosidad. [5] necesitamos contar con una platina
motorizada de alta precisin que nos permita
A continuacin se describen brevemente realizar desplazamientos verticales en
algunas aplicaciones: intervalos muy pequeos, del orden de 0,2
micras. Fijando el haz de barrido del lser en el
Imgenes teidas con un marcador punto en el que queremos realizar la seccin y
fluorescente (single labeling). desplazando la muestra verticalmente iremos
obteniendo un corte transversal de esa zona.
Imgenes de una muestra con [6]
autofluorescencia o que estn teidas con un
nico marcador fluorescente, visualizadas con Informacin tridimensional de la muestra.
microscopa confocal presentan una
considerable mejora en relacin a la misma Como se ha mencionado anteriormente una de
imagen visualizada con microscopa de las mayores ventajas de la microscopa
fluorescencia convencional. [6] confocal es la posibilidad de estudiar
tridimensionalmente la muestra a partir de
Imgenes teidas con varios marcadores secciones pticas de la misma. Para ello se fija
fluorescentes (multiple labeling). la posicin de barrido del microscopio en un
extremo de la estructura a medir y se van
Mltiples estructuras de una clula o tejido tomando imgenes, correspondientes a
pueden ser observadas simultneamente diferentes secciones de la misma, hasta llegar
tiendo la muestra con dos o ms marcadores al otro extremo. Integrando las imgenes
fluorescentes, donde cada fluorocromo marca tomadas en los diferentes planos focales, es
una determinada estructura o sirve como posible
indicador de determinados procesos celulares. obtener una imagen de la informacin
El microscopio confocal suele venir equipado tridimensional en foco. [6]
con uno o varios lser que emiten en
diferentes longitudes de onda pudiendo Reconstruccin tridimensional.
utilizarse varias de ellas como fuente de
iluminacin de la muestra. Si tenemos una La imagen estereoscpica suministra
muestra con dos o tres marcadores informacin tridimensional de la muestra
fluorescentes podremos recoger desde un punto de vista esttico y en una
simultneamente su seal en diferentes determinada direccin. Un mtodo mejor para
fotomultiplicadores. [6] analizar y estudiar las complejas relaciones
espaciales es la realizacin de reconstrucciones
Realizacin de secciones transversales (x-z). tridimensionales donde el volumen de datos
puede ser visualizado desde varios ngulos. [6]
Con el microscopio ptico siempre
observamos la muestra en el plano X-Y. Una Estudios de actividad intracelular (ph e iones).
caracterstica interesante del microscopio
confocal es la posibilidad de realizar secciones La mayor resolucin y contraste de la
transversales de la muestra que nos permiten microscopa confocal permite obtener
observar cmo es su estructura interna sin imgenes de actividad inica o PH mucho ms
claras que las que se observan con microscopa imgenes por segundo. Estos microscopios
de fluorescencia, adems la posibilidad de denominados Confocal Live, precisan de
programar el barrido del lser permite tomar equipos informticos con una gran capacidad
imgenes del mismo plano focal a distintos de proceso y almacenamiento para poder
tiempos, pudiendo estudiarse la propagacin manejar los cientos de imgenes que podemos
de un determinado Ion (por ejemplo la obtener en unos pocos segundos. [6]
expansin de la ola de calcio despus de
aplicar un estmulo sobre la clula). Debido al Conclusiones
tiempo que se precisa para adquirir la imagen,
en aquellos procesos en que los cambios en la La microscopa confocal es una herramienta
actividad inica son muy rpidos es preciso muy importante, dado a que llega a
tomar imgenes de menor resolucin o incluso complementar la microscopa electrnica
captar nicamente unas pocas lneas por convencional, gracias a la exclusin de la
imagen para poder observar la evolucin en mayor parte de la luz de la muestra que no es
tiempos muy cortos. [6] del plano focal del microscopio.

Determinacin de espectros de fluorescencia Referencias Bibliogrficas


(lambda scan).
[1] Muller, W. (Ed) (2002). Introduction to
Si el sistema cuenta con un detector espectral Confocal Fluorescence Microscopy. Maastrich,
es posible utilizarlo para obtener el espectro Neitherlands: Shaker.
real de emisin del fluorocromo con que [2] Minsky, M. (1988). Memoir on inventing the
hemos marcado nuestra muestra. Aunque Confocal Scanning Microscopy. Scanning 10: 128-
existen mltiples tablas de los espectros de 138.
emisin de los fluorocromos, hay ligeras [3] Diaspro, A. (Ed) (2002). Confocal and two-
variaciones entre el espectro terico y el real Photon Microscopy: Foundations, Applications, and
debidas principalmente a variaciones en el PH Advances. New York: Wiley-Liss.
al preparar la muestra o a variaciones de [4] Hamilton, D. K. & Wilson, T. (1986).
temperatura. Este mtodo es til tambin para Scanning Optical Microscopy by Objective Lens
deducir espectros de autofluorescencia. [6] nScanning. Journal of Physics E: Scientific
Instruments 19 52-54.
NUEVOS DESARROLLOS. [5] MICROSCOPIA CONFOCAL. Servicios
Tcnicos de Investigacin. Sstti.ua.es. Retrieved 4
Uno de las principales limitaciones de los October 2017, from
microscopios confocales de barrido punto a https://sstti.ua.es/es/instrumentacion-
punto es el tiempo de obtencin de las cientifica/unidad-de-
imgenes (entre 2 y 3 imgenes por segundo). microscopia/microscopia-confocal.html
Esta lenta velocidad de adquisicin supone un [6] Wilson, T. (1990). Confocal microscopy.
problema cuando se trata de observar Academic Press.
organismos en movimiento (por ejemplo
bacterias) o procesos de dinmica celular que
ocurren en un corto intervalo de tiempo. En la
actualidad ya existen equipos en los que el
lser incide simultneamente en toda una lnea
de la imagen en lugar de en un nico punto
obtenindose velocidades superiores a 200

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