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Resumen: La creciente eutrofizacin de los ambientes acu- All these methods will allow to preview the development of
ticos favorece el crecimiento masivo (blooms) de algas, y cyanobacterial blooms and their toxins. Also, they contribute to
poblaciones de cianobacterias, capaces de producir potentes develop studies of control and monitoring.
toxinas con graves repercusiones en la salud pblica y en la Key words: Cyanobacteria, Harmful Algal Bloom, Neurotoxin,
sanidad animal. Hepatotoxin, detection methods.
Ms del 50% de las proliferaciones masivas de cianobacterias
son txicas. Dentro de una misma especie de cianobacteria,
existen cepas que producen toxinas y otras que no las produ-
cen. Se hace necesario disponer de mtodos que permitan
detectar y cuantificar cianobacterias y sus toxinas. Los tradi-
Introduccin
cionales bioensayos en ratn para conocer la toxicidad de una Las cianobacterias o cianofceas (algas azules), son
muestra sospechosa, se van sustituyendo por otros bioensa-
yos y diversos mtodos in vitro que estn demostrando ser
microorganismos procariontes, aerbicos y fotoauttro-
eficaces. El avance experimentado en las tcnicas inmunol- fos. La fotosntesis es su principal modo de obtencin
gicas y enzimticas ha facilitado la deteccin rpida de toxi- de energa. Se encuentran entre los organismos ms pri-
nas mediante el empleo de kits comerciales y no comerciales. mitivos de la tierra; su origen se estima en unos 3500
Uno de los campos ms prometedores de investigacin, con- millones de aos.
siste en la determinacin de las secuencias genticas que Su facilidad de crecimiento favorece su aparicin tanto
diferencian gneros incluso cepas txicas, as como otras que en el suelo como en el medio acutico, preferentemen-
codifican para la sntesis de toxinas; mtodos que permitirn te en los ambientes dulceacucolas de aguas alcalinas o
prever el desarrollo de cianobacterias o sus toxinas. El con- neutras con pH entre 6 y 9, y temperaturas entre 15 y
trol y seguimiento de los desarrollos masivos de cianobacte- 30C. Prefieren una alta concentracin de nutrientes,
rias, es muy importante para garantizar la calidad del agua. El principalmente nitrgeno y fsforo.
reconocimiento de los factores ambientales que influyen o
desencadenan la aparicin de blooms, es otro factor funda- La creciente eutrofizacin de los ambientes acuticos
mental para la prevencin y el control. puede favorecer su proliferacin masiva o flora-
cin (HABs: harmful algal blooms o simplemente
Palabras clave: Cianobacterias, blooms algales, Neurotoxinas, Blooms). No obstante, se han observado blooms alta-
Hepatotoxinas, mtodos de deteccin. mente toxignicos en aguas de carcter oligotrfico
con escasez de nutrientes, como en determinados
Abstract: Cyanobacteria and toxins detection. A review.
Water environment eutrophication increases the risk of harmful lagos alpinos [1].
bloom development, like cyanobacterial blooms, which can pro- A parte de los efectos negativos que se producen como
duce potent toxins able to affect public and animal health. consecuencia del crecimiento masivo de estas poblacio-
More than 50% of the cyanobacterial proliferation are toxic. nes, como son las alteraciones en la calidad del agua
Both toxigenic (toxin producers) and non-toxigenic strains, may (en especial en el pH y oxgeno disuelto), y otras alte-
exist within a single specie of cyanobacteria. It is very important raciones indirectas por modificacin de parmetros de
to develop different methods to detect and quantify cyanobacte- toxicidad (fundamentalmente por el pH); actualmente
ria and theirs toxins. Although mouse bioassay has been usually se sabe que algunas especies producen potentes toxinas,
used for toxicity testing for cyanobacterial toxins from suspi- capaces de originar efectos agudos y crnicos en el
cious samples, actually is being replaced by different in vitro hombre, en animales y vegetales [2]. Se estima que ms
assays that show efficient results. Advancements in immunoas-
say and biochemical techniques are providing rapid toxins detec-
del 50% de estos blooms son txicos [3,4].
tion methods. Even, several commercial and non commercial Las primeras intoxicaciones de poblaciones huma-
kits are available. One of the more promising methods consists nas por el consumo de agua contaminada por cepas
of developing molecular probes that recognise DNA or RNA txicas de cianobacterias, fueron descritas en Australia,
unique sequences to a given species, or single toxigenic strains. Inglaterra, China y frica del Sur [5]. En Brasil, se
Deteccin de cianobacterias y sus toxinas. Una revisin Roset J, Aguayo S y Muoz MJ
conocen varios casos [6], pero el ms grave hasta el Se conocen ms de cinco neurotoxinas. La anatoxina-a,
momento, fue el episodio de Caruaru (Brasil), en 1996, fue la primera en ser qumica y funcionalmente de-
donde murieron ms de 50 enfermos sometidos a hemo- finida. Se trata de un importante bloqueador neuromus-
dilisis en los que se utiliz agua contaminada con toxi- cular post-sinptico que impide la degradacin de la
nas de cianobacterias [7]. acetilcolina ligada a los receptores. Un mecanismo
semejante tiene la anatoxina-a (s), estructuralmente
caracterizada [14]. Otras neurotoxinas del tipo PSP
Cianobacterias y produccin de toxinas (Paralitic Shellfish Poisoning), inicialmente caracte-
rizadas en dinoflagelados marinos causantes de las
Varias especies de cianobacterias en ambientes acuti- mareas rojas, han sido aisladas en cepas de cianobacte-
cos, pueden producir potentes toxinas; sin embargo, rias de los gneros Anabaena, Aphanizomenon, Lyngbia
dentro de la misma especie, pueden existir cepas pro- y Cylindrospermopsis [15].
ductoras y no productoras. En muchos casos, las toxi- Las neurotoxinas del grupo de las PSP, inhiben la
nas son metabolitos secundarios en la formacin de conduccin nerviosa bloqueando los canales celulares
los fotopigmentos, que se acumulan en el citoplasma de sodio.
en determinadas situaciones [8]. La produccin de La accin de las neurotoxinas es rpida, causan la
estas endotoxinas es mxima cuando las condiciones muerte por parada respiratoria a los pocos minutos de la
de crecimiento son ptimas, por este motivo, se obser- exposicin. La mayora han sido identificadas como
va una produccin directamente proporcional al alcaloides o compuestos organofosforados neurotxi-
aumento de la biomasa [9]. Cuando las condiciones cos. Dosis orales producen la muerte aguda slo en con-
ambientales son desfavorables, las cianobacterias centraciones elevadas, aunque la toxicidad de las clu-
mueren, producindose la lisis celular y la liberacin las de las cianobacterias es alta, y los animales pueden
de las toxinas al medio [8]. ingerir una dosis letal al beber unos pocos mililitros
Las toxinas de las cianobacterias se suelen agrupar de agua conteniendo altas concentraciones de cianobac-
principalmente en neurotoxinas y hepatotoxinas. Las terias procedentes de las acumulaciones superficiales
neurotoxinas son producidas principalmente por espe- (mantas, scum) de los blooms remansados en las
cies y cepas de los gneros: Anabaena, Aphanizomenon orillas.
[10], Oscillatoria [11], Trichodesmium [12] y Cylin- Las Hepatotoxinas ocasionan el tipo ms comn de
drospermopsis [10-13]. intoxicacin relacionado con las cianobacterias. De
Nmero de
Toxina Gneros productores Estructura molecular
variantes
NEUROTOXINAS
Anabaena, Microcystis, 1
Anaxotina-a Oscillatoria, Phormidium, Alcaloide Amina secundaria
Aphanizomenon
Homoantotoxina-a Phormidium Amina secundaria Alcaloide 1
Toxinas PSP, Paralitic
Shellfish Poisonig
(Saxitoxinas, neo-saxitoxinas, Aphanizomenon, Anabaena Alcaloides Al menos 8
Toxinas
GTX y GTX)
Anatoxina-a (s) Anabaena ster de guanidina metil fosfato 1
HEPATOTOXINAS
Nodularina Nodularia Pentapptido cclico 6
Microcystis, Anabaena, Nostoc,
Microcistinas Heptapptido cclico >50
Oscillatoria
Cilindrospermosina Cylindrospermopsis, Umezakia Alcaloide cclico guanidina 1
ENDOTOXINAS
LPS Muchos gneros Lipopolisacrido >3
accin ms lenta, causan la muerte en horas o a los de especies potencialmente productoras en nuestros
pocos das. ambientes acuticos, precisa de estudios de control
Estas hepatotoxinas son pptidos [16], y fueron carac- y seguimiento ante el peligro de que pequeas dosis
terizadas [17] como heptapptidos cclicos (microcisti- de toxinas en exposiciones prolongadas [30], puedan
nas), y como pentapptidos (nodularinas). La estructura aumentar la incidencia de cncer heptico en las pobla-
general de las microcistinas fue definida por Carmi- ciones expuestas.
chael y col. en 1988. Actualmente son conocidas ms
de 8 nodularinas distintas, clasificadas de acuerdo con
las variaciones en su grado de metilacin, composicin
Niveles mximos de referencia para
e isomerizacin de sus aminocidos. Las especies iden- las toxinas
tificadas como productoras estn incluidas en los gne- En 1997, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)
ros Microcystis, Anabaena, Nodularia, Oscillatoria, [31], estableci como valor provisional de referencia,
Nostoc y Cylindrospermopsis [18]. 1 g/litro como nivel mximo aceptable para el consu-
mo oral diario de microcistina-LR, en aguas de abaste-
cimiento pblico.
Aunque en este momento las normativas europeas en
materia de calidad de aguas no contemplan la obligato-
riedad de detectar y medir toxinas de cianobacterias; sin
embargo, la nueva Directiva marco de aguas [32], es-
tablece como criterio para determinar el estado eco-
lgico, la necesidad de conocer la composicin y
abundancia de taxones de fitoplancton, la carga de
Figura 1. Estructura general de las microcistinas. Es una nutrientes y la turbidez en lagos y otras aguas continen-
ciclo (-D-Ala-X-D-MeAsp-Z-Adda-D-Glu-Mdha-), en la que tales. Sin embargo, al no existir una categora especfi-
X y Z pueden ser varios L aminoacidos, D-MeAsp es D-eri- ca para los embalses, se puede dificultar su aplicacin
tro-b-cido metilasprtico, Adda es un aminocido atpico: en Espaa. Junto con otros, estos criterios de calidad se
3-amino-9-metoxi-10-fenil-2,6,8-trimetil-deca-4,6-cido die- utilizarn para trazar los objetivos ambientales de mejo-
noico, y Mdha es N-etildehidroalanina. En la figura se repre- ra de la calidad del agua de los pases comunitarios.
senta concretamente la Microcistina-LR (MCYST-LR). En la mayora de los pases europeos, los organismos
Las hepatotoxinas llegan a los hepatocitos por medio de responsables del abastecimiento de agua potable y las
los receptores de los cidos biliares [19-21] y provocan agencias de medio ambiente, han incluido planes de
una retraccin de los hepatocitos y una prdida de con- vigilancia y control de cianobacterias y sus toxinas,
tacto entre ellos y las clulas que forman los capilares para asegurar la calidad del suministro de las aguas
sinusoides [22]. El hgado pierde su arquitectura y desa- potables y evitar procesos toxicolgicos. En Espaa no
existe ninguna regulacin, sin embargo, algunos pases
rrolla graves lesiones internas. La prdida de contacto
como Gran Bretaa, cuentan con legislacin y mtodos
entre las clulas origina espacios internos (vacuoli-
normalizados [33].
zacin) que provoca la afluencia de sangre capilar.
Aunque en Espaa los episodios cientficamente docu-
Esto ocasiona un edema heptico (hepatomegalia),
mentados son escasos, se ha constatado blooms de cia-
fcilmente observable en la necropsia, acompaado de
nobacterias txicas en embalses de abastecimiento
la anastomosacin de los vasos sanguneos, observable
pblico [34].
al trasluz en los hgados afectados.
Otro alcaloide hepatotxico, denominado cilindrosper-
mosina, fue aislado en algunas especies de cianobacte- Metodologas actuales y avanzadas en la
rias (especialmente en climas tropicales y templados): deteccin e identificacin de blooms de
Cylindrospermopsis raciborskii [23] y en Umenzaquia cianobacterias y sus toxinas
natans [24]. Su mecanismo de accin consiste en la
inhibicin de la sntesis proteica, causando daos seve- La identificacin de los organismos causantes de blooms
ros en las clulas renales de los animales ensayados. txicos, es con frecuencia el mejor modo de monitorizar
A travs del estudio de los mecanismos de accin de una zona susceptible de sufrir dichas proliferaciones. Los
esas hepatotoxinas, se ha demostrado que varias micro- estudios en este campo, han estado orientados a la iden-
cistinas y nodularinas son potentes inhibidores de tificacin de las especies por microscopia, apoyados con
las fosfatasas tipo 1 y 2A de las clulas eucariontes la valoracin de la toxicidad mediante bioensayos. Estos
[25-27]. mtodos son bastante intensivos y lentos, por lo que se
Estas toxinas han resultado ser potentes promotores de estn dedicando muchos esfuerzos en el desarrollo de
tumores hepticos [21,28,29] y, por tanto, la aparicin metodologas automatizadas.
Rev. Toxicol. (2001) 18: 65-71 67
Deteccin de cianobacterias y sus toxinas. Una revisin Roset J, Aguayo S y Muoz MJ
Tabla 2. Algunas posibles rutas de exposicin a toxinas cianobacterianas va aguas continentales (D),
aguas de transicin (S) o marinas (M) y actividades con riesgo
han empleado lneas celulares de neuroblastoma en kits tinas como la LR, RR y YR y otras como la LY y LA,
comerciales [42,46]. aunque para estas ltimas ofrecen menos respuesta.
Recientemente, se ha desarrollado un bioensayo in vitro Hay que tener cuidado con los falsos positivos, espe-
utilizando membranas de cerebro de trucha como pro- cialmente en los ensayos con microcistina LR [41].
cedencia de la enzima colinesterasa [47]. Otro ensayo Tambin de han producido anticuerpos monoclonales
de unin a un receptor [42], est basado en el desplaza- para las nodularinas.
miento competitivo de la toxina radiomarcada en sinap- Tcnicas genticas: Determinadas secuencias de ma-
tosomas cerebrales de rata preparados con toxinas. terial gentico (rRNA y DNA), permiten diferenciar
Ensayos enzimticos: Inhibicin de la Fosfatasa: Estos gneros como Mycrocistis [51], Nodularia [52], Syne-
ensayos utilizan los procesos bioqumicos afectados por chocystis y Synechococcus [53], as como muchos otros
las toxinas a nivel celular y molecular para desarrollar [54], o incluso cepas txicas dentro de una misma espe-
ensayos in vitro de mucha sensibilidad. Su lmite de cie. Determinadas secuencias especficas codifican para
deteccin es de nanogramos. Tambin se puede realizar la sntesis de las toxinas y son especficas de la cepa en
sin marcaje radiactivo mediante un mtodo colorimtri- cuestin. Estas se pueden identificar mediante RFLP y
co [48]. Se ha encontrado una correlacin lineal de sintetizar en grandes concentraciones utilizando tcni-
r = 0,74 entre los resultados obtenidos por HPLC y los cas de PCR. Los productos de PCR se pueden utilizar
obtenidos por este mtodo de PP2A [41]. para construir sondas marcadas, aunque tambin permi-
Tcnicas inmunolgicas: Se han desarrollado anticuer- ten estudiar y cuantificar la biodiversidad de la pobla-
pos policlonales [49], y kits de ELISA para microcisti- cin aplicando electroforesis y calculando la abundan-
nas que visualizan los efectos mediante una reaccin cia relativa de los distintos rRNA o rDNA de cada
de peroxidasa [42]. Tambin se han desarrollado anti- grupo taxonmico, previa comparacin con una base de
cuerpos monoclonales para microcistinas [50], que datos de genes del material obtenido [51- 53,55,56]
reconocen un eptopo especfico del antgeno, y que se Estas tcnicas permitiran desarrollar sistemas de moni-
detectan por fluorescencia utilizando un citmetro o un torizacin y deteccin a largo plazo, y por tanto alertar
fluormetro. Se trata de un ensayo rpido, sensible, de una futura proliferacin cianobacteriana.
especfico y de procedimiento sencillo, con un nivel de Los ensayos ms utilizados para la deteccin y para la
deteccin de microgramos [41]. Se han producido anti- cuantificacin de las toxinas cianobacterias, se referen-
cuerpos monoclonales para distintos tipos de microcis- cian en la Tabla 3.
Tabla 3. Mtodos y caractersticas de los ensayos de toxicidad para las toxinas de cianobacterias
Identificacin de toxinas
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