6.

CALIBRACIN

6.1. Introduccin

La medida de la concentracin mediante un mtodo instrumental se basa en la existencia de una relacin proporcional
entre dicha concentracin y la seal analtica o respuesta que genera un instrumento.

Generalmente esta relacin es lineal, de modo que puede expresarse como: y =a+bCA

donde CA es la concentracin del analito, y la seal medida, a la ordenada en el origen y b la pendiente de la recta.

La ecuacin de la recta se obtiene mediante calibracin con disoluciones de concentracin perfectamente conocida
(disoluciones patrn) a partir de la medida de la seal analtica proporcionada por stas. Los pares de valoresconcentracin-
seal se ajustan a una recta, a partir de la cual pueden obtenerse la concentracin del analito en muestras desconocidas.

6.2. Preparacin de la recta de calibrado

En general, la etapa de calibracin y la obtencin de la concentracin de analito en una muestra consta de los siguientes
pasos:

Paso 1: Preparacin de los patrones

Paso 2: Obtencin de la relacin seal-concentracin
Paso 3: Uso de la recta de calibrado

Paso 1: Preparacin de los patrones

Se preparan patrones del analito que cubran un intervalo adecuado de concentraciones, y se mide la seal analtica
proporcionada por los mismos.

Disoluciones del analito de concentracin conocida y creciente

Paso 2: Obtencin de la relacin seal-concentracin

Se traza un grfico con las seales frente a la concentracin de analito y se calcula la recta que "mejor" se ajusta a los datos
mediante un ajuste por mnimos cuadrados. De esta forma se obtiene la pendiente (b) y la ordenada (a) en el origen que
definen la recta
 .

Grfico seal-concentracin y recta ajustada por mnimos cuadrados

En la actualidad las calculadoras cientficas realizan el ajuste por mnimos cuadrados y, dicho ajuste, tambin puede
realizarse en el ordenador mediante la hoja de clculo EXCEL.

A continuacin se os da una plantilla para el ajuste por mnimos cuadrados mediante la hoja de clculo EXCEL y dos
tutoriales que os ayudarn a utilizar dicha plantilla y la herramienta de grficos de dicho programa.

Pantilla EXCEL para el ajuste por mnimos cuadrados.

Tutorial 1 que explica como utilizar la plantilla de EXCEL.
Tutorial 2 que explica como utilizar la herramienta grficos de EXCELpara obtener una recta ajustada por
mnimos cuadrados.

Paso 3: Uso de la curva de calibrado

Se mide la seal analtica para las muestras desconocidas y se interpola en la recta de calibrado para obtener valores de
concentracin de analito.
Obtencin de la concentracin de analito en las muestras a partir de la grfica y la recta

Finalmente, para obtener la concentracin de analito en la muestra hay que tener en cuenta en los clculos las
posibles diluciones a las que se ha sometido la muestra para obtener las disoluciones M1, M2 y M3 de medida.

Pipetas volumtricas de vidrio

Pipetas volumtricas se usan para dosificar lquidos. La pipeta volumtrica tiene una marcacin para un volumen definido.
Las pipetas volumtricas son ajustadas "EX" (por vertido), es decir la cantidad del lquido vertida corresponde al volumen
impreso.

Clases:

Clase B: segn las normas DIN e ISO las tolerancias del volumen son dos veces las de la clase AS
Clase AS (vaciado rpido):"A" significa mxima exactitud, "S" significa vaciado rpido
Clase AS certificacin de conformidad (vaciado rpido):
Conformidad (segn DIN 12 600) quiere decir: concordancia de un aparato con la norma de homologacin para el
sector, regulado por la ley segn la norma de la oficina alemana de pesos y medidas; y que la misma cumple las
exigencias de dicha norma. El distintivo impreso H certifica la conformidad del aparato con la norma. Un certificado
de lote es incluido en el empaque. Emitimos certificados individuales a peticin.

Colorantes de graduacin:

Las pipetas volumtricas estn disponibles con graduacin mbar (estndar) azul.
 La graduacin mbar es un colorante que se difunde en la superficie del vidrio y queda aglutinada en ella. As, la
graduacin mbar ofrece una resistencia mayor que la graduacin azul.
La graduacin azul es un colorante esmaltado. Est esmaltada en el vidrio y resiste lquidos cidos y alcalinos.

fabricadas de vidrio sdico-clcico

puntas y extremidades especficamente formadas, facetadas y pulidas al fuego
puntas ajustadas facilitan rendimientos cortos y prcticos
con cdigo de color
con indicacin de tolerancias
con una marca circular

El pipeteado a boca est prohibido.

Clase B, graduacin mbar, DIN 12 690:
Clase B, graduacin azul, DIN 12 690:
Clase AS, graduacin mbar, DIN 12 691:
Clase AS, graduacin azul, DIN 12 691:
Clase AS, con certificacin de conformidad, con certificado de lote, graduacin mbar, DIN EN ISO 648 (vaciado
total reducido a 5 segundos):

fabricadas de polipropileno transparente

a prueba de roturas
ajustadas "EX" (por vertido)
graduacin azul
con una marca circular

Con cargas trmicas superiores a 60 C pueden presentarse variaciones de volumen. Por tanto, la limpieza slo se
recomienda con detergentes ligeramente alcalinos y hasta 60 C.

Cat. N Capacidad Tolerancia Longitud UE

5502101 1 ml 0.02 ml 300 mm 12
5502102 2 ml 0.02 ml 300 mm 12
5502103 5 ml 0.03 ml 300 mm 6
5502104 10 ml 0.04 ml 440 mm 6
5502105 25 ml 0.06 ml 450 mm 6
5502106 50 ml 0.10 ml 460 mm 6

Que son las pipetas serologicas, semiautomaticas, automaticas, aforadas y las volumetricas? as pipetas en general
son materiales de laboratorio tiles para medir volumenes.
Las pipetas serolgicas se utilizan para tomar muestras de suero para anlisis y se diferencian de las dems porque tienen
capacidades muy pequeas suelen llamarse micropipetas.

Las aforadas se utilizan para medir un volumen especfico, ej 5 mL.

Las volumtricas vienen por escalas, asi en una pipeta volumtrica de 5 mL puedes tomar 1mL, 2 mL, etc, mientras en una
aforada solo puedes tomar 5 mL y no ms.

Las pipetas serolgicas se utilizan para la dosificacin de lquidos. Pipetas graduadas estn calibrados Ex (para entregar):
El volumen impreso se refiere a la cantidad de lquido vertida.

Graduacin:

Nuestras pipetas graduadas estn disponibles con graduacin de color mbar (de serie) o azul:
La graduacin mancha mbar penetra en la superficie del vidrio y es, por tanto, ms resistente que el azul, fusionado sobre
el esmalte de graduacin.
El azul de la graduacin se funde en el cristal y resistente a la mayora de las soluciones cidas y alcalinas.

Caracteristicas:

Bajo riesgo de rotura.

Consejos, especialmente formados y fines, biselado y pulido al fuego.
Sugerencias calibrados proporcionan el tiempo de espera breve y orientada a la prctica.
Con cdigo de colores para una fcil identificacin.
Con indicacin de la tolerancia.
A partir de 5 ml de capacidad con el extremo estrechado superior para retener un tapn de algodn. Un tapn de
algodn colocado encima de la constriccin evita un desbordamiento de la pipeta. Adems, se puede extender el
tiempo de espera y de este modo influir en la exactitud de la medicin.
Graduadas hasta la punta, el cero en la parte superior.
Capacidad: 1 : 0,01 ml, 2 : 0,01 ml, 5 : 0,1 ml, y 10 : 0,1 ml.

PROCEDENCIA: Alemania

Reaccin colorimetrica

La colorimetra es una tcnica instrumental que tiene por objeto determinar la absorcin de luz visible por una muestra, que
puede ser una sustancia pura o bien una mezcla o disolucin.
Para ello se utiliza un instrumento constituido por los siguientes elementos:

Fuente de radiacin (luz blanca)

Sistema dispersivo (rendijas de entrada y salida, y red de difraccin)
Detector (fototubo que transforma la seal luminosa en una seal elctrica)
Sistema de medida de la absorcin, una vez amplificada (convertidor analgico o digital).

Enzimas

La actividad vital no es ms que el desarrollo de una serie de reacciones qumicas entre un conjunto de molculas. Si un
qumico en un laboratorio realiza estas reacciones lo normal es que el rendimiento (cuantificado como la cantidad de
producto deseado frente a la cantidad total del producto) sea muy bajo, mientras que esta misma reaccin en un sistema
biolgico tiene un rendimiento del 99% y se realiza a una mayor velocidad. Esto se debe a la existencia de catalizadores , la
mayora de los catalizadores biolgicos que se conocen son ENZIMAS.

Las enzimas son protenas altamente especializadas que tienen como funcin la catlisis o regulacin de la
velocidad de las reacciones qumicas que se llevan a cabo en los seres vivos.

Casi todas las reacciones qumicas de las clulas son catalizadas por enzimas, con la particularidad de que cada enzima
solo cataliza una reaccin, por lo que existiran tantas enzimas como reacciones, y no se consumen en el proceso. Los
catalizadores no biolgicos son inespecficos.

En una reaccin catalizada por enzima (E), los reactivos se denomina sustratos (S) , es decir la sustancia sobre la que
acta la enzima. El sustrato es modificado qumicamente y se convierte en uno o ms productos (P). Como esta reaccin
es reversible se expresa de la siguiente manera:

La enzima libre se encuentra en la misma forma qumica al comienzo y al final de la reaccin.

Especificidad
Las molculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominado sitio activo, donde tiene
lugar la catlisis. La estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni
siquiera sus ismeros) es lo que determina la especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894)
enunci: "el sustrato se adapta al centro activo o cataltico de una enzima como una llave a una cerradura".

Clases de Enzimas

El nombre de las enzimas es el del sustrato + el sufijo: -asa. Los nombres de las enzimas revelan la especificidad de su
funcin:

Oxido-reductasas: catalizan reacciones de oxido-reduccin, las que implican la ganancia (o reduccin) o prdida de
electrones (u oxidacin). Las ms importantes son las deshidrogenasas y las oxidasas
Transferasas: transfieren grupos funcionales de una molcula a otra. Ej.: quinasas; transfieren fosfatos del ATP a
otra molcula.
Hidrolasas: rompen varios tipos de enlaces introduciendo radicales -H y -OH.
Liasas: adicionan grupos funcionales a los dobles enlaces.
Isomerasas: convierten los sustratos ismeros unos en otros.
Ligasas o Sintasas: forman diversos tipos de enlaces aprovechando la energa de la ruptura del ATP. Ej:
polimerasas

Mecanismo de accin enzimtica

Una enzima, por s misma, no puede llevar a cabo una reaccin, su funcin es modificar la velocidad de la reaccin,
entendindose como tal la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. Tal variacin se debe a la disminucin
de la energa de activacin Ea; en una reaccin qumica, la Ea es la energa necesaria para convertir los reactivos en formas
moleculares inestables denominadas especies en estado de transicin, que poseen mayor energa libre que los reactivos y
los productos.

<="">
Imagen original de la Universidad de Virginia

En el diagrama estn representados los niveles de energa , durante el curso de la reaccin, de molculas intervinientes en
una reaccin tipo: A + B ---> C. La curva azul muestra el curso de la reaccin en ausencia de una enzima que facilite la
reaccin, mientras que la curva roja la muestra en presencia de la enzima especfica de la reaccin. La diferencia en el nivel
de energa entre el estado inicial y la necesaria para iniciar la reaccin (picos de las curvas) es la energa de activacin. Tal
como se observa la presencia de enzima baja la energa de activacin.
El complejo Enzima- sustrato posee menor energa de activacin que las especies en estado de transicin que la
correspondiente reaccin no catalizada.
Como realiza esta accin una enzima?

Orienta a los sustratos: parte de la energa de activacin se utiliza para que los sustratos roten y se enfrenten con
los tomos correctos para formar los enlaces.
Agregan cargas a los sustratos: las cadenas laterales (R) de los aminocidos de las enzimas pueden participar
directamente haciendo a los sustratos qumicamente ms reactivos.
Inducen la deformacin en el sustrato: cuando una sustancia se une al sitio activo, la enzima puede causar que
los los enlaces se estiren, ponindolo en un estado de transicin inestable.
Cambio de forma de la enzima al unirse al sustrato: el modelo de llave- cerradura de Fisher fue actualizado
cuando se descubri que las enzimas son flexibles y sus sitios activos pueden cambiar (expandirse) para
acomodarse a sus sustratos. Este cambio de forma causado por la unin al sustrato se denomina ajuste inducido.
En la Hexoquinasa puede observarse este ajuste inducido, con el sustrato (glucosa) y sin l. El ajuste inducido
alinea las cadenas laterales reactivas del sitio activo de la enzima con los sustratos.

Esta enzima cataliza la reaccin: Glucosa + ATP --> glucosa 6-fosfato + ADP

Acompaantes no proteicos de las enzimas

Ya sea que consistan en una nica cadena polipeptdica plegada o en varias unidades, muchas enzimas requieren otras
molculas no proteicas para funcionar.

COFACTORES: son iones inorgnicos que se unen temporariamente a las enzimas

molcula papel en la reaccin catalizada

Hierro Fe 2+ o Fe 3+ Oxidacin / reduccin
Cobre, Cu + o Cu 2+ Oxidacin / reduccin
Cinc, Zn2+ Ayuda a unir el NAD

COENZIMAS: molculas pequeas que tiene carbono, interaccionan dbilmente durante la catlisis. La mayor parte
de las coenzimas son vitaminas, muchas de las cuales deben ser incorporadas con la dieta.

molcula papel en la reaccin catalizada

Biotina transporta -COO-
Coenzima A transporta -CH2-CH3
NAD y FAD transportan electrones

GRUPOS PROSTETICOS: estn permanentemente unidos a las enzimas

molcula papel en la reaccin catalizada

une iones O2 y electrones, contiene el
Hemo
cofactor hierro
Flavina Une electrones
Retinal Cofactor en la absorcin de la luz

Las coenzimas reaccionan con la enzima de igual modo que el sustrato, unindose al sitio activo. Se mueven de una enzima
a otra agregando o quitando grupos qumicos del sustrato.

Regulacin enzimtica

El metabolismo consiste en una serie de reacciones catalizadas por enzimas, donde los productos de una reaccin se
convierten en los reactivos de la siguiente, lo que se conoce como VAS METABLICAS.
Las clulas deben poder regular estas vas metablicas y lo hacen a travs de reguladores enzimticos. los inhibidores
naturales regulan el metabolismo mientras que los artificiales son utilizados por la medicina, para destruir plagas, etc.

Inhibicin reversible: pueden inhibidores competitivos, los que se unen a la enzima ingresando en el sitio activo,
impidiendo as su enlace con el sustrato. Los inhibidores no competitivos se unen a la enzima en un lugar diferente
al sitio activo cambiando la forma de la protena y por lo tanto la forma del sitio activo. Sus efectos son reversibles.
 Inhibicin irreversible: hay inhibidores que se unen covalentemente al sitio activo de una enzima, esta unin es
permanente e inactiva a la enzima destruyendo su capacidad de unirse al sustrato. Ej: el DIPF reacciona con el
aminocido serina del sitio activo de la enzima acetilcolinesterasa, inhibindola irreversiblemente. Esta enzima
participa en el mecanismo de propagacin de los impulsos nerviosos. El DIPF es conocido como gas nervioso,
algunos ej. son la SARINA (usado en el ataque terrorista en un subte en Tokio en 1995)y el MALATION (insecticida).

El gas nervioso ejerce su efecto letal al unirse con la enzima ACETILCOLINESTERASA, que es la encargada de disociar la
molcula de ACETILCOLINA para su posterior sntesis. Este proceso no se puede llevar a cabo sin la primera disociacin y
sus consecuencias son trgicas. Al no poder ser sintetizada, la Acetilcolina comienza a acumularse en los centros de
transmisin, como entre neuronas, ganglios, uniones neuromusculares, impidiendo la transmisin de ordenes a los msculos
tanto de accin voluntaria como de accin involuntaria. As, todos los msculos quedan bloqueados. Los primeros sntomas
son un sudor copioso, dificultad en la respiracin, presin en el pecho, fallos respiratorios, mareos, perdida de visin... Al
aumentar la dosis de gas nervioso los efectos son cada vez mayores, llegando a producir espasmos y la perdida de la
conciencia casi en el acto. Finalmente la muerte se produce tras pocos minutos por asfixia. Entre los antdotos, con el fin de
reactivar el proceso de sntesis a cargo de la encima acetilcolina, el mas usado es el basado en la ATROPINA, dado que es
el nico eficaz si se aplica con extrema rapidez.

CATLISIS ENZIMTICA

32.- Se ha descrito un mtodo para la determinacin de glucosa usando la enzima glucosa-oxidasa. En presencia de
oxgeno y agua, la enzima cataliza la produccin de cido glucnico y perxido de hidrgeno a partir de la glucosa, el
reactivo limitante. El perxido de hidrgeno oxida al ferrocianuro potsico, el cual se analiza por una variedad de mtodos.
En lugar de medir el cambio de seal desde tiempo cero a tiempo t, se fijan las condiciones experimentales de forma que las
disoluciones de muestra y reactivo se mezclen al principio de la reaccin. Se registra la diferencia de seal entre dos
detectores colocados al principio y final de la lnea de reaccin. Si est presente la glucosa reaccionar y la diferencia de
seal indicar la cantidad de glucosa medida.
-1
Una solucin estndar de glucosa de 100 mg l se prepara y determina por dicho mtodo. Una disolucin desconocida,
despus de concentrada cinco veces, se analiza por el mismo procedimiento, dando una diferencia de seal de 18.0
divisiones. Suponiendo que el registrador est preparado para leer 100 divisiones de la disolucin patrn de glucosa, cal
es la concentracin de glucosa en la muestra desconocida?.

33.- La cistina acta como catalizador en la reduccin de yodo por la azida sdica. Se ha descrito un mtodo cintico para el
anlisis de cistina en el que el cambio en la concentracin de yodo se mide potenciomtricamente. Por comparacin
automtica de la velocidad inicial del cambio de la seal potenciomtrica producida por un integrador electrnico, se pudo
-1
obtener una lectura numricamente equivalente a la concentracin de cistina en mg l . Una muestra biolgica de 5.00 g se
desnaturaliz, extrajo, centrifug, y posteriormente se trat para producir una muestra de 10.0 ml que contena la cistina. A
la clula de reaccin se le aadi 1.00 ml de una disolucin que contena la azida sdica, yodo y yoduro, y 1.00 ml de
-1
solucin de cistina. La lectura fue de 5.20. Calcular la concentracin de cistina en la muestra biolgica en mg l y en % en
peso.

34.- El nivel de glucosa en una muestra de sangre se determina midiendo la cantidad de producto B formado despus de 30
minutos de incubacin a 37 C, de acuerdo con las siguientes reacciones:

Glucosa oxidasa
C6H12O6 + H2O + O2 C6 H12O7 + H2O2

A + H2O2 B
(colorante orgnico) (producto coloreado)

0.5 ml de una muestra de sangre se tratan adecuadamente para precipitar las proteinas, se diluye a 10.0 ml y despus se
filtra. A una alcuota del filtrado de 0.2 ml en un tubo de ensayo se le aade la enzima estndar que contiene el colorante
orgnico A. Despus de 30 minutos se aade H2SO4 para parar la reaccin y se determina la absorbancia del producto
coloreado espectrofotomtricamente a 540 nm, obtenindose un valor de 0.124 unidades de absorbancia. De idntica
-1 -1
manera, se tratan los patrones que contienen 1.00 mg ml y 3.00 mg ml , dando absorbancias de 0.100 y 0.300,
respectivamente. Calcular el nivel de glucosa en sangre expresado en mg% (1 mg %= 1 mg / 100 ml de sangre)

35.- Se ha descrito un mtodo para la determinacin de glucosa usando la enzima glucosa oxidasa. En presencia de
oxgeno y agua, la enzima cataliza la formacin de cido glucnico y perxido de hidrgeno a partir de la glucosa, el reactivo
limitante.
El perxido de hidrgeno reacciona con yoduro, oxidndose a yodo que se mide potenciomtricamente. En este sistema , se
mide el tiempo necesario para que se forme una cierta cantidad fija de producto. La inversa de este tiempo de reaccin es
proporcional a la concentracin de glucosa en la muestra.
0.200 ml de una muestra de sangre se diluyeron y desproteneizaron, siendo el volumen final de 10.0 ml. 1.00 ml de esta
disolucin se aadi a la clula de reaccin con 1.00 ml de una disolucin que contena todo excepto glucosa. El tiempo de
reaccin de la muestra desconocida de sangre fue de 18.5 s. A 1.00 ml de la muestra desconocida de sangre se le aadi
-1
un volumen igual de una disolucin salina conteniendo 40.0 mg l de glucosa. 0.200 ml de esta disolucin resultante se
trataron de la misma forma que la muestra anterior dando un tiempo de reaccin de 16.0 s.
a) Formular las reacciones cintica y de valoracin o indicadora.
b) Calcular la concentracin de glucosa en la muestra desconocida de sangre.

36.- La fosfatasa alcalina presente en leche cataliza la liberacin de fosfato inorgnico, Pi a partir de steres fosfricos,
segn la reaccin:

Con el fin de hallar la KM de la enzima para el fenilfosfato disdico (FFDS) se procedi a realizar estudios cinticos utilizando
un extracto con una concentracin ptima de enzima, determinada previamente.
La velocidad de la reaccin se midi por liberacin de fenol seguida colorimtricamente por medio del reactivo de Folin.
Se prepararon cuatro series de tubos con concentraciones crecientes de FFDS tamponado a pH 10.0. En cada tubo se
aadieron 0.2 ml de extracto enzimtico y se incubaron a 37 C durante tiempos de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 y 5.0 minutos.
Transcurrido el tiempo de incubacin se detuvo la reaccin aadindose 2.0 ml del reactivo Folin, que desnaturaliza la
proteina y forma un complejo coloreado con el fenol liberado en el transcurso de la incubacin.
Se pipete a cada tubo 1.0 ml de solucin de Na2CO3 al 20% y despus de 15 minutos, tiempo en el cual se produce la
reaccin coloreada, se midieron absorbancias a 680 nm. Paralelamente, se prepararon controles para cada concentracin
de sustrato y tiempo de incubacin, sustituyendo el extracto enzimtico por 0.2 ml de solucin tampn. Los valores de
absorbancia obtenidos para cada tubo de control se restaron del valor de absorbancia de su correspondiente tubo problema.
De esta forma se sustrae, del fenol total, el liberado por hidrlisis espontnea.
A partir de los datos experimentales obtenidos, representar la curva de saturacin de la enzima por el sustrato y calcular la
KM aproximada.
Los datos obtenidos fueron:
-1
Tiempo de incubacin, Concentracin inicial de sustrato, mmol l
min. 0.25 0.45 1.0 2.5
Absorbancia a 680 nm
0.5 0.05 0.10 0.13 0.19
1.0 0.11 0.17 0.25 0.33
1.5 0.15 0.26 0.33 0.47
2.0 0.18 0.30 0.39 0.51
3.0 0.21 0.33 0.43 0.55
5.0 0.22 0.33 0.44 0.56

37.- La enzima glucgeno sintetasa de msculo esqueltico de conejo puede utilizar glucosa y, en presencia de UDP-
glucosa, convertirla en disacrido de glucosa.
Los estudios cinticos encaminados a conocer las diferentes caractersticas de la enzima frente a los dos sustratos, se
14
realizaron utilizando UDP-( C)-glucosa con el objeto de determinar la actividad de la enzima, midiendo la velocidad de la
reaccin por la radioactividad presente en el disacrido de glucosa.
Los datos obtenidos fueron los siguientes:
-1 -1 -1
Ensayo 1. La mezcla de reaccin contena Tris-HCl 50 mmol l , pH 7.8, EDTA 5 mmol l , Na2SO4 2 mmol l , glucosa 1.2
-1
mol l y la cantidad apropiada de glucgeno sintetasa, en un volumen total de 0.3 ml, a 30 C.

Velocidad inicial Concentracin de UDP-glucosa

-1
cpm disacrido de glucosa mmol l
523 0.20
333 0.10
212 0.050
117 0.025
-1
Ensayo 2. La misma mezcla de reaccin que en el caso anterior, excepto que se utiliza UDP-glucosa 100 mol l y glucosa
como sustrato variable.

Velocidad inicial Concentracin de glucosa

-1
cpm disacrido de glucosa mol l
 433 2
325 1
224 0.5
185 0.4
En ambos ensayos el sustrato fijo se utiliza en exceso con respecto al sustrato variable, de forma que el sistema queda
reducido al caso simple de un solo sustrato.
a) Calcular KM para cada uno de los sustratos.
b) Por qu sustrato presenta mayor afinidad la enzima?.
c) Calcular la concentracin de sustrato que contiene una muestra utilizando el ensayo 2, si se ha obtenido una
velocidad inicial de disacrido de glucosa de 380 cpm.
Nota: UDP, uridina difosfato; cpm, conteos por minutos.

-1
38.- Dados los siguientes datos de una reaccin enzimtica: vmx= 50000 min y
-6 -1.
KM = 1 10 mol l
a) Calcular la velocidad de reaccin , v, para las siguientes concentraciones de sustrato:
-8 -1
1- 5 10 mol l
-7 -1
2- 1 10 mol l
-7 -1
3- 8 10 mol l
-6 -1
4- 3 10 mol l
-4 -1
5- 2 10 mol l
b) Identificar los lmites de concentracin entre los que la velocidad de reaccin se aproxima dentro de un 10 %:
1- A una cintica de primer orden
2- A una cintica de orden cero (velocidad independiente de la concentracin de sustrato).

39.- La enzima UDP-glucosa pirofosforilasa aislada de Acanthamoeba Castellanii cataliza la reaccin reversible:

UDP-glucosa + PPi D glucosa 1-P + UTP

Se realizaron estudios cinticos en el sentido de sntesis de UDP-glucosa utilizando para la medida de la actividad
+
enzimtica tcnicas espectrofotomtricas que implicaron el empleo de NAD . La reaccin completa fue:
+
Glucosa 1-P + UTP + 2 NAD D UDP-glucuronato + PPi +2 NADH

Una unidad de actividad se define arbitrariamente como la cantidad de enzima necesaria para la reduccin de 1m mol de
+
NAD por minuto.
El Ppi, producto de la reaccin, resulto ser un inhibidor de la sntesis de UDP-glucosa. Los estudios cinticos se
encaminaron a conocer el comportamiento de este inhibidor. Los resultados obtenidos se expresan a continuacin:
-1 -1 2
(UDP-glucosa, mmol min ml ) 10
-1 -1
UTP, mmol l Sin inhibidor Con PPi, 4.0 mmol l
0.50 57 21
0.20 50 18
0.10 42 15
0.050 31 11
0.025 20 7.7
-1
La concentracin de glucosa 1-P se fij en 1.0 mmol l , en exceso con respecto del otro sustrato, UTP y no saturante para la
enzima.
a) Determinar KM y v mx para la UDP-glucosa pirofosforilasa en ausencia de inhibidor.
b) Qu tipo de inhibicin ejerce el PPi cuando se utiliza una concentracin no saturante de glucosa 1-P? Cul es
su KI?.

+ +
40.-En Neurospora crassa existen dos glutamato deshidrogenasas, una especfica de NAD y otra de NADP .
Utilizando urea y glutamato en el medio de cultivo y limitando las fuentes de carbono a glucosa o sacarosa se ha conseguido
+
aislar y purificar con buen rendimiento la glutamato deshidrogenasa NAD -especfica de la cadena A deNeurospora crassa.
Se comprob que el cido isoftlico era un fuerte inhibidor de la glutamato deshidrogenasa y se realizaron estudios cinticos
-1 +
para ver el tipo de inhibicin efectuada por dicho cido en tampn fosfato 0.1 mol l a pH 8 y concentracin de NAD 0.1
-1
mmol l .
El cido isoftlico tambin inhibe la accin de la glutamato deshidrogenasa de bovino y se realizaron estudios paralelos a los
anteriores con el objeto de comparar ambas enzimas procedentes de distintos organismos.
La actividad enzimtica se midi siguiendo la absorcin a 340 nm.
 +
Se han obtenido los siguientes resultados para la glutamato deshidrogenasa NAD -especfica de Neurospora crassa:
2
v0 10
Glutamato Coenzima y sustrato Coenzima y sustrato
-1 2
mol l 10 solamente en presencia de
isoftlico
-4 -1
6.0 10 mol l
1.000 56.0 21.7
0.5000 46.7 13.2
0.2000 35.0 6.02
0.1000 23.3 3.16
0.06700 18.7 2.16
0.03300 10.8 ----
+
a) Calcular KM para la enzima glutamato deshidrogenasa NAD , especfica de Neurospora crassa.
b) Qu tipo de inhibicin ejerce el cido isoftlico?.
-4
c) Si la KI del cido isoftlico para la glutamato deshidrogenasa de bovino es 6.2 10
-1
mol l . qu se puede deducir respecto del comportamiento de este inhibidor frente a ambas enzimas?.

41.- La enzima ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa cataliza la reaccin de fijacin de CO 2 a la ribulosa-1,5-bifosfato.

Investigaciones llevadas a cabo sobre el mecanismo de accin de esta enzima aislada de espinacas muestran que el
-5 -1
cianuro potsico a concentracin 10 mol l la inhibe en un 51 %. Se han efectuado estudios cinticos para comprobar el
tipo de inhibicin, realizndose incubaciones con MgCl 2 5 mM, EDTA 0.30 mM, glutation 3 mM, concentraciones variables de
14 -
sustrato, KH CO3 25 mM (2 mCi) y enzima 5.2 mg. Otra serie de incubaciones contenan adems cianuro potsico 10
5 -1
mol l .
14 -
La velocidad de la reaccin se expresa como mmoles de H CO3 fijados por minuto. Los resultados obtenidos son los
siguientes:
14 -
Ribulosa-1,5-bifosfato (mM) V0 mmoles H CO3 /min
-5 -1
Sin KCN Con KCN 10 mol l
8.00 7.7 5.60
2.00 5.9 4.35
1.33 4.5 3.80
0.94 3.8 3.10
0.67 3.0 2.60
0.47 2.4 2.10

a) Calcular KM de la enzima para la ribulosa-1,5-bifosfato.

b) Determinar qu tipo de inhibidor es el cianuro y calcular su KI.

42.- En la tabla siguiente se recogen los inversos de velocidad de tres reacciones enzimticas:
-1 -1
[S], mmol l 1/[S], mol l 1/v4, min 1/v5, min 1/v6, min
1.0 1000 0.014 0.024 0.028
0.50 2000 0.018 0.028 0.035
0.25 4000 0.025 0.035 0.050
0.167 6000 0.033 0.043 0.065
0.125 8000 0.040 0.050 0.080
a) Determinar, representando estos datos en papel milimetrado, el tipo de inhibicin observado en los casos 5 y 6,
con respecto al caso 4.
b) Calcular, a partir de las grficas, los valores de KM y v mx, asi como de la KI, en cada caso.

43.- La enzima pirrolidina carboxilato peptidasa aislada de la fraccion de Klebsiella cloacae separa selectivamente la mitad
NH2 terminal de PCA-pptidos y PCA-proteinas (PCA=cido pirrolidina carboxlico).
La enzima purificada tiene un peso molecular de 74000 y se han realizado diversos estudios con el objeto de determinar su
pH ptimo y sus parmetros cinticos, utilizando como sustrato PCA-PABA (cido p-(L-pirrolidin-2-ona, 5-carboxamido)
benzoico).
La actividad de la enzima se midi, en este caso, por absorbancia, utilizando reacciones adicionales, y se defini una unidad
de actividad enzimtica como la cantidad de enzima que separa 1 nmol de PABA por minuto, a 37 C.
-1
Los datos obtenidos para determinar el pH ptimo en tampones fosfato 0.1 mol l fueron:
 pH 4.5 5.0 5.5 6.0 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
% actividad 22.73 40.91 61.36 97.73 100 80.70 53.41 48.86 19.54

Los datos siguientes se obtuvieron al estudiar la cintica de saturacin de la enzima frente a PCA-PABA como sustrato. Se
-1
utilizaron 10 ml de una disolucin de enzima de 250 mg ml .
-1 -1
PCA-PABA, mmol l moles PABA min
1.00 1.992
0.50 1.527
0.33 1.239
0.20 0.916
0.14 0.716
0.10 0.539

a) Representar grficamente % actividad=f(pH) e indicar el pH ms adecuado de trabajo.

b) Determinar los parmetros cinticos de la enzima con respecto al sustrato PCA-PABA.
c) Calcular la concentracin de sustrato de una muestra si en su medida cintica se obtuvo 1.115 nmoles PABA/min.

44.-La enzima L-glicerofosfato deshidrogenasa de Ceratitis capitata cataliza la reaccin:

+ +
L-glicerofosfato + NAD D Dihidroxiacetona-P + NADH + H

Dicha enzima se ha aislado, determinndose sus parmetros cinticos como uno de los mtodos de su caracterizacin.
+
Se realiz un ensayo utilizando NAD como sustrato en las siguientes condiciones:
-1.
25 C, pH 10.0 y concentracin de glicerofosfato, 3 mmol l
Los ensayos en los que la hidroxiacetona-P actuaba como sustrato se efectuaron a 25 C, pH 6.6 y concentracin de NADH
-1
0.1 mmol l . En ambos casos se trabaj con enzima purificada y en condiciones tales que se pueden considerar reacciones
con un nico sustrato. La velocidad de reaccin se determin en los dos experimentos por la variacin de absorbancia
(aumento o disminucin, respectivamente) a 340 nm.
Teniendo en cuenta los resultados que se muestran en la tabla siguiente, determinar K M para los dos sustratos. Qu
diferencias se observan entre ellos?.
+ -1 -1
NAD , mmol l v0 Dihidroxiacetona-P, mmol l v0
5.00 50.00 5.00 83.33
1.25 43.48 2.00 90.90
0.77 30.04 1.00 100.00
0.40 31.25 0.50 90.90
0.30 27.78 0.40 76.92
0.25 25.64 0.20 52.63
0.16 45.45
45.- Para estudiar la velocidad de una reaccin enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato, se prepararon series
de incubaciones con diferentes concentraciones de sustrato y una cantidad constante de enzima, habindose determinado
previamente las condiciones ptimas de la reaccin.
Las velocidades iniciales obtenidas para cada concentracin de sustrato se indican a continuacin:

Concentracin de sustrato Velocidad inicial

-1
mM mmoles producto formado min
0.05 15.4
0.08 20.0
0.12 24.0
0.20 31.2
0.30 36.5
0.40 39.2
0.50 40.0
0.60 40.0

a) De la observacin de los datos numricos, dedzcase la velocidad mxima de la reaccin y el valor de KM.
b) Si la concentracin de enzima en cada mezcla de reaccin se incrementa al doble, cmo varan K M y Vmx?.
c) Cul ser la concentracin de enzima libre a una concentracin 0.7 mM de sustrato?.
d) Calcular el valor de la velocidad inicial para concentraciones de sustrato 0.1 y 0.7 mM.
46.- La forma I de la enzima glucgeno sintetasa de msculo esqueltico de conejo fue aislada y purificada y con ella se
realizaron diversos estudios utilizando como sustrato UDP-glucosa y como aceptores maltosa y glucgeno, respectivamente.
En un estudio cintico en que la actividad enzimtica se midi mediante tcnicas de marcaje isotpico, se obtuvieron los
siguientes datos:
a) Utilizando maltosa como aceptor y una concentracin de UDP-glucosa 16.6 mmolar

Maltosa, M cpm
0.4 310
0.303 249
0.2 167
0.1 88

b) Utilizando glucgeno como aceptor y una concentracin de UDP-glucosa 10 mmolar

-1
Glucgeno, mg ml cpm
10 172
5 148
2 94
1 59

1) Determinar el parmetro KM de dicha reaccin para la maltosa y el glucgeno respectivamente, expresado en mg

-1
ml .
2) Existe alguna diferencia entre el comportamiento de la maltosa y el glucgeno como aceptores?.

47.-Los glucocorticoides inhiben la utilizacin de glucosa por los adipocitos. Se han realizado experimentos para determinar
si esta inhibicin se debe a una actuacin sobre el sistema de transporte, seleccionndose dexametasona como inhibidor de
la captura de glucosa por clulas grasas. El experimento se realiz incubando a 37 C adipositos aislados, con las
concentraciones de glucosa indicadas; a los cuarenta y cinco segundos se finalizaba la incubacin centrifugndose a 10000
g. La captura de glucosa se determinaba inmediatamente despus de la adicin de varias concentraciones de
14 -1 -1
dexametasona. La velocidad de captura se ha expresado como nmoles de U C glucosa . 45 s .mg de DNA

v0 (glucosa capturada)
Glucosa (mM) Sin inhibidor Desametasona Desametasona
0.05 mM 0.1 mM
1.0 0.385 0.256 0.200
0.5 0.227 0.164 0.125
0.33 0.161 0.115 0.087
0.25 0.123 0.093 0.069

a) Qu tipo de inhibicin se produce?.

b) Cul es la KI del inhibidor?.

48.- La enzima malato deshidrogenasa citoplsmica cataliza la reaccin

+ +
L-malato + NAD D oxalacetato NADH + H

Dicha enzima ha sido aislada de corazn de cerdo y posteriormente purificada, estudindose el efecto que sobre la actividad
enzimtica tienen el AMP y la nicotinamida. Los ensayos se han realizado a 25 C conteniendo el medio de incubacin de la
enzima, concentraciones variables de sustrato, buffer borato sdico 50 mM, pH 7.5, y cido oxalactico 5 mM. La velocidad
de la reaccion se ha medido siguiendo la variacin de la absorcin del NADH a 340 nm.
-1
D absorbancia 340 nm min
NADH (mM) Control Nicotinamida AMP
200 mM 20 mM
0.200 1.250 0.833 0.769
0.100 1.080 0.625 0.526
0.066 0.909 0.476 0.400
0.050 0.833 0.400 0.322
0.040 0.800 0.333 0.270

a) Determinar KM para el NADH.

 b) Calcular KI para ambos inhibidores
c) En funcin de su estructura, justificar su accin inhibidora.

49.- La UDP-galactosa es un inhibidor de la enzima CMP-silico hidrolasa, aislada de membranas plasmticas de hgado de
rata. Esta enzima cataliza la reaccin:

cido CMP-silico cido silico + CMP.

En un estudio sobre la accin de dicho inhibidor, se midi la actividad de la enzima siguiendo la desaparicin de sustrato,
14 14
CMP- C silico o la aparicin de producto C silico, ambos separados por cromatografa de cambio inico. Los estudios
se realizaron en buffer Tris-HCl a pH 9, ya que previamente se determin este pH como ptimo para la enzima.
Los valores experimentales se indican en la tabla siguiente:
-2
(D CPM por tubo) x 10
Sin inhibidor Con UDP-Gal CMP-silico
1.65 mM mM
430 200 2
400 160 1.4
370 120 1
333 90 0.67
290 70 0.5

a) Calcular el valor de KM para la CMP-silico hidrolasa.

b) Qu tipo de inhibicin ejerce la UDP-galactosa?.
c) Cul es el valor de KI?.

50.- En Mycobacterium phlei se ha hallado un factor de acoplamiento unido a membranas, que interviene en los fenmenos
de fosforilacin existentes en la cadena respiratoria. Dicho factor ha sido purificado por cromatografa de afinidad,
observndose que existe actividad de ATP-asa.
Se han determinado sus propiedades cinticas utilizando como sustrato ATP y estimndose el fosfato inorgnico liberado
como una medida de la velocidad de reaccin. El medio de reaccin contena 160 mg de proteina purificada, sustrato,
MgCl2 4 mM; los ensayos se llevaron a cabo a 30 C y a pH 7.4.
a) Calcular KM.
Se ha ensayado el efecto del ADP sobre la actividad enzimtica, comprobndose que acta como inhibidor de la
reaccin.
b) Qu tipo de inhibicin se produce?. Calcular KI.
Datos experimentales:
-1 -1
mmoles Pi libre. min . mg proteina
ATP (mM) Sin ADP ADP
25 mM
5.0 50.0 11.1
2.5 33.3 7.7
1.0 20.0 4.2
0.7 16.6 3.1
0.5 12.5 2.4

51.- La glucosa-1-P es transformada en UDP-glucuronato por la UDP-glucosa pirofosforilasa de Acanthamoeba castellani, de

acuerdo con la reaccin siguiente:
+
glucosa-1-P + UTP + 2 NAD UDP-glucuronato + Ppi + 2 NADH

El curso de la reaccin puede seguirse espectrofotomtricamente.

Se ha descubierto que el PPi formado en la reaccin tiene un efecto de inhibicin no competitiva, con relacin al UTP,
cuando se utilizan concentraciones de glucosa-1-P no saturantes
Rudick y Weisman estudiaron la naturaleza de la inhibicin en el caso de utilizar concentraciones saturantes de glucosa-1-P
(10 mM). En la tabla siguiente se registran algunos de sus datos:
 -1 -1
UDP-glucuronato mmol min ml
UTP (mM) Sin PPi Con PPi
4 mM
1 0.32 0.152
0.5 0.303 0.147
0.1 .0222 0.123
0.033 0.129 0.089
0.02 0.091 0.069

a) A partir de estos datos deducir qu tipo de inhibicin ejerce el Ppi en estas condiciones.
b) Cul es el valor de KI?.

52.-El hgado de cerdo es capaz de metabolizar L-fucosa a 2-ceto-3-deoxi-L-fuconato. Nwokoro y Schachter han aislado una
deshidrogenasa NAD dependiente que acta sobre el 2-aceto-3-deoxi-L-fuconato (L-KDF) siendo el producto final de esta
reaccin el 2.4-diceto-5-monohidroxihexanoato.
Se han determinado las curvas de saturacin de la enzima por L-KDF y NAD, realizndose los ensayos con preparaciones
de enzima purificada, de la siguiente forma:
Sustrato: L-KDF. El medio de reaccin contena enzima, cantidades variables de sustrato, 2.5 mmoles de NAD y 0.2 mmoles
de Tris, pH 9.0. Las incubaciones se efectuaron a 37 C durante una hora y la velocidad de reaccin se sigui por la
variacin de absorbancia a 340 nm.
Sustrato: NAD. El ensayo fue igual que el anterior, sustituyndose el sustrato. La cantidad de 5-KDF se fij en 0.22 mmoles.
Los datos obtenidos se muestran en la tabla:

Sustrato L-KDF Velocidad inicial

-5 -1 -1
(Mx 10 ) mmoles ml h
5 34
10 60
20 90
30 97
40 103
80 92
100 90
120 87

Sustrato NAD Velocidad inicial

-4 -1 -1
(Mx 10 ) mmoles ml h
3.4
1.25
2.50 4.8
5.60 6.1
8.50 6.7
13.70 7.8
21.80 8.6
30.00 8.9
55.00 8.9
a) Calcular KM para ambos sustratos.
b) Qu diferencias existen entre el comportamiento del L-KDF y el NAD?.

53.- La enzima nitrato reductasa cataliza la reduccin de nitrato a nitrito. La velocidad de obtencin de nitrito se mide en
presencia de un agente reductor (ditionito sdico) para eliminar el oxgeno. La reaccin se inicia mezclando disoluciones de
nitrato con la enzima y se para al cabo de 10.00 min mediante burbujeo de aire a travs de la disolucin (lo que tambin
elimina el exceso de agente reductor). A continuacin, el nitrito obtenido se hace reaccionar con una serie de reactivos con
objeto de obtener un producto coloreado cuya absorbancia se mide a 540 nm frente a un blanco. El blanco consiste en una
disolucin idntica de la enzima tratada del mismo modo pero sustituyendo la disolucin de nitrito por un volumen igual de
agua desionizada. El volumen final de las disoluciones de medida es de 25.0 mL. En la tabla siguiente se muestran los datos
obtenidos:
-
[NO3 ], mM 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 X
A 0.092 0.153 0.193 0.226 0.250 0.175
 a) Describa tres mtodos utilizados para obtener los parmetros cinticos de la reaccin enzimtica, deduciendo las
ecuaciones correspondientes a partir de la ecuacin de Michaelis-Menten.
b) Calcular, utilizando el mtodo de Agustinson-Hofstec, la velocidad mxima y la constante de Michaelis para este
proceso.
c) La disolucin problema se prepar a partir de 0.0196 g de muestra en polvo seca. Calcular el porcentaje de nitrato
presente en dicha muestra.
DATOS: Pa(N) = 14.006 u..m.a.; Pa(O) = 15.999 u.m.a.

54.- Para estudiar la velocidad de una reaccin enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato, se prepararon series
de incubaciones con diferentes concentraciones de sustrato y una cantidad constante de enzima, habindose determinado
previamente las condiciones ptimas de la reaccin.
Las velocidades iniciales obtenidas para la concentracin de sustrato se indican a continuacin:
-1 -1
Concentracin de azcar vglucosa, min vmanosa, min
mM
0.01 150 82
0.02 256 150
0.10 600 450
0.30 770 670
0.40 818 750

a) A partir de los datos anteriores, calclese vmax y KM para ambos tipos de sustratos.
b) Por cul de los sustratos presenta mayor afinidad la enzima?. Qu tipo de inhibicin ejercera el sustrato por el que
la enzima presenta menor afinidad sobre la reaccin enzimtica ms favorecida?.
c) Si la concentracin de enzima en cada mezcla de reaccin se incrementa al doble, cmo varan KM y vmax?.
d) Justificar cul sera la concentracin de enzima libre a una concentracin 0.7 mM de sustrato?.
e) Calcular el valor de la velocidad inicial para concentraciones de sustrato de 0.5 y 1.0 mM