Metodos de Separaciones Especiales PDF

Quimica Analtica Cuantitativa Docente: MSc.
Edwin Maldonado
METODOS DE SEPARCIONES ESPECIALES

1. INTRODUCCION
Desde el siglo pasado las separaciones analticas se llevaban a cabo por mtodos clsicos
como son la precipitacin, destilacin y extraccin. Los crecientes esfuerzos por conocer ms
sobre la composicin y funcin de las protenas han obligado a los cientficos a buscar
tcnicas, cada vez, ms precisas.
Para elegir una tcnica de separacin, adems de tener en cuenta los criterios econmicos y
de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las
propiedades fsicas y estructurales de las molculas que se pretende separar, o de las
caractersticas de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del anlisis
(sensibilidad, resolucin, tiempo de anlisis, necesidad de una deteccin especfica).
El mtodo de seleccin incluye los pasos necesarios para la obtencin, preparacin y posible
fraccionamiento de la muestra, la aplicacin de la tcnica analtica adecuada y el tratamiento
de los datos obtenidos.
Las tcnicas analticas ms empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes

grupos: tcnicas de separacin y tcnicas espectroscpicas. Las tcnicas espectroscpicas
proporcionan, para cada compuesto analizado, una informacin compleja, relacionada con sus
caractersticas estructurales especficas, por otro lado las tcnicas de separacin se utilizan
para resolver los componentes de una mezcla y la seal obtenida puede utilizarse con fines
analticos cuantitativos o cualitativos.
Actualmente las separaciones analticas se realizan fundamentalmente de cromatografa y

electroforesis.
Los Mtodos de Separacin se basan en diferencias entre las propiedades fsicas de los
componentes de una mezcla, tales como: Punto de Ebullicin Densidad,, Presin de Vapor,
Punto de Fusin, Solubilidad, etc.
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Quimica Analtica Cuantitativa Docente: MSc. Edwin Maldonado
2.1 CROMATOGRAFIA
1.1.1. INTRODUCCION
La cromatografa es una tcnica que se emplea para separar entre si loscomponentes de una
sustancia. Esta tcnica fue creada por el botnico ruso Michael Tswett en 1906, el cual llam
a su mtodo cromatografa, palabra griega que significa escritura a color, porque lo utilizo
para separar compuestos coloreados. Tswett llev a cabo una extraccin de una mezcla de
pigmentos de hojas verdes utilizando ter de petrleo, un disolvente no polar, y descubri
que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto a travs de una columna,
un tubo de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza).Tswett utiliz como detector del
experimento la simple observacin, ya que los compuestos que separ tenan color y era
posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna,
demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos que se encuentran en las
hojas de las plantas.
A pesar de que el mtodo cromatogrfico prometa simplificar la separacin de sustancias de

mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la dcada de los 30 y principio de los 40
cuando se empez a desarrollar la tcnica teniendo este mtodo diversas aplicaciones. En la
actualidad la cromatografa se emplea principalmente para separar compuestos incoloros
pero el nombre permanece para describir cualquier tcnica que se base en los mismos
principios.
La columna sencilla de Tswett, un tubo vertical de cristal, abierto por su parte superior,
rellena de un slido comn donde el eluyente se mueve conducido por su propio peso, ha
evolucionado hasta los modernos equipos que hoy conocemos (fig1).
Fig. 1. Cromatgrafo de gases con espectrmetro de masas
Fuente propia
Fig. 2. Equipos para HPLC (Cromatografo de alta resolucin para lquidos)
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Fuente propia
1.1.2. BASE CIENTIFICA
En la cromatografa se separan los componentes de las mezclas a medida que son

transportadas por un fase fluida mvil a travs de una fase estacionaria slida o lquida, la
separacin de las molculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un
equilibrio en la distribucin entre la fase mvil y la estacionaria, y esta separacin se puede
realizar en funcin de sus cargas, masas, tamaos moleculares, la polaridad de sus enlaces,
sus potenciales redox.
Como resultado hay una gran variedad de tcnicas para llevar a cabo la separacin de una
sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos segn el mecanismo de separacin:
Cromatografa de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad.

Cromatografa de adsorcin: se basa en la afinidad de adsorcin.
Cromatografa de exclusin: separa solutos segn el peso molecular.
Cromatografa de intercambio inico: separa solutos segn la carga inica.
Tambin se pueden clasificar segn el estado de la fase mvil en:
Cromatografa de gases: la fase mvil es un gas y pueden ser dos sistemas:
Cromatografa gas-liquido
Cromatografa gas-slido
Cromatografa lquida: la fase mvil es un liquido y puede ser:
Cromatografa liquido-liquido
Cromatografa liquido-slido
Cromatografa de exclusin esfrica
Cromatografa de intercambio inico
Las nicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografa son las insolubles y
aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria.
Dentro de las tcnicas cromatografas no se incluyen los mtodos que utilizan campos
elctricos para separar molculas cargadas, mtodos que se denominan electro separaciones,
electro migraciones o electroforesis.
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El proceso cromatogrfico, aparentemente simple, es en realidad una compleja unin de

fenmenos tales como hidrodinmica, cintica, termodinmica, qumica de superficie y
difusin. Hasta la fecha se han propuesto muchas teoras, que incluyen complejos
matemticos para poder explicar el comportamiento de los solutos en las columnas
cromatogrficas, por citar alguna de estas teoras las ms estudiadas son:
Teora de los Platos Tericos (Martin & Synge).

Teora Cintica (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer).
Teora Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).
1.1.3. TERMINOLOGIA EN CROMATOGRAFIA
Absorcin: es la retencin de una especie qumica por parte de una masa y

depende de la tendencia que tiene sta a formar mezcla o a reaccionar
qumicamente con la misma.
Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorcin y de reparto.
Adsorcin: Es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la
superficie de un slido, quedando limitado el fenmeno a la superficie que separa
las fases o superficie interfacial, esta retencin superficial puede ser fsica o
qumica.
Cromatografa en fase inversa: Cromatografa con una fase estacionaria no
polar y una fase mvil polar.
Cromatografa en fase normal: Cromatografa con una fase estacionaria polar
y una fase mvil no polar.
Disolvente o revelador: Cualquier fase mvil.
Elucin: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.
Eluyente: La fase mvil una vez que se extrae de la columna.
Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna cromatogrfica
durante la cromatografa y que retiene algn componente de la muestra, posee
una gran rea superficial y puede ser un slido o un lquido dispuesto sobre un
slido que acta como soporte.
Fase mvil: Es un fluido que puede ser lquido, gas o fluido supercrtico que se
usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a travs de la columna
cromatogrfica y la fase estacionaria.
Origen: Lugar fsico donde se coloca la muestra al principio.
Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de
cromatografa.
Soporte: El material slido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la
fase estacionaria lquida en su sitio.
Sorbente: Cualquier fase estacionaria.
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CROMATOGRAMA
Fuente propia
Adems de observar el resultado final del proceso, se pueden realizar las medidas
continuamente para obtener una informacin global del proceso pasando la muestra a travs
de un detector instrumental, normalmente los transductores del detector se sitan al final de
la columna.
El detector registra los cambios que se producen en alguna propiedad del eluyente que pasa
por l, estos cambios son reproducidos y registrados en forma de grfica, sta grfica que
recoge la respuesta del detector en funcin del tiempo se denomina cromatograma.
En las graficas se observa la aparicin de una serie de picos a lo largo del tiempo,
generalmente la respuesta del detector es linealmente proporcional a la concentracin de
analitos en la fase mvil, la forma de cada pico muestra la distribucin de concentracin del
componente asociado a dicho pico.
En el cromatograma el eje horizontal corresponde al volumen, o al tiempo equivalente. En la
cromatografa moderna es frecuente mantener constante la velocidad de flujo
(volumen/tiempo), as mediante esta relacin se puede reflejar el tiempo en el eje horizontal:
velocidad de flujo x tiempo = volumen
El cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de separacin

ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes
de la mezcla separada.
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Fuente propia
En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal (obtenida, por

ejemplo, a partir de un espectrofotmetro, un espectrmetro de masas o cualquier otro de los
diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos
existentes en la muestra. En el caso de un sistema ptimo, la seal es proporcional a la
concentracin del analito especfico separado.
Cromatograma obtenido de la secuenciacin de un fragmento de ADN
Fuente propia
2.1.4. CLASIFICACION DE LA CROMATOGRAFIA
En la cromatografa en columna, la fase mvil puede ser un lquido o un gas, y

segn el caso se denominan respectivamente cromatografa lquida y
cromatografa de gases . Esta fase mvil fluye a travs del relleno de la
columna, arrastrando los componentes de la mezcla, que son selectivamente
retenidos por al fase estacionaria. EL flujo de la fase mvil se mantiene constante
a travs de todo el proceso y de esta manera se logra que cada componente de la
mezcla sea eluido de la columna como un compuesto puro, disuelto en la fase
mvil. A esta tcnica se le llama cromatografa de elusin. De acuerdo con la
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naturaleza de las fases involucradas y con los mecanismos de separacin, es

posible distinguir diferentes tipos de cromatografa, como se indica en la figura
Fuente propia
FIG. - Mtodos cromatogrficos. CGS: cromatografa gas-slido; CGL: cromatografa gas-

lquido; CLS: cromatografa lquido-slido; CLL: cromatografa lquido-lquido; CFQU:
cromatografa de fase qumicamente unida; CII: cromatografa de intercambio inico; CCF:
cromatografa de capa fina; CP: cromatografa de papel; CE: cromatografa de exclusin; CPG:
cromatografa de permeacin en gel; CFG: cromatografa de filtracin en gel.
Una serie eluotrpica, es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actan como
fase mvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria.
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Tipos Fase mvil Fase estacionaria

Cromatografa en papel Lquido Lquido ( molculas de agua contenidas en la celulosa del papel )
Cromatografa en capa fina Lquido Slido
Cromatografa de gases Gas Slido o lquido
Cromatografa lquida Slido o lquido
Lquido (polar)
en fase inversa (menos polar)
Cromatografa lquida Lquido Slido o lquido
en fase normal (menos polar) (polar)
Cromatografa lquida
Lquido (polar) Slido
de intercambio inico
Cromatografa lquida
Lquido Slido
de exclusin
Cromatografa lquida
Lquido Slido
de adsorcin
Cromatografa de
Lquido Slido
fluidos supercrticos
2.1.5. CLASIFICACION SEGN EL PROCESO DE DESARROLLO
Segn el procedimiento en que se desarrolla se utiliza la siguiente clasificacin, que fue la

usada por Tiselius en 1940:
Desarrollo por elucin.

Desarrollo por desplazamiento.
Anlisis frontal.
Desarrollo por elucin

Representa el concepto bsico de la separacin cromatogrfica y es la tcnica ms usada en
los distintos mtodos cromatogrficos (gaseosa, lquido-gas, lquido-lquido, slido-lquido).
Para describir esta tcnica considrese una mezcla de slo dos componentes. Dicha mezcla se
introduce en el extremo superior de una columna adsorbente y sus componentes se separan
en zonas, al pasar uno o ms eluyentes a travs de la columna, debido a las distintas
afinidades entre los componentes y ambas fases.
La fase mvil es adsorbida dbilmente por la fase slida estacionaria. Este ideal terico de
desarrollo por elucin no siempre se consigue en la prctica. Es un mtodo analtico esencial.
Desarrollo por desplazamiento

Consiste en desarrollar con un disolvente que sea adsorbido por la fase estacionaria con
mayor fuerza con que adsorbe a los componentes de la mezcla, al contrario que el desarrollo
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por elucin. A medida que el disolvente pasa a lo largo de la columna, desplaza a la mezcla,
que al mismo tiempo se separa parcialmente.
Parte del material menos fuertemente adsorbido se recupera de forma pura, seguido por una
mezcla (interfase) y seguido posteriormente del otro componente en forma pura. Es un
mtodo preparativo til.
Anlisis frontal
Consiste en la aplicacin continua de una mezcla en el origen. En principio el componente
menos fuertemente adsorbido fluye a lo largo de la columna, mientras que el ms
fuertemente adsorbido se acumula cerca del origen. Sin embargo existe un lmite en la
capacidad del adsorbente y, cuando este lmite se alcanza, tambin el componente ms
fuertemente adsorbido empieza a desplazarse a lo largo de la columna. Por esto, las primeras
fracciones contendrn el material menos fuertemente adsorbido; ms tarde aparecer una
mezcla de ambos componentes. Es una tcnica preparativa ms que analtica.
2.1.6. PRINCIPALES PARMETROS CROMATOGRFICOS
1.- Tiempo cero o tiempo de retencin del componente inerte (t0).

El tiempo cero (t0) o tiempo muerto (tm), es el tiempo de retencin del componente inerte o
gas portador.
2.- Tiempo de retencin de un componente (tii).

El tiempo de retencin (ti o tR) es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce
la mezcla y el instante en que se detecta la seal propia del componente en su mxima
intensidad. Los tiempos de retencin no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna
cromatogrfica.
3.- Tiempo de retencin corregido de un componente (t'i).

Es le tiempo que transcurre entre la aparicin de la seal que corresponde a un componente
inerte y a la del componente considerado:
t'i = ti - t0
4.- Tiempo de retencin relativa (rip).

Es la razn entre los tiempos de retencin corregidos del componente considerado, i, y de
otro, p, que se toma como patrn de referencia:
5.- Volumen de retencin de un componente (VR).

Es el volumen necesario de fase mvil para transportar el soluto de un extremo a otro del
sistema cromatogrfico. Se define como:
VR = tR-Fm
donde VR es el volumen de retencin expresado como el producto del tiempo de retencin de

un componente (tR) y el flujo de la fase mvil (Fm). Y el flujo de fase mvil se define como:
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donde d es el dimetro interior del soporte utilizado y es la porosidad de la fase

estacionaria, que suele tener un valor de 0,4 para empaquetamientos slidos.
6.- Volumen cero o muerto (V0 o Vm).

Es el volumen de eluyente que se consume sin que se detecte ningn componente. Se define
igual que el volumen de retencin pero el tiempo utilizado es el tiempo muerto:
Vm = tm * Fm
7.- Volumen de retencin verdadero (V'R).

El volumen de retencin verdadero de un componente es la diferencia entre el volumen de
retencin del componente y el volumen muerto.
V'R = VR - Vm
o lo que es lo mismo:
V'R = (tR - t0) - Fm
8.- Coeficiente de particin o de reparto de un componente (K).

Se define como el cociente entre la concentracin de componente presente en la fase
estacionaria y la concentrecin de componente presente en la fase mvil:
donde Cs y Cm son las concentraciones de componente presente en las fases estacionaria y

mvil respectivamente. El valor de K representa el valor de la pendiente de la recta que se
obtiene al representar Cs frente a Cm .
9.- Velocidad lineal media a lo largo de una columna (u).

Es la velocidad lineal media a la que se desplazan las molculas de soluto a lo largo de una
columna. Viene dada por la expresin:
donde u es la velocidad lineal media, L es la longitud de la columna y tm es el tiempo muerto.
10.- Factor de selectividad ().

Es la relacin entre los tiempos de retencin de dos componentes:
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donde es el factor de selectividad, tRy y tRx son los tiempos de retencin de los componentes
x e y , y Kx y Ky son los coeficientes de distribucin de los componentes. Dependiendo del
valor de se tiene una idea aproximada de como ser la separacin cromatogrfica:
> 2 se obtiene una mala separacin ya que son necesarios periodos muy largos para
realizarla.
1< <2 se obtiene una buena separacin cromatogrfica.
11.- Factor de capacidad (K').

El factor de capacidad relaciona volmenes o tiempos de retencin de un componente
respecto a la fase mvil. Se puede definir como:
Es el cociente entre las probabilidades de encontrar una molcula determinada de soluto en la

fase estacionaria o en la fase mvil, o lo que es lo mismo, el cociente entre el tiempo de
permanencia de dicha molcula en la fase estacionaria y en la fase mvil.
12.- Eficiencia
Para definir la eficacia se utiliza el concepto de piso terico, y se define ste como la seccin
terico-transversal en la cual se realiza el equilibrio de particin durante el flujo de fase mvil.
Cuanto mayor se el nmero de platos terico (N) mayor ser la eficiencia de la columna.
El nmero de platos tericos mide la capacidad de la columna para separar los componentes,
no la retencin de los mismos. La eficiencia o el nmero de platos se puede observa
directamente a partir del cromatograma, observando la agudeza de los picos.
Donde N es el nmero de platos tericos, L es la longitud de la columna, H es la altura de

cada plato, t'R es el tiempo corregido de retencin de un componente y ai es la anchura del
pico cromatogrfico. Y:
Si H tiene un valor pequeo, la distancia entre platos es menor y por tanto la eficiencia ser
mayor. Por el contrario, si H es grande la columna es poco eficiente para separar ese
componente ya que sus molculas estarn muy difundidas.
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La velocidad de la fase mvil influye en la eficiencia del sistema cromatogrfico, ya que si la

velocidad es pequea los componentes tendrn ms tiempo parta que se pueda realizar el
equilibrio de reparto, por lo que el nmero de platos ser mayor y la altura de los platos
menor.
13.- Resolucin (R o Rs).

Es el parmetro que expresa el grado de separacin que se puede obtener en un sistema
cromatogrfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un
sistema cromatogrfico para dos componentes. Se define como:
Donde Rs es la resolucin, tRA y tRB son los tiempos de retencin de los componentes A y B,
y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes.
La resolucin puede observarse directamente sobre el cromatograma de picos. Se tendr una

buena resolucin si los picos no se solapan, y est perfectamente delimitado cada pico, sin
que coincida el final de uno con el principio del siguiente.
Si el valor de la resolucin est prximo a 0,7 se obtendr una mala resolucin quedando los
picos solapados, de forma que se distinguen las crestas, pero no la base, y si el valor de la
resolucin est prximo a 1,5 se obtendrn unos picos bien delimitados por lo que se
obtendr una buena resolucin.
Una pobre resolucin es debida principalmente a:
Hay demasiada muestra en la columna.

La columna o placa es corta.
La fase mvil no discrimina entre los componentes.
La columna es demasiado gruesa.
2.1.5.1. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION ESFERICA
2.1.5.1.1. FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BASICOS
La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa por filtracin

en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao. Generalmente se trata
de una cromatografa de baja resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales
del proceso de purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de la estructura
terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas purificadas.
La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna por el

cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms precisamente,
segn su radio de Stokes.
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En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que

forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos, la columnas se empaquetan con
pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados. En
consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas
molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las
suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros quedan conectados formando
una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las molculas
que acceden al interior de esta.
La fase estacionaria est compuesta de partculas de slice o polmeros en forma de gel, que
contienen una red de poros uniformes. La retencin est basada en el tamao de las
molculas. Si las molculas con ms grandes que los poros, no pueden penetrar en ellos
(slo pasan las partculas), y son las primeras que se eluyen. Si las molculas son ms
pequeas que los poros, penetran en ellos recorriendo caminos mucho ms largos, y sern
las ltimas en eluir. Si las molculas tienen un tamao intermedio, podrn penetrar en los
poros ms grandes (camino recorrido intermedio). Por tanto, el tiempo de residencia medio
en los poros, depende del tamao afectivo de las molculas de los analitos.
La retencin no se controla con la fase mvil, se controla eligiendo la fase estacionaria, cuya
eleccin vendr determinada por:
Si la separacin se realiza en fase acuosa (filtracin en gel), o en fase orgnica.

El rango de pesos moleculares (tamaos) que contienen la muestra que queremos
analizar.
Cabe observar, que este tipo de separacin difiere de los dems que han sido considerados,
en que no implica una interaccin qumica o fsica entre los analitos y la fase estacionaria. De
hecho, se procura evitar este tipo de interacciones, dado que originan una mala eficacia de la
columna.
La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel o de

tamiz molecular) es una de las tcnicas ms sencillas de las empleadas en la separacin de
protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se realiza en columnas cilndricas
rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fn y que pueden ser de varios
tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A),
poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por
grnulos (particulas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamao
de dimetro determinado.
Hypothetical partial structure of sephacryl

(Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao)
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Fuente propia
Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao, a travs de una columna
de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el dimetro de los poros de
las particulas, slo podrn moverse en su camino, a travs de la fase estacionaria, en el
espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto, no se vern retrasadas en su descenso.
En cambio aquellas molculas capaces de penetrar en las partculas se vern retrasadas por la
fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamao. Por lo tanto, las molculas
eluyen en este tipo de cromatografa por orden decreciente de tamao molecular.
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INSTRUMENTACION
Mecanismo de la cromatografa de exclusin
Fuente propia
Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las particulas de menor masa molecular.
De ah que las particulas de mayor peso molecular salgan primero.
Diferentes compartimentos dentro de la columna
Fuente propia
Diagramas de representacin de Vt y Vo la cual ser la de sustraccin deVt-Vo

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2.1.5.1.2. APLICACIONES
Como aplicacin referida a productos alimenticios en cromatografa por exclusin de tamaos:

separacin de cidos grasos, determinacin de glucosa fructosa y sacarosa en zumos
enlatados.
Cambios de buffers. Despus de cromatografas de intercambio inico, afinidad o

de interaccin hidrofbica.
Desalado. Protenas, polisacridos, polipptidos etc. Pueden ser desalados antes
de ser concentrados o liofilizados.
Eliminacin de fenol de las preparaciones de cidos nuclicos.
Eliminacin de compuestos de bajo peso molecular marcados. I 125, FITC de las
soluciones de marcaje de protenas.
Para reacciones entre macromolculas y reactivos de bajo peso molecular.
Eliminacin de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas.
Purificacin de macromolculas.
Determinacin del peso molecular de las protenas.
2.1.5.2. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)
Es un procedimiento rpido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para

identificar/caracterizar o para determinar semi cuantitativamente componentes individuales.
La separacin se basa en que las sustancias investigadas se reparten de modo diferencial

entre una fase estacionaria y otra mvil: en la TLC el eluyente (fase mvil) se desplaza por
una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando as los componentes individuales
de la mezcla de sustancias ms o menos lejos dependiendo de su solubilidad y/o de su
comportamiento frente a la adsorcin. Al contrario, que en la cromatografa en columna, el
proceso separativo transcurre en un sistema abierto, la placa separativa plana. El recorrido
particular de cada sustancia se emplea as para su identificacin.
Las separaciones se realizan generalmente por el .procedimiento ascendiente. introduciendo

el borde inferior de la placa cromatogrfica en el solvente, qu ser succionado por accin de
las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la placa.
La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de un

adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son,
pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la
extensin, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las
placas cubiertas. Es preciso tambin poder guardar con facilidad las placas preparadas y una
estufa para activarlas.
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La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser
un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria,
de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos
polares.
Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehdo
aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas
VENTAJAS DE LA CROMATOGRAFA EN CAPA FINA
La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos
cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el utillaje que precisa es
ms simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la
separacin es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel
destruiran el cromatograma. El mtodo es simple y los resultados son fcilmente
reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para fines analticos.
Fuente propia
La Cromatografa de Capa Fina presenta una serie de ventajas respecto a cromatografas

alternativas, como es la de papel, tales como las siguientes:
Una mayor resolucin, obtenindose por lo general manchas ms pequeas.

Una mayor velocidad de separacin.
Pueden utilizarse un gran nmero de materiales como soportes y disolventes.
Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperacin es
muy simple.
2.1.5.2.2. INSTRUMENTACION
Cubeta cromatogrfica (con tapa hermtica); la mayora de las veces se trata de la

cubeta .Normal. (Profundidad del espacio para el gas: 3mm)
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Placas de cromatografa: preparadas por uno mismo o ya fabricadas.

Pipetas de microlitro
Recipiente de vidrio con pulverizador
Probeta o matraz Erlenmeyer con tapn (para preparar y mezclar la fase mvil)
Secador
Plantilla para TLC o regla
En caso necesario: lmpara UV para comprobar la fluorescencia o la disminucin de
la misma.
ADSORBENTES
Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las partculas del
adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte, aunque
tambin se le puede aadir un adherente (yeso,...). Algunos de los adsorventes ms
utilizados son:
Celulosa
Almidn
Azucares
Gel de slice (silicagel)
xido de aluminio (almina)
Carbn activo (carbn en polvo)
Kieselguhr
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y animales.
Silicagel
El gel de slice o cido silcico es uno de los ms utilizados, es dbilmente cido, su pH oscila
entre 4-5. Con lo cual no se deber utilizar con sustancias que se corrompan con los cidos.
Los geles de slice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor
tambin se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. El tamao del grano suele
ser de 10 a 40 micras () y el tamao de poro vara de 20 a 150.
Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de clcico

semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. Tambin han sido incorporados dos
indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de
gel de slice.
Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar
los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes lipfilos (esteroides,
cidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina
cromatografa de fase reversa (silanizado).
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Almina
La almina u xido de aluminio es un adsorbente ligeramente bsico debido a que en el

proceso de extraccin de la almina a partir de la bauxita quedan algunas molculas de
hidrxido de aluminio adheridas a la almina, dndole a sta un carcter bsico. No consigue
un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de slice.
La almina puede ser tratada qumicamente para conseguir alminas cidas, bsicas y
neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas. Es un adsorbente de
carcter polar, de tal forma que retendr con mayor avidez a los componentes polares.
PREPARACIN DE PLACAS
El adsorvente se desle en agua destilada. Para mezclar la papilla homogneamente es

preferible agitar de modo mecnico. La proporcin de adsorbente y agua depende del tipo de
adsorbente. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general, no
obstante, habrn de consultarse la instrucciones del fabricante.
Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, lminas de vidrio, pero en la

actualidad tambin se utilizan lminas de otros compuestos orgnicos ms flexibles.
Dependiendo del tipo de separacin que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizar un
tamao de placa u otro. En general para realizar una separacin preparativa de un gramo de
muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80 ml. de
agua destilada.
Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adicin de compuestos

tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado. En la preparacin de las
placas tambin se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes.
Cabe destacar la adicin de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le denomina

argentacin, y se utiliza para separar componentes insaturados.
El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en general suele
ser de:
0.1-0.2 mm. para separaciones analticas.

0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.
La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectaran al desarrollo del proceso
cromatogrfico. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de
forma mecnica placas homogneas del espesor deseado. Si no se disponer de extensor, el
proceso a seguir es el siguiente:
1. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.

2. Agitar enrgicamente.
19
3. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.

4. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
5. Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.
Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo despus de cubrirlas;
luego se colocan en bandejas metlicas. En este momento puede activarse el agente
adsorbente, bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien
calentndolas durante 30-60 minutos a 105-110 C (las placas de celulosa no deben
calentarse ms de 10 minutos a 105 C) para expulsar as el aire. Es conveniente dejar secar
las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se produciran por efecto del
cambio de temperatura.
APLICACIN DE LAS MUESTRAS
Los productos a examinar se disolvern, cuando sea posible, en un disolvente orgnico no

polar que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore despus
de la aplicacin.. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla
cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de
manera que al aplicar 2 l resulta en la carga 20 g de producto slido. Muchos reactivos de
revelado llegan a detectar 0.1 g de material; por esto con esta carga puede llegarse a
observar un 5% de impurezas.
Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el proceso de

siembra de la muestra a analizar. Tambin pueden usarse tubos capilares. El proceso de
siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la
placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centmetro aproximadamente.
El punto de aplicacin de la muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa
solo quedar la muestra a analizar.
ELECCIN DEL ELUYENTE
La eleccin del eluyente depender lgicamente del componente que se va a separar y del
material en que la separacin se lleva a cabo.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
Eter de petrleo.
Eter dietlico.
Ciclohexano.
Acetato de etilo.
Tetracloruro de carbono.*
Piridina.
Benceno.*
20
Etanol.
Cloroformo.*
Metanol.
Diclorometano.
Agua.
cido actico.
*compuestos cancergenos.
En la eleccin del eluyente influyen varios factores:
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.
a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente.
b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente ms polar.
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa
para aplicar otros eluyentes ms polares, hasta dar con el ms apropiado.
Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar varias muestras
distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro
de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de
forma que se aprecie el eluyente con el cual la separacin se realiza de una manera ms
eficaz.
DESARROLLO DE LA CROMATOGRAFA
21
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el mtodo

ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la
accin de la capilaridad. La cromatografa se realiza en una cubeta. Para conseguir la mxima
saturacin posible de la atmsfera de la cmara, las parades se tapizan con papel impregnado
del eluyente. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las
paredes, cosa que no debe olvidarse.
Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del desarrollo, para
permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los
30 minutos. El tiempo de una cromatografa cualitativa suele ser de un par de minutos,
mientras que el tiempo de una cromatografa preparativa puede llegar a un par de horas.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una lnea
dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de RF.
Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.; parece ser la ms conveniente para medir
valores de RF. Despus del desarrollo, las placas pueden secarse rpidamente con una
corriente de aire caliente.
Si la placa se estropea por accin del aire o de la luz, se secar en una cmara que contenga
un gas inerte o aislada de la luz.
Fuente propia
LOCALIZACIN DE SUSTANCIAS
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dichos

compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:
Mtodos qumicos.
Mtodos fsicos.
Mtodos qumicos
Consisten en ralizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y los componentes
separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un
22
pulverizador de vidrio y una pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire
comprimido.
Es preferible pulverizar con las placas en posicin horizontal. Si el reactivo revelador es

peligroso o muy corrosivo, la pulverizacin deber realizarse en una vitrina de gases bien
ventilada.
La pulverizacin se realizar poco a poco. En cromatografa en capa fina no puede realizarse

el baado del cromatograma (en cromatografa en papel s).
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con
los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con
el tiempo con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con los
componentes orgnicos produciendo manchas negras.
El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente separado.
Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).

Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos).
Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
Ninhidrina (para aminocidos).
Mtodos fsicos
El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al
colocar la placa bajo una lmpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de
onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros
casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden
ser detectados directamente en una lmpara de ultravioleta.
CONSTANTES Rf Y Rx
La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posicin de un

compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente.
Se define como:
23
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha,

los clculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF sean reproducibles deben
ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria,
cantidad de muestra). El mximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF
entre 0.65 y 0.7.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se
desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los RF y si son distintos,
puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario
si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo.
Tambin se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X), que tenga
una posicin de desarrollo conveniente; todos los dems compuestos sobre la placa se
relacionan con ste. De esta manera se tiene el , RX , ya que:
Fuente propia
CROMATOGRAFA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA
Para mejorar una separacin incompleta, se combinan dos pasos de cromatografa mono
dimensional de la manera siguiente:
1 paso: cargar la muestra en una esquina de la placa y desarrollarla en sentido

ascendente como se describa ms arriba.
2 paso: girar 90 la placa desarrollada y seca, de manera que la mezcla ya separada

parcialmente se encuentre en el borde inferior, a continuacin se desarrolla en sentido
ascendente con un segundo eluyente.
La investigacin y la determinacin se realizan como ya han sido descritas anteriormente.
DETECCIN Y CUANTIFICACIN
24
La deteccin y localizacin de las manchas en la placa de TLC se hace observando los cambios
en la fluorescencia, o absorcin en el U.V., de un indicador que se incorpor a la fase
estacionaria.
Toda la placa fluoresce bajo luz UV cuando no hay solutos presentes. Los lugares en los que
reside el soluto aparecen como manchas oscuras. Tambin podemos observar el color de los
compuestos despus de reaccionar con reactivos especficos para grupos o metales, rociados
sobre la placa, como la fluorescamina para aminas.
Existen instrumentos para determinar directamente la fluorescencia y/o color de las manchas
en la placa. Los instrumentos deben ser capaces de cuantificar la medida sobre el rea total
de la mancha.
Es una tcnica de gran valor para separar compuestos de todo tipo (orgnico, inorgnico,
polar y no polar) dado su versatilidad segn el solvente empleado.
2.1.5.3. CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)
En la cromatografa lquida los componentes de una mezcla son llevados a travs de una
fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase mvil lquida.
Las separaciones estn basadas en las diferencias de la velocidad de migracin entre los
componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su
interaccin con las fases.
25
Fuente propia
Se lleva a cabo una cromatografa lquida en fase normal cuando la fase estacionaria es
relativamente polar y la fase mvil es relativamente apolar. Se realiza una cromatografa en
fase inversa cuando la fase estacionaria es relativamente apolar y la fase mvil es
relativamente polar.
Hay cuatro tipos bsicos de cromatografa en los que la fase mvil es un lquido:
Cromatografa de reparto, para especies poco polares pero no inicas de masa

molecular < 104 g/mol.
Cromatografa de adsorcin o cromatografa lquido-slido, para especies no polares,
ismeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular < 104 g/mol.
Cromatografa de intercambio inico, para especies inicas de masa molecular < 104
g/mol.
Cromatografa de exclusin por tamao o cromatografa en geles, para solutos con
masa molecular >104 g/mol.
La elucin de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la

muestra disuelta en la fase mvil a travs de una columna de fase estacionaria por agregado
de disolvente fresco. La porcin de muestra se introduce por la parte superior de la columna
(tiempo t0), los componentes se distribuyen por s mismos entre las dos fases segn la
naturaleza qumica de stos con respecto a las fases mvil y estacionaria. Adicciones
posteriores del disolvente llevan a las molculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta
que salen de ella en una tiempo determinado (tx)
COLUMNA CROMATOGRFICA
Fuente propia
26
La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fraccin de tiempo que ha necesitado

para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta velocidad ser
pequea para solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria, y ser grande para
solutos que tengan mayor afinidad por la fase mvil.
El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la seal se transforma en una

grfica en funcin del tiempo, un cromatograma, que consta de una serie de picos
simtricos. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa
(posicin en el eje) como cuantitativamente (rea bajo los picos) los componentes de la
muestra.
La cromatografa cuantitativa se basa en una comparacin de la altura o del rea del pico
de un analito con el de uno o ms estndares. Ambos parmetros varan linealmente con la
concentracin. La cromatografa cualitativa se basa en la comparacin de la posicin de
los picos (tiempos determinados de retencin) con cromatogramas estndares.
La efectividad de la columna cromatogrfica para la separacin de solutos depende de las

velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. La eficiencia mxima para la
cromatografa lquida ocurre a muy bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la
eficiencia de la columna si se disminuye el tamao de la partcula del empaque de la columna,
se reduce la viscosidad de la fase mvil o se incrementa la temperatura.
En una primera etapa, la cromatografa de lquidos se llevaba a cabo en columnas de vidrio

con dimetros de 1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas partculas de la fase estacionaria
no superaban las150-200 m de dimetro a fin de asegurar unos caudales razonables. Incluso
as, los tiempos de separacin eran largos, podan llevar varias horas.
La cromatografa lquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid
Chromatografy) es el mtodo ms sofisticado y moderno de la cromatografa lquida, que
utiliza partculas de fase estacionaria para el interior de la columna con dimetros muy
pequeos para aumentar la eficiencia, entorno a 3-10 m. As, se ha conseguido reducir el
tamao de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de dimetro en la HPLC, y el tiempo
necesario para la separacin, de minutos a 1h.
FOTOGRAFA DE LOS INTRUMENTOS BSICOS DE LABORATORIO PARA LA HPLC:
27
Fuente propia
Para la cromatografa lquida se necesitan varios aparatos.
Este es un esquema del conjunto de aparatos necesarios:
28
Fuente propia
Fuente propia
Las columnas de HPLC estas hechas de acero inoxidable, con un dimetro interno de 2-5
mm y una longitud variable de 10 a 30 cm, dependiendo del dimetro de las micropartculas
que contiene la columna (fase estacionaria), que puede ser de 3 -10m. Como cierre de las
columnas se utilizan placas filtrantes de acero que no dejen escapar las micropartculas de la
columna. En muchos casos se utiliza una precolumna para eliminar contaminantes y partculas
de polvo.
Distintos tamaos de columnas:
29
Fuente propia
La mayor parte de los instrumentos comerciales modernos estn equipados con

calentadores de columna, que controlan la temperatura desde la cercana al ambiente
hasta 150 C. Manteniendo la temperatura constante se obtienen mejores cromatogramas.
Existe una gran variedad de materiales de relleno de las columnas segn las distintas separaciones.
Bsicamente, las micropartculas utilizadas estn compuestas de slice, aluminio o resina. Pueden ser
de dos tipos:
Partculas enteramente porosas, de forma irregular y dimetro 3-10m.

Partculas esfricas de superficie porosa, con dimetros de 30-60m y un ncleo
imposible de atravesar.
Son necesarias bombas de presin de varios centenares de atmsferas para conseguir

velocidades de flujo razonables con micropartculas de 3-10m debido a la resistencia que
ofrecen. Como consecuencia, el equipo de HPLC es ms costoso y elaborado que el de otros
tipos de cromatografa. Las elevadas presiones que generan las bombas no constituyen un
peligro de explosin, puesto que los lquidos no son muy compresibles.
Se dispone de varios reservorios de disolvente que pueden contener cada uno ms de 500
ml. Es necesario que estos reservorios vayan acompaados de desgasificadores para eliminar
los gases del disolvente, pues producen burbujas en la columna interfiriendo en los
resultados.
El sistema de inyeccin de muestra que ms se emplea se basa en "asas de muestreo",

que son bucles o vlvulas dosificadoras que permiten una aplicacin cuantitativa y
reproducible a presin elevada. Proporcionan una seleccin del tamao de la muestra que va
desde 5 a 500l. La muestra se pasa primero al bucle sin presin, para luego pasar a la
columna accionando el flujo del disolvente con una llave de varias vas o vlvulas de
membrana.
La muestra no debe contener slidos para que no se atasque la columna, si es necesario

deber filtrarse por un filtro de membrana o precolumna. Lo mejor es disolver la muestra en
30
el eluyente que se vaya a emplear en la separacin. El volumen inyectado de muestra debe

ser lo ms pequeo posible, para que los resultados aparezcan ms ntidos.
Para HPLC se emplean distintos detectores dependiendo de la naturaleza de la muestra.
Detectores selectivos
Responden a una propiedad del soluto en disolucin. Son los detectores ultravioleta/visible
(UV/Vis), detector de fluorescencia y detector electroqumico. El ms utilizado es el UV/Vis,
sobre todo el espectrofotmetro, que registra sustancias que absorben la radiacin
ultravioleta o visible. Los hay muy sensibles, son relativamente independientes de las
oscilaciones de temperatura y se pueden utilizar en la elucin en gradiente.
Detectores universales
responden cuando una propiedad de la fase mvil es cambiada por la presencia de un soluto.
Son el detector del ndice de refraccin (RI) y el detector de conductividad. El ms utilizado es
el detector RI, que registran todas aquellas sustancias que presenten un RI distinto al de la
fase mvil pura. La seal ser tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia en el RI. Es
necesario un control estricto de la temperatura y no se pueden utilizar para separaciones por
elucin en gradiente.
La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de

sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condicin, es
imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la fase mvil un lquido.
Es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente utilizada debido a sus cualidades de

sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para
la separacin de especies no voltiles o termo lbiles y su gran adaptabilidad a sustancias que
son de gran inters para la industria, la ciencia y la sociedad.
El empleo de HPLC en sus muchas variantes se ha especializado mucho. Algunas aplicaciones

incluyen sustancias tan diversas como aminocidos, protenas, cidos nuclicos,
hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenos, plagucidas, antibiticos, esteroides,
especies organometlicas y una gran variedad de sustancias inorgnicas.
Ejemplos de utilizacin de HPLC:
Deteccin y cuantificacin de sacarina, benzoatos, cafena y aspartame en refrescos.

Deteccin de ciclomato en jugos de fruta.
Separacin de steres de cidos grasos por fase inversa y con argentizacin de
columnas (Silicato de Al con Ag).
31
Separacin de Triglicridos por la longitud de la cadena y el grado de insaturacin por

fase inversa y detector de dispersin luminosa, para el estudio de aceites y grasas
adulteradas.
Determinacin del contenido de Vitamina A y sus precursores ( y caroteno) en
margarina y aceites de hgado por fase inversa.
Determinacin del contenido en Vitamina D en leche en polvo y cereales por fase
normal.
2.1.5.4. CROMATOGRAFIA GASEOSA (GC)
La cromatografa en fase gaseosa es un procedimiento para la separacin de compuestos

voltiles, que fluyen en una corriente gaseosa a travs de una fase estacionaria fijada a un
tubo largo y fino. El gas portador (inerte, por ej., nitrgeno, helio, hidrgeno y argn)
transporta una muestra representativa de la sustancia inyectada. En una separacin se parte
de la base, de que cada componente ser disuelto o adsorbido por la fase estacionaria. Los
distintos componentes sern retenidos por esta fase con mayor o menor fuerza y alcanzarn
correspondientemente el final de la columna, donde se encuentra el detector, despus de un
tiempo de flujo de gas portador ms o menos largo.
Fuente propia
La cromatografa de gases permite obtener resultados tanto cualitativos como cuantitativos.

Se utilizan fundamentalmente estas alternativas de separacin:
A mayor disolucin, la separacin de compuestos con estructura qumica similar se

consigue utilizando tiempos relativamente largos.
A menor disolucin se realiza la separacin rpida de mezclas de compuestos sencillos
conocidos.
32
El resultado ser un cromatograma donde quedar reflejado el tiempo que ha tardado cada
compuesto en salir (tiempo de retencin bruto). Podemos encontrar dos tipos de GC
atendiendo a la naturaleza de la fase mvil:
Cromatografa gas-lquido
La fase mvil es un gas y la fase estacionaria es un lquido con alto punto de ebullicin (para
que no se volatilice), de naturaleza inerte y que proporcione pelculas uniformes. Este lquido
es inmovilizado por impregnacin o por enlace sobre un soporte inerte que puede ser
simplemente la pared de la columna. La naturaleza de la fase estacionaria nos determinar el
orden de salida de los compuestos:
Apolar: primero saldrn los compuestos ms pequeos, en orden de volatilidad creciente. A

igual n de carbonos, los compuestos con insaturaciones saldrn antes.
Ej:
En una serie homloga de c. grasos C12 - C14 - C16 - C18...
Si hay insaturaciones C (18:3) . C (18:2) . C (18:1)...
Polar: si hay insaturaciones, stas reaccionarn por fuerzas de Van der Waals, as pues en
una serie homloga los compuestos saldrn en orden de tamao creciente, pero a igual n de
carbonos los saturados saldrn antes, luego los monoinsaturados, etc.
El parmetro implicado es el coeficiente de reparto K, pues la separacin de los analitos

depende de las diferentes fracciones de tiempo en las que se mantienen disueltos en la fase
estacionaria liquida.
Los componentes ms solubles se retienen durante ms tiempo, dado que pasan menos
tiempo viajando con el gas portador.
Cromatografa gas-slido
La fase estacionaria es un slido poroso (grafito o gel de slice o almina generalmente) y la

fase mvil es un gas. La retencin de los analitos se debe al equilibrio proporcionado por la
adsorcin y desorcin sobre la superficie del slido. Este tipo de GC es muy efectivo para
anlisis de mezclas de gases o de compuestos con bajo punto de ebullicin. El parmetro
implicado es el coeficiente de adsorcin.
La cromatografa de gases es el mtodo de separacin elegido para analizar tanto compuestos

orgnicos como gases, pues ambos grupos poseen presiones de vapor suficientemente altas
como para ser arrastrados en la fase mvil gaseosa. Lo que limita el uso de la GC es la
descomposicin trmica.
La GC requiere muestras voltiles, por lo que los compuestos que no lo son (azcares, cidos
grasos, aminocidos...) tienen que ser derivatizados, lo que significa transformar
qumicamente grupos qumicos que originan puntos de presin bajas (punto de ebullicin alto)
en compuestos ms voltiles (en azcares bloqueo de OH con cloruro de slice trimetilado, en
33
cidos grasos se producen sus steres metlicos, etc.). La derivatizacin tambin puede ser
empleada cuando los componentes reaccionan para dar grupos que proporcionan una fuerte
respuesta en el detector empleado (adicin de cloruros cuando se usa un detector de captura
electrnica, etc.).
Actualmente ms de 30 fabricantes de instrumentos ofrecen unos 130 modelos distintos de

equipos para cromatografa de gases. En las ltimas dcadas, los instrumentos que han
aparecido en el mercado presentan muchos cambios y mejoras.
Fuente propia
34
Fuente propia
COMPONENTES BSICOS
GAS PORTADOR
Gas portador cumple bsicamente dos propsitos: transportar los componentes de la

muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir
ciertas condiciones:
Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la (fase
estacionaria).
Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa.
Fcilmente disponible y puro.
Econmico y adecuado al detector a utilizar.
COLUMNAS DE SEPARACIN Y FASES ESTACIONARIAS
Si la fase estacionaria es una sustancia slida, esta modalidad de la GC se denomina

gas-solid-chromatography. Si la fase estacionaria es un lquido no voltil (viscoso)
aplicado formando una pelcula dentro de una fina columna, se denomina gas-liqui
chromatography.
Dado el elevado nmero de fases lquidas que existen para temperaturas superiores a 400C,
la GLC es la ms verstil y seleccionada de las GC. Permite la investigacin de compuestos
gaseosos (es decir, de peso molecular relativamente bajo). La cromatografa de gas-lquido se
35
abrevia normalmente como cromatografa de gases debido a su gran aplicacin en todos los
campos de la ciencia.
La Cromatografa gaseosa se divide en:
Cromatografa gaseosa con columnas empaquetadas
El primer caso se trata de columnas convencionales con un dimetro interno(ID) superior a

1mm y longitudes de 2-3m (de vidrio, metal), rellenas de granulados slidos en los que estn
embebidas las distintas fases.
Cromatografa gaseosa con columnas capilares.
Las columnas capilares son capilares largos de vidrio o slice (ID:0.2-0.3mm, longitud: como
norma 50m), existen diferentes tipos de capilares. Debido a la alta resolucin que se consigue
al trabajar con columnas capilares, la GC capilar se suele denominar tambin cromatografa
gaseosa de alta resolucin (HRGC).
SISTEMA DE INYECCIN MUESTRAL
Muestra debe introducirse rpidamente en la columna. Normalmente, los lquidos se

introducen en la columna por medio de jeringuillas de inyeccin (jeringuillas de microlitro con
un volumen total de 0.5 a 10l) a travs de una membrana de goma (septo) del inyector
termostatizado y los componentes se vaporizan; la cantidad inyectada se lee directamente en
la escala de la jeringuilla graduada.
La cantidad de la muestra a utilizar depende del tipo de columna, de la cantidad de fase

estacionaria contenida en la columna o del espesor de la pelcula en el caso de los capilares
de pelcula fina, de la solubilidad de los componentes importantes en la fase estacionaria (es
decir, de la polaridad de soluto y disolvente) y de la temperatura.
Controlando los cambios de temperatura de la columna (horno) durante el anlisis se puede,
alcanzar el intervalo de temperatura ptimo para cada componente o fraccin individual, de
manera que para cada componente de la mezcla se obtengan picos claros, en el caso ideal
completamente separados.
DETECTORES
El detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible

directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y la
magnitud de la propiedad fsica.
En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el gas portador
puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han
separado en la columna, esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que
posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico o integrador permitiendo
indicar el momento que salen de la columna los componentes.
36
Separacin e identificacin de azcares de forma cualitativa y cuantitativa despus de una

conversin a derivados voltiles termoestables.
Determinacin rpida y precisa de la composicn los cidos grasos en los aceites y las
grasas tras efectuar la conversin de los steres de triglicridos en steres metlicos,
que son ms voltiles. As se conoce con ms detalle la composicin isomrica,
geomtrica y posicional de los triglicridos en la cidos grasos.
Identificacin y determinacin de steres metlicos de cidos grasos poliinsaturados
individuales.
Determinacin del contenido de ismeros trans en aceites, grasas y alimentos grasos.
Separacin y determinacin de alcoholes de azcar de sus derivados del trimetilsilil ter
(TMS).
Determinacin del sorbitol, el manitol y el xilitol en las frutas en capilares de vidrio.
2.2. EXTRACCION
2.2.1. INTRODUCCION
La extraccin es una operacin que consiste en separar uno de los componentes de una
mezcla, mediante el empleo de un disolvente adecuado.
Es muy importante la eleccin del disolvente. Para ello hay que tener presente una serie de
cosas, como son: la solubilidad en el mismo de la sustancia que queremos separar, la
solubilidad de las dems, la facilidad con que puede separarse del disolvente despus, la
peligrosidad y el precio. El orden a seguir es el siguiente: agua, alcohol, acetona, cloroformo,
ter, tolueno.
La extraccin puede hacerse sobre una muestra slida o sobre una lquida, en el primer caso
la extraccin se llama slido-lquido y en el segundo lquido-lquido.
2.2.2. FUNDAMENTOS Y BASE CIENTIFICA
En qumica, la extraccin es un procedimiento de separacin de una sustancia que puede

disolverse en dos disolventes no miscibles entre s, con distinto grado de solubilidad y que
estn en contacto a travs de una interfase. La relacin de las concentraciones de dicha
sustancia en cada uno de los disolventes, a una temperatura determinada, es constante. Esta
constante se denomina coeficiente de reparto y puede expresarse como:
37
donde [sustancia]1 es la concentracin de la sustancia que se pretende extraer, en el primer

disolvente y, anlogamente [sustancia]2 la concentracin de la misma sustancia en el otro
disolvente.
Si tenemos una sustancia soluble en un disolvente, pero ms soluble en un segundo

disolvente no miscible con el anterior, puede extraerse del primero, aadindole el segundo,
agitando la mezcla, y separando las dos fases.
Se basa en la ley de distribucin o reparto, que se fundamenta en el hecho de que cuando se

agita un soluto en un sistema constituido por dos lquidos inmiscibles, el soluto se disuelve
parcialmente en cada disolvente. La relacin de concentraciones en ambos lquidos a una
determinada temperatura, cuando se alcanza el equilibrio es el "coeficiente dedistribucin o
reparto".
donde C0 y C1 son las concentraciones del soluto en cada disolvente y S0 y S1 son las
solubilidades respectivas a una temperatura definida.
El valor de Kd es constante para cada soluto y es independiente de la cantidad de soluto. En

el caso de que se empleen volmenes iguales de ambos disolventes, la expresin del
coeficiente de reparto es:
siendo X0 la cantidad de soluto inicial y X la cantidad de soluto sin extraer..
En la prctica se ha observado que la eficacia de la extraccin para un mismo volumen

aumenta con el nmero de extracciones, es decir fraccionando en varias operaciones el
volumen del disolvente extractante. En efecto:
Si en un volumen Va de disolucin tenemos Xo g de soluto y extraemos de una sola vez con

un volumen Vo, despus de la extraccin quedar sin extraer X g de soluto, por lo tanto, de
acuerdo con la ecuacin anterior:
Despejando X:
38
Si se realizan n extracciones con un volumen fraccionado de disolvente de (Vo/n), en cada

una de ellas, la cantidad de soluto que queda sin extraer sera:
Se puede comprobar que Xn, ser tanto menor cuanto mayor sea n, es decir cuanto ms se
fraccione el volumen Vo inicial y mayor nmero de veces se realice el proceso.
A nivel de laboratorio el proceso se desarrolla en un EMBUDO DE DECANTACIN. Como

es esperable, la extraccin nunca es total, pero se obtiene ms eficacia cuando la cantidad del
segundo disolvente se divide en varias fracciones y se hacen sucesivas extracciones que
cuando se aade todo de una vez y se hace una nica extraccin.
Fuente propia
El procedimiento es el siguiente:
Se aade dentro del embudo la sustancia disuelta en el disolvente del cual se pretende
extraer.
39
Se completa con el disolvente en el que se extraer y en el que la solubilidad de la

sustancia es mayor.
Se cierra la parte superior del embudo y se agita vigorosamente para formar una
emulsin de los dos lquidos inmiscibles y permitir el reparto de la sustancia disuelta
entre ambos.
Se abre de vez en cuando la vlvula del embudo de manera que los gases que se
puedan formar salgan del embudo.
Se deja reposar durante un tiempo para que se forme una interfase clara entre ambos.
Se abre la espita inferior del embudo y se deja escurrir el lquido ms denso en un
recipiente adecuado, como un vaso de precipitado.
Con relativa frecuencia aparecen en el proceso de extraccin emulsiones o interfases que

impiden una correcta separacin en el embudo de decantacin de las capas de disolventes,
casi siempre acuosa y orgnica. Este problema se da, especialmente, cuando se trata de
extracciones con cloruro de metileno. Para solventar este problema es conveniente aadir
unos mililitros de salmuera y agitar de nuevo. En la mayor parte de los casos se produce la
separacin de las fases sin problemas.
El proceso tiene repercusin industrial y se emplea en extraccin de aceites, grasas y

pigmentos. Por ejemplo, el yodo, poco soluble en agua, se extrae de la misma con
tetracloruro de carbono. Una vez efectuada la separacin de las fases se trata de calcular la
concentracin del yodo en cada fase, valorndolo con tiosulfato.
Este proceso puede usarse tambin si controlando la solubilidad de nuestras sustancias en

distintos disolventes. Especialmente en qumica orgnica, mediante distintos tratamientos a
algunos grupos funcionales podemos controlar el valor de K, hacindolos as insolubles o
solubles segn nos interese, por ejemplo: si tenemos aminas disueltas en un disolvente
orgnico y queremos pasarlas a una disolvente polar, podemos tratarlas con cido para
cargarlas y que se proponen, disolvindose as en nuestro disolvente polar, una vez separado
hacemos el proceso contrario (es decir basificarlas y devolverlas a su forma original) y las
separamos totalmente de nuestros disolventes
2.2.2. TERMINOLOGIA EN EXTRACCION
Hay tres tipos de extracciones:
EXTRACCIN SIMPLE
La extraccin simple consiste en hacer la extraccin de una sola vez, es decir, decantando
todo el volumen del disolvente A con el B. Al terminar la extraccin, se comprueba si la
disolucin todava contiene disolvente.
40
Supongamos, por ejemplo, que queremos separar una sustancia A, que est disuelta en agua,
y que es ms solube en B, siendo el agua y B inmiscibles.
Se pone la disolucin acuosa y el disolvente B, en un embudo de decantacin. Se sujeta con

la mano el tapn del embudo y con la otra, la llave y se comienza, con el pico del embudo
para arriba, a agitar, teniendo la precaucin de abrir de vez en cuando la llave para eliminar la
presin o depresin interna que se produce al entremezclarse el agua con B.
Cuando se considera que se ha producido un ntimo contacto entre ambas fases, se apoya el
embudo en un soporte y se espera a que decanten, en cuyo momento se extrae la fase que
contiene el disolvente y la sustancia, concluyendo as la primera etapa. A continuacin se
aade ms disolvente sobre la fase acuosa y se repite la operacin finalizando, de esta forma,
la segunda etapa. La operacin se da por concluda cuando, despus de varias etapas, se ha
extrado prcticamente todo el producto.
Finalmente se separa la sustancia del disolvente por destilacin de ste ltimo.
EXTRACCION MLTIPLE
Por el contrario, en la extraccin mltiple vamos decantando poco a poco el volumen de B con
respecto al de A, con lo que segn la frmula anteriormente deducida, tendr un mayor
porcentaje de extraccin, que comprobaremos aadiendo un indicador.
SUBLIMACIN
Este mtodo se emplea para la separacin y purificacin de sustancias, consistiendo en

calentar sustancias slidas que pasan directamente al estado de vapor y de nuevo al
condensarse los vapores pasan a la forma slida. Algunas veces se hace la sublimacin a
presin reducida para que no se descomponga el cuerpo.
2.2.3. CLASES DE EXTRACCION
Est basada en la disolucin de uno o varios componentes de una mezcla en un disolvente

selectivo. La mezcla puede ser lquida o slida:
1. EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO
Se requiere que los dos lquidos que se ponen en contacto sean inmiscibles. Representa una
solucin ventajosa con relacin a la destilacin porque permite extraer varias sustancias que
tengan un grupo funcional parecido. Para no utilizar la destilacin con arrastre de vapor se
emplea este mtodo.
41
El fundamento de la extraccin lquido-lquido requiere que los dos lquidos no sean miscibles,
por ello la extraccin depende del coeficiente de reparto. Cuando un soluto se disuelve en dos
lquidos no miscibles en contacto entre si, dicho soluto se distribuir en cada uno de los
lquidos en proporcin a la solubilidad en cada uno de ellos.
1.1. INSTRUMENTACION
Fuente propia
Columnas de relleno: han de utilizarse en contracorriente. Por arriba alimentacin y

por abajo disolvente.
Columnas pulsadas: dotadas de movimiento de agitacin, es decir, columnas girando
alrededor de ellas.
Columnas pulsadas horizontales: suelen tener placas perforadas.
Tanques agitadores: mezcladores combinados con decantadores
2. EXTRACCIN SLIDO-LQUIDO
Tambin llamada lavado, lixiviacin, percolacin... Si pretendemos un componente no

deseado de un slido se denomina lavado. Lixiviacin se emplea cuando se desea extraer un
componente valioso. Percolacin se emplea para indicar que existe el vertido de un lquido
sobre un slido.
2.1. INSTRUMENTACIN
42
Tendremos que tener en cuenta si el disolvente es voltil o no lo es y si es necesaria su

recuperacin. A nivel industrial son muy complicados. A nivel de laboratorio tenemos el
extractor Soxhlet (fig.). Por abajo tengo el disolvente en la caldera C, lo que extraigo es A y la
alimentacin est constituida por A + B. El disolvente se calienta en la caldera y se condensa
el vapor. El lquido C cae sobre el slido A + B que est dentro de una bolsa de papel. Desde
arriba se produce la extraccin del componente A del slido A + B; el nivel va subiendo ya
que cada vez tengo ms lquido. El lquido sale por el sifn y va a caer por la parte de abajo C
+ A. As se separa el componente A del B. Siempre realizaremos la extraccin con el
disolvente puro (por ello es una extraccin continua y muy rpida) ya que A queda en el
caldern.
Fuente propia
Existen fundamentalmente dos grupos: el extractor Shoxlet y la sonicacin (agitacin

mediante ultrasonidos).
EXTRACTOR SOXHLET
El extractor de tipo Soxhlet se aplica a analitos que no se pueden separar por volatilizacin
(en fase gas) pero s son extrables empleando un disolvente orgnico adecuado. La gran
ventaja del Shoxlet es la eficacia en el proceso de remojo de la fase slida.
El esquema del instrumento es sencillo:
1. Un matraz de base redonda que contendr el disolvente orgnico voltil.
43
2. Un contenedor intermedio de vidrio en el cual se coloca la muestra dentro de un

cartucho que est abierto en su parte superior siendo poroso al disolvente y a la
posterior disolucin del analito (se vende comercialmente).
3. Refrigerante.
El matraz es calentado con una manta calefactora hasta que el disolvente orgnico se
evapora, el vapor de disolvente atraviesa el cartucho que contiene la muestra ascendiendo
por el contenedor hasta el refrigerante. Cuando el vapor de disolvente llega al refrigerante
este condensa y cae en forma lquida de nuevo en direccin al matraz pero, en su camino,
este golpea con la muestra disolvindola (para que esto ocurra la muestra debe estar
perfectamente seca y fnamente dividida).
El analito disuelto en disolvente orgnico pasa por un sifn el cual, al llenarse y desbordar,
descarga sobre el matraz redondo.
Cuando el proceso de disolucin se da por finalizado se aade una ltima etapa: la

evaporacin. El disolvente se evapora por calentamiento concentrando la muestra.
2.2.4. SOLVENTES
Un disolvente es una sustancia que permite la dispersin de otra en su seno. Es el medio

dispersante de la disolucin. Normalmente, el disolvente establece el estado fsico de la
disolucin, por lo que se dice que el disolvente es el componente de una disolucin que est
en el mismo estado fsico que la disolucin. Tambin es el componente de la mezcla que se
encuentra en mayor proporcin.
Las molculas de disolvente ejercen su accin al interaccionar con las de soluto y rodearlas.
Se conoce como solvatacin. Solutos polares sern disueltos por disolventes polares al
establecerse interacciones electrostticas entre los dipolos. Los solutos apolares disuelven las
sustancias apolares por interacciones entre dipolos inducidos.
El disolvente universal es el agua.
ASPECTOS TERMINOLGICOS
Los disolventes son denominados, en ocasiones, solventes por influencia del

ingls, pero la denominacin ms correcta es la de disolventes. Lo mismo sucede con
el trmino disolucin que se encuentra en muchos textos traducidos del ingls como solucin,
que la Real Academia Espaola lo define en su primera acepcin como: "Accin y efecto de
resolver una duda o dificultad", y en una segunda: "Mat. Cada una de las cantidades que
satisfacen las condiciones de un problema o de una ecuacin", aunque ya haya aceptado
dicho trmino como sinnimo de disolucin.
44
CLASIFICACIN DE LOS DISOLVENTES
Disolventes polares: Son sustancias en cuyas molculas la distribucin de la nube

electrnica es asimtrica; por lo tanto, la molcula presenta un polo positivo y otro
negativo separados por una cierta distancia. Hay un dipolo permanente. El ejemplo
clsico de solvente polar es el agua. Los alcoholes de baja masa molecular tambin
pertenecen a este tipo. Los disolventes polares se pueden subdividir en:
o Disolventes polares prticos: contienen un enlace del O-H o del N-H. Agua
(H-O-H), etanol (CH3-CH2-OH) y cido actico (CH3-C(=O)OH) son disolventes
polares prticos. El DMF o N,N-Dimetilformamida y el DMSO (dimetil sulfxido)
son otros ejemplos de disolventes polares proticos, utilizados en reaciones
organicas.
o Disolventes polares proticos: son disolventes polares que no tiene enlaces
O-H o N-H. La acetona (CH3-C(=O)-CH3) y THF o Tetrahidrofurano son
disolventes polares aprtico.
Disolventes apolares: En general son sustancias de tipo orgnico y en cuyas
molculas la distribucin de la nube electrnica es simtrica; por lo tanto, estas
sustancias carecen de polo positivo y negativo en sus molculas. No pueden
considerarse dipolos permanentes. Esto no implica que algunos de sus enlaces sean
polares. Todo depender de la geometra de sus molculas..
EL AGUA COMO SOLVENTE
Fuente propia
Dentro de los sistemas vivos, muchas sustancias se encuentran en solucin acuosa. Una
solucin es una mezcla uniforme de molculas de dos o ms sustancias. La sustancia presente
en mayor cantidad, que es habitualmente lquida, se llama solvente, y las sustancias
presentes en cantidades menores se llaman solutos. La polaridad de las molculas de agua es
la responsable de la capacidad solvente del agua. Las molculas polares de agua tienden a
separar sustancias inicas, como el cloruro de sodio (NaCl), en sus iones constituyentes. Las
molculas de agua se aglomeran alrededor de los iones con carga y los separan unos de
otros.
Este diagrama muestra al cloruro de sodio (NaCl) disolvindose en el agua a medida que las
molculas de sta se aglomeran alrededor de los iones individuales sodio y cloruro
45
separndolos unos de otros. Ntese la diferencia entre el modo en que las molculas de agua
estn dispuestas alrededor de los iones sodio y la manera en que se disponen alrededor de
los iones cloruro.
Dada la polaridad de sus molculas, el agua puede servir como disolvente para sustancias
inicas y molculas polares.
Fuente propia
Muchas de las molculas importantes en los sistemas vivos que presentan uniones covalentes,
como los azcares, tienen regiones de carga parcial positiva o negativa. Estas molculas, por
lo tanto, atraen molculas de agua y tambin se disuelven en agua. Las molculas polares
que se disuelven rpidamente en agua son llamadas hidroflicas ("que aman al agua''). Estas
molculas se disuelven fcilmente en agua porque sus regiones parcialmente cargadas atraen
molculas de agua tanto o ms que lo que se atraen entre s. Las molculas polares de agua
compiten de este modo con la atraccin existente entre las molculas de soluto.
Molculas tales como las grasas, que carecen de regiones polares, tienden a ser muy
insolubles en el agua. Los puentes de hidrgeno entre las molculas de agua actan como
una fuerza que excluye a las molculas no polares. Como resultado de esta exclusin, las
molculas no polares tienden a agruparse en el agua, al igual que las gotitas de grasa tienden
a juntarse, por ejemplo, en la superficie del caldo de gallina. Dichas molculas son llamadas
hidrofbicas ("que tienen aversin por el agua") y los agrupamientos se producen por
interacciones hidrofbicas.
LOS SOLVENTES Y SUS APLICACIONES
Los solventes producen efectos similares a los de alcohol o los anestsicos.

Los solventes industriales de mayor uso son los cementos (tricloroetileno,
tetracloroetieleno), los pegamentos (tolueno, acetato de etilo y varias acetonas), el
thinner(destilados de petroleo, benceno,acetona, tricloroetieleno,tetraeticlororetileno)
y los removedores de barniz o pintura( acetona, tolueno,benceno, cloruro de
metileno).
46
Aqu una tabla indica las principales caractersticas y aplicaciones de algunos de estos
solventes.
CLASIFICACION DE LOS SOLVENTES ORGANICOS
Fuente propia
2.2.5. APLICACIONES
La extraccin lquido-lquido se utiliza en la industria del petrleo para la extraccin del

asfalto mediante propano lquido.
La extraccin slido-lquido tiene las siguientes aplicaciones: obtencin de aceites y
grasas animales y vegetales, obtencin de extracto de materia vegetal y animal.
Industria minera (lixiviacin), obtencin de azcar a partir de la remolacha.
47

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Quimica Analtica Cuantitativa Docente: MSc.

METODOS DE SEPARCIONES ESPECIALES

Las tcnicas analticas ms empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes

Actualmente las separaciones analticas se realizan fundamentalmente de cromatografa y

A pesar de que el mtodo cromatogrfico prometa simplificar la separacin de sustancias de

Fig. 1. Cromatgrafo de gases con espectrmetro de masas

Fig. 2. Equipos para HPLC (Cromatografo de alta resolucin para lquidos)

En la cromatografa se separan los componentes de las mezclas a medida que son

Cromatografa de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad.

Tambin se pueden clasificar segn el estado de la fase mvil en:

Cromatografa de gases: la fase mvil es un gas y pueden ser dos sistemas:

Cromatografa lquida: la fase mvil es un liquido y puede ser:

El proceso cromatogrfico, aparentemente simple, es en realidad una compleja unin de

Teora de los Platos Tericos (Martin & Synge).

1.1.3. TERMINOLOGIA EN CROMATOGRAFIA

Absorcin: es la retencin de una especie qumica por parte de una masa y

El cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de separacin

En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal (obtenida, por

Cromatograma obtenido de la secuenciacin de un fragmento de ADN

En la cromatografa en columna, la fase mvil puede ser un lquido o un gas, y

naturaleza de las fases involucradas y con los mecanismos de separacin, es

FIG. - Mtodos cromatogrficos. CGS: cromatografa gas-slido; CGL: cromatografa gas-

Tipos Fase mvil Fase estacionaria

2.1.5. CLASIFICACION SEGN EL PROCESO DE DESARROLLO

Segn el procedimiento en que se desarrolla se utiliza la siguiente clasificacin, que fue la

Desarrollo por elucin.

Desarrollo por elucin

Desarrollo por desplazamiento

2.1.6. PRINCIPALES PARMETROS CROMATOGRFICOS

1.- Tiempo cero o tiempo de retencin del componente inerte (t0).

2.- Tiempo de retencin de un componente (tii).

3.- Tiempo de retencin corregido de un componente (t'i).

4.- Tiempo de retencin relativa (rip).

5.- Volumen de retencin de un componente (VR).

donde VR es el volumen de retencin expresado como el producto del tiempo de retencin de

donde d es el dimetro interior del soporte utilizado y es la porosidad de la fase

6.- Volumen cero o muerto (V0 o Vm).

7.- Volumen de retencin verdadero (V'R).

8.- Coeficiente de particin o de reparto de un componente (K).

donde Cs y Cm son las concentraciones de componente presente en las fases estacionaria y

9.- Velocidad lineal media a lo largo de una columna (u).

donde u es la velocidad lineal media, L es la longitud de la columna y tm es el tiempo muerto.

10.- Factor de selectividad ().

11.- Factor de capacidad (K').

Es el cociente entre las probabilidades de encontrar una molcula determinada de soluto en la

Donde N es el nmero de platos tericos, L es la longitud de la columna, H es la altura de

La velocidad de la fase mvil influye en la eficiencia del sistema cromatogrfico, ya que si la

13.- Resolucin (R o Rs).

La resolucin puede observarse directamente sobre el cromatograma de picos. Se tendr una

Una pobre resolucin es debida principalmente a:

Hay demasiada muestra en la columna.

2.1.5.1. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION ESFERICA

2.1.5.1.1. FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BASICOS

La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa por filtracin

La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna por el

En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que

Si la separacin se realiza en fase acuosa (filtracin en gel), o en fase orgnica.

La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel o de

Hypothetical partial structure of sephacryl

Mecanismo de la cromatografa de exclusin

Diferentes compartimentos dentro de la columna

Diagramas de representacin de Vt y Vo la cual ser la de sustraccin deVt-Vo

Como aplicacin referida a productos alimenticios en cromatografa por exclusin de tamaos: