INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLIGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

CURSO PRCTICO DE MTODOS DE

ANALISIS
DTERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO
DE LOWRY, DETERMINACIN DE PROTENAS POR
EL MTODO DE BRADFORD

PROFESOR: LARIOS SERRATO VIOLETA

CEVADA SANTIAGO KAREN JAZMIN

5QM1 SECC. 4

Equipo utilizado: espectrofotmetro No. 10

Compaero de equipo: Irving Rodriguez sanchez
OBJETIVOS

Elaborar una curva de calibracin para la cuantificacin de protenas empleando un

mtodo fotomtrico.

Determinar si hay diferencia estadsticamente significativa en la precisin y la

exactitud entre los mtodos de Bradford y Lowry.

Conocer el efecto de sustancias no protenicas, en el desarrollo de color.

Analizar las ventajas y desventajas del mtodo de Lowry y Bradford , con respecto a
otros mtodos para la cuantificacin de protenas.

FUNDAMENTO

La determinacin cuantitativa de la concentracin de protenas es una de las pruebas

que ms frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioqumica.
Primitivamente, la cantidad de protenas se evaluaba midiendo la cantidad total de
nitrgeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa
aproximadamente el 16% del peso de una protena. Este era un mtodo largo y
laborioso y con poca sensibilidad. La aparicin de mtodos calorimtricos ha
permitido solventar estos dos inconvenientes.

Entre los mtodos calorimtricos destacan tres: el mtodo de Biuret, el mtodo de

Lowry y el mtodo de Azul de Coomasie. El segundo de ellos tiene el inconveniente
principal es que al evaluar, como veremos, los fenoles presentes en la protena
(esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color resultante vara entre las
distintas protenas. Pero cuando tratamos con mezclas biolgicas complejas, podemos
perfectamente calibrar el mtodo con alguna protena comercial, como es la sero-
albumina bovina.

La reaccin que tiene lugar en el mtodo de Lowry es bastante compleja y no del todo
conocida. Se desarrolla en las siguientes fases: 1.-Reaccin previa de la protena en
medio alcalino con iones Cu2+, en presencia de tartrato para evitar la precipitacin. Es
esencialmente idntica a la reaccin del Biuret, formndose un complejo de
coordinacin entre el cobre y el nitrgeno peptdico. 2.-Reaccin con el reactivo de
Folin-Ciocalteau para fenoles (cido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio
de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la protena a
un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimtricamente. El complejo
coloreado, cuya composicin es desconocida, presenta dos mximos de absorcin a
las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La eleccin de una u otra depende de la
concentracin proteica de la muestra estudiada.

El mtodo de Bradford se basa en un principio diferente: se emplea un colorante

hidrofbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ac. Fosfrico tienen un color
pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofbico del interior de una protena,
origina un color azul intenso que se puede medir fcilmente. Este mtodo depende,
pues de la interaccin relativamente inespecfica entre un colorante hidrofbico y las
protenas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales
como restos de detergente y lquidos orgnicos como el metanol. Su principal ventaja
es que resulta ms rpido y fcil de emplear que otros mtodos alternativos, y ms
sensible que la medida de absorbancia a 280 nm.

RESULTADOS

TABLA 1.- CURVA DE CALIBRACIN DE HEMOGLOBINA MTODO DE LOWRY

Tubo no. Cantidad de protena (g) A590

Serie a Serie b
1 25 0.104 0.070
2 50 0.101 0.100
3 75 0.154 0.160
4 100 0.187 0.188
5 125 0.271 0.207

Clculos para la cantidad de protena: (hemoglobina 0.25 mg/mL).

1 mg--- 1000 g 250 g---- 1 mL Se calcul as para todos los tubos

0.25 mg--- = 250 g 25 g ---- 0.1 mL

Regresin lineal: R=0.9820 A= 0.0338 B= 1.4933 X 10 -3 (se eliminaron los valores

de 0.271 y 0.104 para tener los datos ms homogneos).

Curva tipo para determinacin de protenas en hemoglobina

por el mtodo de Lowry
0.25
Absorvancia a 590 nm

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Cantidad de protena (g)
Serie A Serie B

Figura 1.- Curva de calibracin de la determinacin de protenas por el mtodo de

Lowry a absorbancia de 590 nm respecto a la concentracin de hemoglobina en g.

ANLISIS ESTADSTICO
 Frmula para calcular la cantidad de protena: X= Y (absorbancia) A (0.0338) /
B(1.4933 X 10 -3 )

Frmula para calcular los lmites de confianza: X t (S)/ = 83.52 2.262(13.95) /

10 / lmite superior: 93.49 Lmite inferior: 73.54

Frmula para l %C.V.= S/X (100)

TABLA 2.- RPLICAS PARA EL ANLISIS ESTADSTICO.

Tubo no. A590 Cantidad de protena (g)

1 0.140 71.13
2 0.186 101.94
3 0.142 72.47
4 0.152 79.16
5 0.146 75.15
6 0.181 98.59
7 0.147 75.82
8 0.183 99.93
9 0.131 65.10
10 0.177 95.91

TABLA 3.- RESULTADOS DEL ANLISIS ESTADSTICO

X S S2 % C.V
83.52 13.95 194.60 16.70 73.54 - 93.49

TABLA 4.- EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS NO PROTEICAS EN EL MTODO DE

LOWRY

Tubo no. Sustancia A590 Cantidad de Tipo de interferencia

protena (g) generada
1 Fenol al 1% 1.827 1201.07 +
2 Mercaptoetanol al 1% 0.189 103.95 +
3 Tris 1M pH 10 0.120 57.73 -
4 Urea al 5% 0.181 98.59 +
5 (NH4)2 SO4 0.163 86.53 SI

TABLA 5.- CURVA DE CALIBRACIN DE HEMOGLOBINA, MTODO DE BRADFORD.

 Tubo no. Cantidad de A595
protena (g) Serie a Serie b
1 25 0.203 0.224
2 50 0.242 0.263
3 75 0.296 0.378
4 100 0.479 0.505
5 125 0.510 0.607

Clculos para la cantidad de protena: (Hemoglobina 0.25 mg/mL).

1 mg--- 1000 g 250 g---- 1 mL Se calcul as para todos los tubos

0.25 mg--- = 250 g 25 g ---- 0.1 mL

Regresin lineal: R=0.9575 A= 0.0918 B= 3.718 X 10 -3 (no se elimin ningn valor).

Curva tipo para determinacin de protenas en

0.7
Hemoglobina por el mtodo de Bradford
0.6

0.5
Absorbancia

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Cantidad de protena (g)
Serie A Serie B

Figura 1.- Curva de calibracin de la determinacin de protenas por el mtodo de

Bradford a absorbancia de 595 nm respecto a la concentracin de hemoglobina en g.

ANLISIS ESTADSTICO

Frmula para calcular la cantidad de protena: X= Y (absorbancia) A (0.0918) /

B(3.718 X 10 -3)

Frmula para calcular los lmites de confianza: X t (S)/ = 91.254 2.262(5.629) /

10 / lmite superior: 95.28 Lmite inferior: 87.23

Frmula para l %C.V.= S/X (100)

TABLA 6.- RPLICAS PARA EL ANLISIS ESTADSTICO.

 Tubo no. A595 Cantidad de protena (g)
1 0.407 84.77
2 0.405 84.25
3 0.400 82.89
4 0.460 99.03
5 0.425 89.61
6 0.446 95.26
7 0.452 96.88
8 0.441 93.92
9 0.437 92.84
10 0.438 93.11

TABLA 7.- RESULTADOS DEL ANLISIS ESTADSTICO

X S S2 % C.V.
91.254 5.629 31.685 6.16 87.23 95.28

TABLA 8.- EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS NO PROTEICAS EN EL MTODO DE

BRADFORD

Tubo no. Sustancia A595 Cantidad de Tipo de interferencia

protena (g) generada
1 Tris 1 M pH 7 0.421 88.54 SI
2 Glicerol al 1% (v/v) 0.420 88.27 SI
3 Detergente comercial 0.208 31.25 -
4 Dodecil sulfato de sodio al 1% 0.166 19.95 -
5 Fenol al 1% 0.472 102.25 +
6 Mercaptoetanol al 1% 0.502 110.32 +
7 Tris 1M pH 10 0.450 96.34 +
8 Urea al 5% 0.485 105.75 +
9 (NH4)2 SO4 0.470 101.72 +
10 Fenol al 1% 0.478 103.87 +

COMPARACIN DE AMBOS MTODOS

TABLA 9.- DETERMINACIN DE LA PRUEBA T DE STUDENT.

Tubo No. Cantidad de Cantidad Di Di -D (Di D)2

protena (g) de protena
mtodo (g)
Bradford mtodo de
lowry

1 84.77 71.13 13.64 5.964 35.5692

 2 84.25 101.94 -17.69 -25.366 643.4339

3 82.89 72.47 9.82 2.144 4.5967

4 99.03 79.16 19.87 12.194 148.6936

5 89.61 75.15 14.46 6.784 46.0226

6 95.26 98.59 -3.33 -11.006 121.1320

7 96.88 75.82 21.06 13.384 179.1314

8 93.92 99.93 -6.01 -13.686 187.3065

9 92.84 65.10 27.74 20.064 402.5640

10 93.11 95.91 -2.8 -10.476 109.7465

=1878.1964
D= 7.676

( )2 1878.1964
Frmula: Sd= 1
sustitucin: Sd= 9
= 14.44

Hiptesis:

Ho: no hay diferencia significativa entre los mtodos.

Hi: hay diferencia significativa entre los mtodos.

(7.676)10
Ttablas= 2.262 Tcalculada= Tcalculada= =1.6810
14.44

Ttablas> Tcalculada = se acepta Ho

TABLA 12.- DETERMINACIN DE LA PRUEBA F DE FISHER

Mtodo de Lowry Mtodo de Bradford

S2 194.60 31.685

Hiptesis:

Ho: No hay diferencia significativa entre los mtodos

Hi: S hay diferencia significativa entre los mtodos

194.60
Ftablas= 4.03 Fcalculada= S12/S22 Fcalculada=31.685=6.1417 Ftablas< Fcalculada =Se rechaza Ho.

DISCUSION
Se realiz una determinacin de protenas por el mtodo de Lowry en el cual se basa
en la realizacin de 2 fases, la primera es la utilizacin del cobre (2+) para que se forme
un complejo con la protena y cambie la estructura tridimensional de la misma,
causando que se expongan los grupos fenlicos de las protenas con aminocidos
aromticos, de esta manera puede darse lugar la segunda fase la cual consta de la
utilizacin de reactivo de Folin (cido fosfomolibdotngstico) de un color amarillo, el
cual acta como agente reductor de los grupos fenlico y da lugar a un complejo de
color azul. Cabe destacar que la reaccin debe llevarse a cabo en un medio alcalino
para que los grupos funcionales a reaccionar no estn protonados y por tanto esto
provocara que no se lleve a cabo la reaccin redox de la segunda fase. Como parte de
los resultados se realiz una curva tipo que es una representacin grfica de algn
parmetro en funcin de la concentracin de un analito y sirve para estimar la
concentracin de hemoglobina en las muestras en funcin de su absorbancia a 595
nm, de esta manera permite determinar la linealidad de esa curva y en consecuencia,
la capacidad del mtodo de Lowry para obtener resultados que sean directamente
proporcionales a la concentracin de protena en las muestras. Obtenindose valores
de regresin lineal que son utilizados en el anlisis estadstico del mtodo, el cual se
realiza para conocer la exactitud, precisin y sensibilidad del mismo, resultando que
todos los valores estadsticos estn elevados, pues la media indica la exactitud del
mtodo y en la cual debera haber obtenido valores muy cercanos a los 75g de
hemoglobina y se obtuvo uno de (83.52 g), de la misma forma con la varianza que
sirve para medir el grado de precisin pues este parmetro mide la dispersin de
los datos, donde entre menor sea la desviacin estndar mayor es la precisin de
un mtodo y obteniendo un resultado de (13.95 g) y finalmente con el coeficiente
de variacin que fue de 16.70% y para que un anlisis estadstico tenga confianza debe
de ser menor o igual a 5%, esto es debido en gran medida a errores del analista, ya
que al manejar volmenes pequeos una sola gota de ms arrastra cerca del 50% de
error en el mtodo, tambin puede deberse a errores en la calibracin del
espectrofotmetro o al error fotomtrico de este.

Posteriormente se procedi a la determinacin de protenas pero por el mtodo de

Bradford en el cual se emplea un colorante hidrofbico en disoluciones de cido
fosfrico que le dan un color pardo y que, depende de la interaccin entre un
colorante hidrofbico y las protenas, originando un color azul intenso que se puede
medir fcilmente a una absorbancia de 590 nm. Como consiguiente se le realiz la
curva de calibracin y los anlisis estadsticos correspondientes y cuya importancia ya
se ha abordado. Finalmente se obtuvo que por este mtodo tampoco se tuvo exactitud
pues la media result de 91.254 g y que debi ser de 75 g, en cambio por este
mtodo se obtuvo mayor precisin en comparacin al mtodo de Lowry pues la
varianza fue de 5.629, y finalmente el coeficiente de variacin result ser menor
(6.16%) que an est por encima del nivel de confianza estndar, pero es mucho ms
bajo que en comparacin con el mtodo de Lowry.

Como parte de la prctica se procedi a realizar una comparacin estadstica entre

ambos mtodos, mediante la utilizacin de la T de Student, la cual es una prueba de
significancia que nos sirve para comparar medias, el resultado indica que no hay
diferencia significativa entre las medias por lo tanto, aunque el mtodo de Bradford
es ms inexacto que el mtodo de Lowry, esta diferencia no es significativa para el
anlisis estadstico. Con la prueba F de Fisher se comparan la varianzas de ambos
grupos de datos (de su precisin) y segn los resultados hay diferencia significativa
entre las varianzas de ambos mtodos, indicando que el mtodo de Bradford es ms
preciso que el de Lowry, lo cual hara que se realizara el mtodo de Bradford en vez
del de Lowry, ya que tiene bases estadsticas que lo avalan. Sin embargo esta
diferencia es en gran medida a errores del analista, pues en los anlisis estadsticos las
absorbancias debieron ser entre 0.200-0.400, en cambio salieron por arriba de 0.400,
esto se sustenta debido a que en la actualidad se siguen utilizando ambos mtodos
para la cuantificacin de protenas, y el uso de uno sobre del otro radica en
caractersticas econmicas, tiempo, ventajas y desventajas, debido a que el de Lowry
se realiza en 2 etapas, ocupa ms reactivos, y su tiempo de realizacin es ms largo,
en cambio el de Bradford se lleva a cabo en menor tiempo y con menos reactivos, otro
factor que los clasifica para su uso es que el de Bradford es 4 veces ms preciso que
el de Lowry (demostrado por la pendiente en la ecuacin de nuestra curva de
calibracin) porque el de Lowry determina protenas con amiocidos aromticos, en
cambio el de Bradford identifica cualquiera, sin embargo este mtodo tiene como
desventaja que deteriora el material (colorea intensamente las celdas para lectura en
espectrofotmetro), lo cual derivara en costos de material o la lectura errnea de
posteriores muestras al usar celdad maltratadas, otra desventaja radica en la
estabilidad del complejo formado, pues el de Bradford es estable por 40 minutos y el
de Lowry por 120 minutos.

Finalmente se determinaron las interferencias no proteicas que pueden afectar a

ambos mtodos y que mediante los intervalos de confianza se determina si la
interferencia es positiva (por arriba del valor mximo del intervalo de confianza) o
negativa (por abajo del valor mximo del intervalo de confianza), resultando que las
interferencia por compuestos fenlicos afectan el mtodo de Lowry, debido a que el
reactivo de Folin reduce precisamente este tipo de estructuras en las protenas y al
tener otras de ellas derivadas de otras fuentes aumenta el valor de las absorbancias
resultando ser una interferencia positiva, en cambio el Tris 1M pH 10 es una
interferencia negativa, debido a que el pH desprotona las protenas y por tanto los
grupos funcionales a reaccionar. Para el mtodo de Bradford las interferencias
negativas son debidas a detergentes (SDS) debido a que estos alteran las 4 formas
inicas que tiene el colorante utilizado (azul brillante de Coomassie G-250) tiene, por
lo cual la forma azul ms aninica se une a protenas y absorbe a 590 nm no puede
formarse.

CONCLUSIONES

Hay una diferencia significativa estadstica en la precisin entre el mtodo de Lowry

y Bradford.
No hay diferencia significativa estadstica en la exactitud entre el mtodo de Lowry y
Bradford.

La determinacin de protenas por el mtodo de Lowry es afectada por la presencia

de compuestos fenlicos.

La determinacin de protenas por el mtodo de Bradford es afectada por la presencia

de detergentes.

La determinacin de protenas por el mtodo de Bradford es 4 veces ms sensible

que la determinacin de protenas por el mtodo de Lowry.

Los mtodos fotomtricos para la determinacin de protenas son ms precisos y

exactos estadsticamente.

CUESTIONARIO

1.- Calcule y escriba los valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de

correlacin. Diga cmo se interpretan en la curva de calibracin.

El coeficiente de correlacin indica un comportamiento lineal de los valores, por tanto

cumple con la Ley de Bouguer Y Beer, esto se traduce en se pueden cuantificar
nuestros datos y saber que los valores que arroje esta sern confiables, sin embargo
en el primer caso de determinacin de protenas por el mtodo de Lowry, tuvimos que
eliminar valores de las rplicas para as obtener un coeficiente de correlacin cercano
a uno. Para el mtodo de Bradford no se logr tener un coeficiente de correlacin
adecuado, asi que en este caso los datos no sern confiables al realizar repeticiones
estadsticas.

2.- cumple con la ley de Bouguer y Beer? Entre que lmites de cantidad de protena?

Si cumple con esta ley debido a que las lecturas de trasmitancia y ledas como valores
de absorbancia van aumentando con las concentraciones; los lmites de protena entre
los que se cumple esta ley son en todos al menos en las curvas tipo (25-125 g) y
anlisis estadstico de ambos experimento, los nicos que no cumplen son los
experimentos de interferencias de origen no proteico.

3.- A partir de la recta ajustada por regresin lineal y la ecuacin de la misma, obtenga
la expresin matemtica para calcular la cantidad de protena

Frmula para calcular la cantidad de protena: x = (y - a)/b X= (Y (absorbancia)

A (0.0918)) / B(3.718 X 10 -3).

4.- Diferentes mtodos para cuantificacin de protenas

cido bicinconnico (BCA) o ensayo basado en cobre (rango: 20-2000 ug/ml)

Tanto el ensayo de BCA como el de Lowry se basan en la conversin del Cu2+ a

Cu1+ en condiciones alcalinas. Esta conversin es definida como la reaccin de Biuret.
Esta reaccin es influenciada por cuatro aminocidos (cistena, cistina, tirosina y
triptfano) y tambin por la cadena peptdica.
Figura 1. Representacin esquemtica del ensayo de BCA.

BCA es un reactivo cromognico especfico para Cu1+ y en el segundo paso de la

reaccin dos molculas de BCA reaccionan con una de in Cu1+. La cantidad de
Cu2+reducido es una funcin de la concentracin de protenas y ser determinada
espectrofotomtricamente por un cambio en el color de la solucin a prpura, el cual
absorbe a 562 nm. La absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de
protena presente en la solucin y puede ser estimada por comparacin con un
estndar de protena conocido, tal como la albmina srica bovina (ASB).
El ensayo de BCA es ms tolerante a un rango de detergentes inicos y no inicos tales
como el NP-40, Triton X-100 y agentes desnaturalizantes como la urea y el cloruro de
guanidinio, que tienden a interferir con otros ensayos proteicos colorimtricos tales
como el Lowry. Algunas molculas qumicas como: cido etilen-diamino-tetraactico
(EDTA), azcares reductores y lpidos pueden interferir con el ensayo de BCA. Otro
factor que interfiere con la exactitud del ensayo de BCA es la presencia de residuos
modificados en las protenas.
Comparado con otros mtodos, el ensayo de BCA es uno de los ms sensibles (puede
detectar protenas en concentraciones tan bajas como 5 ug/mL). Tiene menos
variabilidad que otros (por ej., el ensayo de Bradford), y puede ser utilizado para medir
un amplio rango de concentraciones de protenas.

Absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm (rango: 0.1-100 ug/ml)

Los aminocidos aromticos tirosina y triptfano le dan a las protenas su

caracterstico espectro de absorcin ultravioleta (UV) a 280 nm. Fenilalanina y puentes
disulfuro tambin pueden contribuir a la absorcin en esa longitud de onda, aunque
ligeramente. Este mtodo es simple y requiere de un volumen de muestra
extremadamente pequeo ya que los nuevos espectrofotmetros emplean un sistema
de retencin de muestra durante la medicin. Sin embargo, la muestra proteica debe
encontrarse pura y no contener componentes no proteicos con el mismo espectro de
absorcin, tales como cidos nucleicos contaminantes. Se debe conocer la secuencia
exacta de aminocidos de la protena analizada y se debe calcular el coeficiente de
absorcin especfico de esa protena previo a la determinacin de la concentracin en
solucin. Este mtodo es el ms rpido, pero propenso a errores.

REFERENCIAS

DETERMINACION DE PROTEINAS: METODO DE BRADFORD. [internet] Disponible en:

https://bioquibi.webs.ull.es/practicas/3.pdf [acceso 2 de septiembre del 2017].
DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE LOWRY. [internet] Disponible
en: https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/4.pdf [acceso 2 de septiembre del
2017].

Cuantificacin de protenas Mary Johnson. [internet] Disponible en:

http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html [acceso 2 de septiembre
del 2017].