METODOLOGA Solanum tuberosum (extraccin de antocianinas)

I. TRATAMIENTO DE MATERIA PRIMA:

RECOLECCIN DE LA MUESTRA:
Las papas negras Solanum tuberosum, sern recolectadas en la provincia de Lima. (lugar por
definir).

Del tubrculo de Solanum tuberosum se pesarn 25 g de papa cruda y cocida, con y sin cscara,
luego se cortarn en trozos pequeos y se licuar con 100 ml de agua destilada, la cual se filtrar
al vaco y finalmente se centrifugar a 1200 rpm durante 30 minutos. Luego se separar el
sobrenadante y se llevar a liofilizar. Los liofilizados fueron almacenados en frascos de color
mbar a 4 C, hasta el momento de ser analizados

SECADO Y MOLIENDA
Las papas colectadas sern lavadas con agua/leja, luego cortadas en rodajas finas para luego ser
secadas en la estufa a 38 0.2 C con ventilacin permanente de aire. Una vez secas las papas
sern molidas, hasta obtener un polvo fino, que ser conservado en un frasco de vidrio mbar
limpio, seco y rotulado.

EXTRACCIN DE ANTOCIANINAS

Extraccin del pigmento con acetona cloroformo:

Se ha extrado las antocianinas de las papas nativas pigmentadas en un mortero con acetona
acidificada con HCl 0,01% , posteriormente se filtr a presin reducida luego se hizo la reparticin
liquido-liquido con cloroformo en una pera de decantacin y se separ la fase del extracto
antocinico y luego se concentr en un rotavapor a 50C a una presin de 100 psi hasta 2/3 partes
de su volumen inicial, posteriormente este extracto se ha centrifugado decantado y aforado a un
volumen conocido para su posterior hidrolisis y purificacin con cartucho C-18 Sep-Pak para su
posterior anlisis y evaluacin ().
Pesar 200 g de MP y someter a molienda y tamizado, agregar NaOH 2% en un volumen de 300
mL en un espacio de 12 - 16 horas. Separar la suspensin coloreada de las semillas. Medir pH y
agregar cido ctrico al 10% para disminuir el pH hasta alcanzar un pH de 2 - 2,25 y favorecer la
precipitacin del colorante. Fitrar al vaco y secar posteriormente.
Se pes 1 gramo tanto de la muestra fresca cortada como de la muestra cocida prensada, y se
llevaron a tubos falcon para centrfuga de 15 ml protegidos de la luz con papel aluminio, al cual
se le adicion 10 ml de etanol acidificado al 0.1 % con HCl, luego se homogeniz levemente la
muestra y se dej macerar por 24 horas a una temperatura de 4 C (figura N14).
Transcurrido el tiempo de maceracin se filtraron al vaco y luego se centrifugaron por 10 minutos
a 4000 rpm, se extrajo el sobrenadante y se almacen en tubos falcon con tapa rosca a -10 C.

La purificacin es un paso muy importante, debido a que en la extraccin se arrastran

contaminantes los cuales pueden afectar la estabilidad o el anlisis del pigmento, despus de tener
la maceracin despus de 24 horas, las muestras son llevadas a un rotavapor a 40 C por unos 5 a
10 minutos, se almacenarn las muestras a 4 C hasta su utilizacin

DETERMINACIN DE ANTOCIANINAS (Romero - Bezada)

Se utiliz el mtodo del pH diferencial descrito por Giusti y Wrolstad (2001) que se basa en la
extraccin de medio alcohlico acidificado de las antocianinas. Para lo cual se debieron preparar
dos buffers con diferentes valores de pH.
Buffer cloruro de potasio 0,025 M a pH 1,0. Se disolvieron 1,86 g de KCI en 1 L de agua
destilada.
Buffer acetato de Sodio 0,4 M a pH 4,5. Se disolvieron 54,43 g de CH3COONa.3H2O en
1 L de agua destilada.
Para ajustar el pH de los buffers se utilizaron soluciones concentradas de cido clorhdrico con
un potencimetro y agitador magntico.

El procedimiento seguido fue:

a) Se mezcl 5g de materia prima con 25 mL de una solucin alcohlica-cida en un vaso
protegido de la luz, se enjuag el vaso con 25 mL de la misma solucin. La solucin de
extraccin contiene HCI 1,5 N y etanol al 95% en una relacin 15:85 respectivamente.
b) Se trasvas la mezcla a un frasco de precipitacin de 250 mL (debidamente protegido de
la luz). El conjunto se dej macerar por 20 horas a 4 C.
c) Se centrifug a 4000 RPM durante 30 minutos, luego de la cual se trasvas el
sobrenadante cuidadosamente a un baln para luego concentrarlo hasta un volumen
conocido (X) en un rotavapor a 50 C por 15 minutos.
d) El concentrado final se trasvas a un tubo de ensayo y se prepararon diluciones (mximo
1/10) de la muestra con un pH 1 y otra con pH 4,5 (se consideraron 3 repeticiones). Luego
se agit y se dej equilibrar las soluciones por 15 minutos. Todas las diluciones deben
medirse espectrofotomtricamente luego de 15 - 60 minutos de efectuada la mezcla.
 e) Las absorbancias de las diluciones se leyeron a longitud de onda mxima de absorcin
= 520nm y 700 nm para corregir el contenido de interferencias o nubosidad.

Espectrometra FTIR: Los espectros se realizaron en un intervalo de 4000 a 600 cm-1 y en

unidades de transmitancia, en un Espectrmetro FTIR Nicolet iS-10. El procesamiento de los
espectros se realiz mediante el Software OMNI. Las muestras se midieron utilizando el
aditamento de ATR. ()

Espectrofotometra ultravioleta y visible: Los espectros se realizan en un rango de longitud de

onda de 190 a 1100 nm en un espectrofotmetro THERMO GENESYS 10S UV VIS en cubetas
de cuarzo de 10 mm de espesor con velocidad de registro de 2500 nm/min y se utiliz metanol
como solvente.().

Una alcuota de 1 mL de extracto se diluy en una fiola de 10 mL con soluciones de HCl (pH=1)
y acetato de sodio (ph=4,5), por separado. En las soluciones preparadas se determinar el
contenido de antiocianinas segn el mtodo Giusti y Wrolstad de pH diferencial, utilizando un
espectrofotmetro UV-VIS, se registrar las absorbancias a longitudes de onda de 510 y 700 nm.

Total antocianinas (mg/L) = A x P.M x FD x 1000 / (E x l)

Donde:
A = absorbancia = (A510 - A700)pH1,0 - (A510 - A700) pH 4,5
P.M = peso molecular: 449,2 para cianidina-3-glucsido
F.D: factor de dilucin
E = coeficiente de extincin molar
1000 = factor de conversin de g a mg

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