PRCTICA 3.

BIOENSAYO DE CITOTOXICIDAD AGUDA Y CRNICA

Diana Patricia Chamorro; Allison Enriquez Marquez; Natalia Flrez Muoz; Jos Alejandro
Llanos
155001; 154938; 154940; 154949
Universidad Libre - Seccional Cali, Facultad de Ciencias de la Salud,
Programa de Medicina
Cali,Valle del Cauca, Colombia
Octubre 4 de 2017

Figura 3. Pozos de soluciones con artemias salinas.

Figura 1. Morfologa de la Artemia salina.

PREGUNTAS

1.Realice una tabla donde consigne los datos

Figura 2. Esquema morfolgico de la Artemia salina.
experimentales obtenidos. Diferenciando una
columna de la otra con los siguientes parmetros:
Dosis, nmero de muertes, nmero de
sobrevivientes, muertes acumuladas,
sobrevivientes acumulados, total acumulado,
porcentaje de sobrevivientes y porcentaje de
muertes.
 TABLA 1. CITOTOXICIDAD EXTRACTO GUANBANA AMARILLA

NOTA: CADA POZO MINUTO 1 MINUTO 30 MINUTO 60

CONTIENE 10
ARTEMIAS

POZO CONCENTRACI MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS

N

D1 2% 1 9 9 0 0 0

D1 2% 1 9 9 0 0 0

D1 2% 3 7 7 0 0 0

TOTAL 5 25 25 0.0 0 0

TOTAL PORCENTAJE 16.6666% 83.3333% 83.3333% 0.0% 0.0% 0.0%

D2 1% 0 10 10 0 0 0

D2 1% 3 7 7 0 0 0

D2 1% 1 9 9 0 0 0

TOTAL 4 26 26 0 0 0

TOTAL PORCENTAJE 13.3333% 86.6666% 86.6666% 0.0% 0.0% 0.0%

D3 0.5% 0 10 8 2 2 0

D3 0.5% 0 10 6 4 4 0

D3 0.5% 0 10 6 4 2 2

TOTAL 0 30 20 10 8 2

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 66.6666% 33.3333% 26.6666% 6.6666%

D4 0.25% 0 10 2 8 3 5

D4 0.25% 0 10 2 8 5 3

D4 0.25% 0 10 0 10 6 4

TOTAL 0 30 4 26 14 12

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 13.3333% 86.6666% 46.6666% 39.9999%

D5 0.1% 0 10 0 10 0 10

D5 0.1% 0 10 0 10 0 10

D5 0.1% 0 10 0 10 0 10

TOTAL 0 30 0 30 0 30

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 0.0% 100% 0.0% 100%

 TABLA 2. CITOTOXICIDAD FRMACOS

F1: N-ACETIL CISTENA MINUTO 1 MINUTO 30 MINUTO 60

F2: DIFENHIDRAMINA
CLORHIDRATO JARABE

POZO CONCENTRACIN MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS

F1 1 9 1 8 8 0

F1 2% 0 10 6 4 4 0

F1 1 9 5 4 3 1

TOTAL 2 28 12 16 15 1

TOTAL PORCENTAJE 6.6666% 93.3333% 40% 53.3333% 50% 3.3333%

F2 0 10 8 2 2 0
0.25g/100mL
F2 0 10 10 0 0 0

F2 0 10 9 1 1 0

TOTAL 0 30 27 3 3 0

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 90% 10% 10% 0.0%

TABLA 3. PRUEBA CONTROL

S/S: SOLUCIN SALINA MINUTO 1 MINUTO 30 MINUTO 60

POZO CONCENTRACIN MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS MUERTES VIVOS

S/S 0 10 0 10 0 10
30%
S/S 0 10 0 10 0 10

S/S 0 10 0 10 0 10

TOTAL 0 10 0 10 0 10

TOTAL PORCENTAJE 0.0% 100% 0.0% 100% 0.0% 100%

 TABLA 4. TABLA DE REED MUENCH DE GUANBANA AMARILLA

DOSIS Nmero Nmero de Muertes Sobreviviente Total Porcentaje de Porcentaje de

de sobrevivientes Acumulada s Acumulados Acumulado Sobrevivientes Muertes
Muertes s

2% 30 0 30 44 74 0.0% 100%

1% 30 0 60 44 104 0.0% 100%

0.5% 28 2 88 44 132 6.6666% 93.3333%

0.25% 18 12 106 42 148 40% 60%

0.1% 0 30 106 30 136 100% 0.0%

TABLA 5. CITOTOXICIDAD DEL FRMACO

1 MIN 30 MIN 60 MIN

Solucin Salina 0, 0% 0,0% 0.0%

(CONTROL)

N-acetilcisteina 6,6666% 40% 50%

Difenhidramina 0,0% 90% 10%

clorhidrato

Grfica 1. Citotoxicidad del frmaco

2.Anexe impreso, en formato pdf y reciente, una publicacin referente al mtodo de Reed Muench.
Ver documento anexo.
3.Realice una curva donde representa las muertes acumuladas y otra curva en donde represente los
sobrevivientes acumulados en un mismo grfico.

TABLA 6. ACUMULADOS - GUANBANA AMARILLA.

CONCENTRACIN % MUERTES ACUMULADAS % SOBREVIVIENTES

DE LA DOSIS ACUMULADAS

0.1% 0.0% 100%

0.25% 60% 40%

0.5% 93.3333% 6.6666%

1% 100% 0.0%

2% 100% 0.0%

Grfica 2. Citotoxicidad de la guanbana amarilla.

0.3315 - 1 = -0.6685
3.1 Determine el DL50
AntiLog ( -0.6685) = 10-0.6685 = 0.2145
DL50 terico
50% 0
60% 0 = 0.8333 DL50 = 0.2145 mg/kg

Log 0.25
= 0.3979 DL50 Experimental
0.1
0.22 mg/kg aproximadamente
0.8333 x 0.3979 = 0.3315
3.2 Qu puede analizar y concluir acerca de la
prueba realizada?Qu concluye acerca de la
Log 0.1 = -1 DL50?

Porcentaje de error
0.22 0.2145
% error = 0.2145 x 100
0.0055
% error = 0.2145 x 100
% error = 0.02564103 x 100
% error = 2.5641%
La DL50 es una cifra que determina la toxicidad de
un veneno o sustancia, es decir, es la dosis letal para
provocar la muerte a un 50% de un conjunto de
individuos estudiados.
A partir de la DL50 terica que fue de 0.2145 mg/kg
y en comparacin a la experimental 0.22 mg/kg, se
puede apreciar que el porcentaje de error fue de un
2.5641%, lo que representa un nivel de confianza del
96%, por tanto se concluye que la dosis de extracto
de Guanbana Amarilla que se necesita para provocar
la muerte al 50% de la poblacin de Artemia Salina
se encuentra entre el rango de la DL50 terica y
experimental.
Esto es algo que no puede extrapolarse al 100% en el
ser humano, por la complejidad nuestro sistema
inmunitario y otro aspectos, pero al menos nos
ofrecen una visin fiable de la toxicidad de cada una
de las sustancias que se emplean.
La interpretacin de esta cifra es sencilla, si a una
poblacin de artemia salina se le aplica 0.2145 mg
por cada kilogramo de sta, se espera que muera el
50% de la poblacin.
En cuanto a la prueba realizada podemos concluir
que en los pozos en los que se utiliz la guanbana
amarilla registrada en la tabla 1 se pudo evidenciar
que en la exposicin a las dosis de 0.10%,0.25% y
0.5% no se presentaron muertes en el minuto 1, pero
que al aumentar la dosis al 1% y 2% empiezan a
haber muertes en el primer minuto. Despus de 30
minutos para las dosis de 1% y 2% todas las artemias
que quedaban con vida, en esta dosis murieron,
contrario a lo sucedido en las concentraciones
iniciales, donde algunas quedaron con vida,
exceptuando la dosis de 0.1% para la cual al final de
la prueba todas las Artemias sobrevivieron. Con lo
anteriormente dicho, se puede concluir que a mayor
dosis y exposicin, las muertes van a ser mayores y
por ende los sobrevivientes menores, cuya razn de
citotoxicidad est explicado por su principio activo,
Acetogeninas anonceas, la cual desactiva la
habilidad de una clula a generar ATP mediante una
ruta oxidativa, obligando finalmente a una clula a
apoptosis o necrosis, explicado ms ampliamente en
el anlisis, exceptuando la dosis de 0.1, en la cual la
toxicidad no fue suficiente para causar su muerte.
De acuerdo a la grfica No. 1, podemos decir que el
frmaco Difenhidramina clorhidrato es ms txico
que el N-acetilcistena, puesto que el nmero de
muertes por unidad de tiempo a la misma
concentracin es mayor
En cuanto al DL50, ste fue una prueba fundamental
para medir la dosis necesaria para causar la muerte al
50% de las Artemias salinas y poder usarla como
parmetro de fidelidad de dicha prueba comparndola
con nuestro valor experimental y de este modo poder
interpretar y graficar el Mtodo de Reed-Muench
para el porcentaje acumulado de nauplii
sobrevivientes y muertos. Adems de que nos sirve
para extrapolar este tipo de prueba a la evaluacin de
toxicidad de medicamentos o extractos medicina.
ANALISIS
Grfica 1.
En la grfica 1 de Citotoxicidad de frmacos, vemos
que se utilizaron 2 jarabes, el N-acetilcistena y el
Difenhidramina clorhidrato, pero adems se utiliz
una sustancia control, la cual es la solucin salina;
sta se considera nuestra sustancia control puesto que
el microorganismo evaluado fue la Artemia salina, la
cual como su nombre lo indica sobrevive en medio
salino, y por tanto, se encuentra ampliamente en agua
salada. De esta manera para verificar la veracidad de
la prueba, se necesit de esta sustancia para
comprobar que la Artemia se encontraba en un buen
estado y as no sesgar los resultados al exponer este
microorganismo a un frmaco en el cual su
supervivencia o muerte no dependiera directamente
de la citotoxicidad de este. De acuerdo a la grfica no
se presentaron muertes de las larvas en ninguno de
los 3 tiempos expuestos a la solucin salina,
comprobando as la no existencia de sesgos.
El frmaco N-acetilcistena acta como mucoltico, manera una sobredosis con este medicamento puede
secretoltico y fluidificante de las secreciones
mucopurulentas de las vas respiratorias hacindolas
menos viscosas y facilitando su expectoracin. El
moco segregado por las membranas mucosas est
compuesto por una mezcla de glicoprotenas y
proteoglicanos. (1)
En la grfica 1 podemos ver que al minuto 1 durante
la exposicin a N-acetilcistena se presentan el
6.6666% de las muertes, esto debido a que la
Artemia salina en su composicin es rica en protenas
(nauplios 50-60%; adultos 40-50%) (2) y como este
frmaco induce la lisis del moco, a su vez promueve
la lisis de las protenas, protenas tambin presentes
en la Artemia salina. A los 30 min se presentaron el
40% de las muertes, el porcentaje de muertes
aument ya que las Arteminas estuvieron por ms
tiempo en contacto con el frmaco y por tanto,
tambin la probabilidad de ser lisada. Alrededor de 1
hora, muere el 50%, es decir que al final solo queda 1
Artemia viva. Adems del componente mucolitico
del frmaco, tambin cuenta con los siguientes
excipientes: manitol, sucralosa y esencia de
frambuesa, los cuales son edulcorantes y no tienen
cloruro de sodio, necesario para su supervivencia. (3)
El frmaco Difenhidramina clorhidrato es un
antihistamnico H1 (compite con histamina en los
receptores transmembranales H1 de las clulas
efectoras en tracto gastrointestinal, vasos sanguneos
y tracto respiratorio) con considerable accin
anticolinrgica y sedante. Se utiliza en algunos
somnferos y medicamentos para la alergia. (4)
En la grfica No. 1 observamos que al transcurrir un
minuto de adicionar las Artemias salinas en el pozo
con el frmaco antes mencionado no se registra
ninguna muerte (0,0%).
Despus de 30 minutos tenemos que han muerto el
90% de las artemisas salinas y a los 60 minutos el
10% restante. Esto es porque la difenhidramina
clorhidrato tiene un efecto sobre el Sistema Nervioso
Central (SNC), principalmente el Sistema Nervioso
autnomo (SNA) puede llegar a producir dificultad
en la movilidad, hasta tal punto que no puedan
moverse y terminan muriendo. En este caso las
Artemias salinas tienen un Sistema Nervioso poco
desarrollado y esto puede aumentar la posibilidad de
que los efectos sobre este sean mucho ms mortales,
pues cualquier dao, por pequeo que sea, tendr
repercusiones fisiolgicas ms grandes. De la misma
afectar el corazn dorsal de estos animales y llevarlos
a tener arritmias, ataque cardaco, coma y muerte. (5)
De acuerdo a los resultados evidenciados, es posible
concluir que mientras ms exposicin haya al
frmaco el nmero de muertes aumenta, as como
tambin que entre mayor sea la concentracin, mayor
nmero de muertes hay por unidad de tiempo.
Grafica 2.
Annona Muricata es el nombre cientfico que se le da
a la planta de la que se tom el extracto, conocida
tambin como Guanbana Amarilla. Este rbol es
cultivado en muchos pases por sus frutos
comestibles, los cuales tienen cierto grado de
toxicidad, el cual evaluamos en el bioensayo y cuyo
registro lo podemos apreciar en la tabla No. 1.
Dentro de sus compuestos se encuentran principios
activos como las Acetogeninas anonceas, que son
sustancias cerosas que resultan de la combinacin de
cidos grasos de cadena larga (C32 C34) con una
unidad de 2-propanol en el carbono 2 para formar
una lactonaterminal. Esta sustancia bloquea el
complejo I, que es responsable de convertir NADH a
NAD+, y crea la acumulacin de protones a travs de
la membrana interna mitocondrial. Esta desactiva la
habilidad de una clula a generar ATP mediante una
ruta oxidativa, obligando finalmente a una clula a
apoptosis o necrosis. Tambin, es una neurotoxina,
sustancias qumicas exgenas neurolgicamente
dainas que pueden causar efectos adversos en la
funcin tanto del tejido nervioso en desarrollo como
en el maduro. Este principio se aplica a la Artemia
salina. (6)
La prueba de citotoxicidad evala teniendo en cuenta
el tiempo, tanto aguda como crnica. Por lo general
se refiere a aguda cuando hablamos de horas y
crnica cuando hablamos de das, sin embargo, por
cuestiones del curso estos tiempos fueron reducidos a
1 minuto, 30 minutos y 1 hora. La concentracin o
dosis letal letal 50 (CL DL50) a travs del Mtodo
de Reed Muench es una prueba en la que se utilizan
varias concentraciones, en nuestra prctica estas
fueron de 0.10%, 0.25%, 0.50%, 1% y 2% con el fin
de determinar la dosis nociva para el 50% de la
poblacin. El valor del DL50 terico en nuestra
prctica fue de 0.2145%, lo que quiere decir que a
esta dosis el 50% de las Artemias se moran. Por otro
lado, el DL experimental, donde se intersectan el
porcentaje de sobrevida y el porcentaje de muerte en
la grfica fue de 0.22% aproximadamente, siendo
este un valor muy cercano al DL terico y
comprobando as la fidelidad de la prueba.
En esta grfica podemos apreciar que a una
concentracin de 0.10% el 100% de las Artemias, es
decir las 10 Artemias de cada pozo, (3)
sobrevivieron, lo que significa que sta concentracin
no fue suficiente para causar su muerte; sin embargo,
a pesar de que dicha concentracin no result letal, se
evidenci el dao por toxicidad puesto que las
Artemias disminuyeron notablemente su movimiento
habitual, el cual es constante en condiciones
normales como se vio evidenci en la prueba control,
lo que indica que el hecho de que no hayan muerto
no quiere decir que la dosis no haya sido txica, sino
que no estaba en la concentracin suficiente como
para matarlas en el tiempo del experimento. El dao
mencionado de la movilidad puede deberse a dao
relacionado a los cordones nerviosos laterales que
garantizan la movilidad de los toracpodos (ver
figura 2) y a la reduccin de los niveles de ATP a
causa del dao mitocondrial.
Conforme la concentracin de la guanbana amarilla
aumenta, tambin lo hace el porcentaje de muertes,
puesto que al 0.25% el 40% de las Artemias
murieron. Al 0.50% de la dosis aproximadamente el
95% de las Artemias murieron y al 1% la totalidad de
las Artemias, es decir, el 100% se encontraban
muertas y por lo tanto a una dosis de 2% stas ya
estaban muertas.

BIBLIOGRAFA

1. Vademecum V. Acetilcistena [Internet].

Vademecum.es - Su fuente de conocimiento
farmacolgico. Vidal Vademecum; 2016. Available
from:
https://www.vademecum.es/principios-activos-acetilc
isteina-r05cb01
2.ARTEMIA SALINA. Available from:
http://www.andresroca.com/fotosdiscos/informacion/
artemia_salina.htm
3.GADOR S.A. Antusel, N-acetilcistena. [Internet].
2016. Avialable from:
http://www.gador.com.ar/wp-content/uploads/2017/0
4/G00175100-00-ANTUSEL.pdf
4.Pediamecum. Difenhidramina. CM comit de
medicamentos. [Internet]. 2016. Avialable from:
http://pediamecum.es/wp-content/farmacos/Difenhidr
amina.pdf
5.Antihistamnicos [Internet]. Antihistamnicos.
Available from:
https://www.antihistaminico.com/difen
6.Annona muricata [Internet]. Wikipedia. Wikimedia
Foundation; 2017. Available from:
https://es.wikipedia.org/wiki/Annon