CAPTULO 2.5.11.

MUERMO

RESUMEN

El muermo es una enfermedad contagiosa fatal de los caballos, burros y mulas, y es causada por
la infeccin con la bacteria Burkholderia mallei (este nombre ha sustituido recientemente al de
Pseudomonas mallei, y la bacteria se ha clasificado previamente como Pfeifferella, Loefflerella,
Malleomyces o Actinobacillus). La enfermedad provoca ndulos y ulceraciones en el tracto
respiratorio superior y en los pulmones. Tambin se presenta una forma de la enfermedad que
afecta a la piel y se conoce como farcy. El control del muermo requiere ensayos en los casos
clnicos sospechosos, el examen de los quidos aparentemente normales y la eliminacin de los
animales positivos. Se transmite a los humanos, por lo que todo el material infectado/contaminado
o potencialmente infectado/contaminado debe manejarse en un laboratorio que cumpla los
requisitos para la Contencin de los Patgenos del Grupo 3.

Identificacin del agente: Los frotis obtenidos a partir de material fresco pueden revelar la
presencia de bacilos Gram-negativos, no esporulados y no encapsulados. Se ha demostrado la
existencia de una cubierta parecida a una cpsula mediante microscopa electrnica. La bacteria
crece de forma aerbia y prefiere los medios de cultivo que contienen glicerol. A diferencia de las
especies de Pseudomonas, y de la bacteria estrechamente relacionada Burkholderia pseudomallei,
Burkholderia mallei no es mvil. Los cobayas son muy susceptibles, y los machos se pueden
utilizar si es estrictamente necesario para aislar el micoorganismo a partir de una muestra muy
contaminada. Los kits comerciales de identificacin bioqumica carecen de sensibilidad
diagnstica. Se dispone de anticuerpos monoclonales especficos y de la reaccin encadena de la
polimerasa (PCR) as como de pruebas de PCR en tiempo real. Las ltimas tambin se han
evaluado en brotes recientes.

Pruebas serolgicas y de la malena: La prueba de la malena es un ensayo clnico sensible y

especfico para detectar hipersensibilidad frente a Burkholderia mallei. La malena, una fraccin
proteica soluble en agua del organismo, se inyecta subcutneamente, intradermopalpebralmente o
se administra mediante gotas. En los animales infectados la piel o el prpado se hincha de forma
clara en 12 das. Los ensayos serolgicos ms precisos y fiables para su empleo en el
diagnstico son pruebas de la fijacin del complemento y enzimoinmunoensayos. Recientemente
se ha desarrollado en Rusia un ensayo de aglutinacin con rosa de bengala que slamente se ha
validado en ese pas.

Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: No existen vacunas. Actualmente, el

derivado proteico purificado de malena se encuentra disponible comercialmente en el Instituto
Central de Investigacin y Control Veterinario, 06020 Etlik, Ankara, Turqua.

A. INTRODUCCIN
El muermo es una enfermedad bacteriana con potencial zoonsico conocida desde tiempos antiguos, que afecta
a los perisodctilos o los ungulados con pezua no partida. Est causada por la infeccin con la bacteria
Burkholderia mallei (este nombre ha sustituido recientemente al de Pseudomonas mallei (45), y esta bacteria se
clasific en el pasado como Pfeifferella, Loefflerella, Malleomyces o Actinobacillus). Pueden aparecer brotes de
esta enfermedad en los felinos que viven de forma silvestre o en los parques zoolgicos. Se ha demostrado la
existencia de susceptibilidad al muermo en los camellos, osos, lobos y perros. Los carnvoros pueden infectarse
mediante ingestin de carne contaminada, pero el ganado vacuno y porcino son resistentes (22). Los pequeos
rumiantes tambin puden infectarse si se mantienen en contacto con caballos con muermo (42). La forma aguda
del muermo se da con mayor frecuencia en los burros y las mulas, los cuales sufren de fiebre alta y presentan
sntomas respiratorios (orificios nasales hinchados, disnea y neumona); la muerte se produce en pocos das. En

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los caballos, el muermo sigue generalmente un curso crnico y los animales pueden sobrevivir durante varios
aos. Los casos crnicos y subclnicos ocultos constituyen fuentes peligrosas de infeccin debido a la
permanente o intermitente liberacin de la bacteria (42).

En los orificios nasales de los caballos se desarrollan ndulos inflamados y lceras que dan lugar a una
secrecin amarilla pegajosa, acompaada de un aumento del tamao de los ndulos linfticos submaxilares.
Despus de la cicatrizacin de las lceras, aparecen cicatrices estrelladas. La formacin de abscesos nodulares
en los pulmones se presenta acompaada de una debilidad progresiva, episodios de fiebre, tos y disnea.
Tambin pueden aparecer diarrea y poliuria. En su forma epitelial (farcy), los ndulos linfticos estn
agrandados y se desarrollan abscesos nodulares (yemas) de 0,5 a 2,5 cm, que se ulceran y liberan un pus
amarillo graso. Regularmente se encuentran ndulos en el hgado y en el bazo. Las secreciones del tracto
respiratorio y la piel son infectivas, y, la transmisin entre animales es frecuente, vindose facilitada por el
contacto estrecho, tiene lugar mediante inhalacin, ingestin de material contaminado (p. ej. a partir de
comederos con alimentos y agua contaminados), o mediante inoculacin (p. ej. por medio de un arns). El
periodo de incubacin puede variar desde unos pocos das hasta muchos meses (23, 42).

El muermo es transmisible a los humanos por contacto directo con animales enfermos u objetos
infectados/contaminados. En la enfermedad aguda sin tratar puede producirse un 95% de mortalidad en tres
semanas (25). Sin embargo es posible la supervivencia si la persona infectada se trata pronto y de manera
agresiva con un terapia antibitica mltiple y sistmica (17, 23). Tambin tiene lugar una forma crnica de la
enfermedad con abcesos (25). Cuando se manejen animales infectados sospechosos, conocidos, o fomites,
deberan tomarse precauciones estrictas para prevenir la autoinfeccin o la transmisin de la bacteria a otros
quidos. Las muestras de laboratorio deberan almacenarse de manera segura, mantenerse fras y transportarse
como se indica en el Captulo 1.1.1. de este Manual de animales terrestres. Todas las manipulaciones con
material potencialmente infectado/contaminado deben realizarse en un laboratorio que cumpla los requisitos para
la Contencin de los patgenos del Grupo 3, como se indica en el Captulo 1.1.6 de este Manual de animales
terrestres.

El muermo ha sido erradicado de muchos pases de manera legal, mediante la eliminacin de los animales
infectados y restricciones en la importacin. Persiste en algunos pases asiticos, africanos y de Amrica del Sur.
Se puede considerar un enfermedad re-emergente y puede importarse a reas libres de muermo por quidos de
compaa o de carreras (26).

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO

1. Identificacin del agente

Los casos destinados a la investigacin especfica del muermo deberan distinguirse de otras infecciones
crnicas de la mucosa nasal o los senos nasales, y de la papera equina (infeccin con Streptococcus equi),
linfangitis ulcerosa (Corynebacterium pseudotuberculosis), pseudotuberculosis (Yersinia pseudotuberculosis) y
sporotricosis (Sporotrichium spp.) mediante pruebas clnicas. El muermo debera descartarse definitivamente en
los casos sospechosos de linfangitis epizotica (debida a Histoplasma farciminosum), con la que presenta
muchas similitudes. En concreto, en los seres humanos el muermo debera distinguirse de la melioidiosis
(infeccin por B. pseudomallei), que es debida a un microorganismo con gran parecido a B. mallei (22).

a) Morfologa de Burkholderia mallei

Este microorganismo es bastante numeroso en los frotis de las lesiones frescas, aunque en las lesiones
viejas son escasos (41). Deberan teirse con azul de metileno o con la tincin de Gram. Los organismos
son bacilos Gram-negativos bastante claros, principalmente extracelulares y con los extremos redondeados,
de 25 m de largo y 0,30,8 m de ancho y con inclusiones granulares de varios tamaos; a menudo se
tien irregularmente y no tienen cpsulas fcilmente visibles por microsocpa de fondo claro ni forman
esporas. Mediante microscopa electrnica se ha establecido la presencia de una cubierta similar a una
cpsula. Esta cpsula est compuesta por carbohidratos neutros y sirve para proteger a la clula frente a
factores ambientales desfavorables. A diferencia de otros organismos del grupo Pseudomonas, y de su
pariente cercana Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei no tiene flagelos y por tanto no es mvil
(19, 31). Los organismos son difciles de mostrar en secciones de tejido, donde pueden presentar una
apariencia globular (21). En los medios de cultivo vara su apariencia, que depende de la edad del cultivo y
el tipo de medio. En los cultivos viejos existe un pleomorfismo claro. Forman filamentos ramificados en la
superficie de los medios de cultivo (26).

b) Caractersticas de cultivo
Es preferible intentar el aislamiento a partir de lesiones no abiertas y sin contaminar (21). El organismo es
aerbio y, opcionalmente, anaerobio solamente en presencia de nitrato (8, 19), creciendo de forma ptima a
37C (20). Crece bien aunque lentamente en medios de cultivo ordinarios y se recomienda la incubacin de

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los cultivos durante 72 horas; el enriquecimiento con glicerol es particularmente til. Despus de unos
pocos das en agar con glicerol se observa un crecimiento confluente con un color ligeramente cremoso, de
aspecto liso, hmedo y viscoso. El cultivo se engrosa si la incubacin es prolongada, y se vuelve marrn
oscuro y duro. Tambin crece bien en agar-glicerol-patata y en caldo con glicerol, en los que forma unas
bolitas viscosas. En agar nutritivo,el crecimiento es mucho menos exuberante, y, en gelatina, el crecimiento
es pobre (34). En muestras que no se han obtenido bajo condiciones estriles, el crecimiento de B. mallei
es normalmente encubierto por el de otras bacterias.

Deberan utilizarse aislamientos recientes para las reacciones de identificacin porque pueden surgir
alteraciones en las propiedades de los cultivos in-vitro. B. mallei acidifica ligeramente la leche tornasolada, y
puede producir su coagulacin despus de una incubacin larga. Reduce nitratos a nitritos. Aunque algunos
investigadores han descrito que la glucosa es el nico carbohidrato fermentable, otros han mostrado que si
se emplean un medio y un indicador adecuados, B. mallei fermenta consistentemente la glucosa y otros
carbohidratos como la arabinosa, fructosa, galactosa y manosa (6). B. mallei no produce indol, no hemoliza
la sangre de caballo y los cultivos no producen pigmentos difusibles (19). Puede utilizarse un sistema de
ensayo comercial de laboratorio (p. ej. API [Indice de Perfil Analtico]: Analytab Products, BioMerieux o
Biolog [Hayward, California]) para realizar una confirmacin sencilla de que el organismo pertenece al grupo
Pseudomonas. En general, los sistemas comerciales disponibles no son adecuados para identificar sin
ambigedad el creciente nmero de especies pertenecientes al gnero Burkholderia (9). La falta de
movilidad tiene una especial relevancia. Existe un bacteriofago especfico disponible para fagotipificacin
B. mallei (43).

Todos los medios de cultivo preparados deberan someterse a un control de calidad y favorecer el
crecimiento del organismo a partir de un inculo pequeo. La cepa de referencia debera sembrarse en
paralelo con las muestras sospechosas para asegurar que los ensayos estn funcionando correctamente.

El suplemento de los medios con sustancias que inhiben el crecimiento de organismos Gram positivos (p.
ej. cristal violeta, proflavina) ha resultado ser til en las muestras contaminadas, al igual que el
pretratamiento con penicilina (1.000 unidades/ml durante 3 horas a 37C) (22). Se ha desarrollado un medio
selectivo (44) compuesto por polimixina E (1.000 unidades), bacitracina (250 unidades) y actidiona
(0,25 mg) incorporadas en agar triptona (0,1%), o en agar nutritivo (100 ml), que contiene glicerina (4%),
suero de burro o caballo (10%) y hemoglobina ovina.

Fuera del cuerpo, el organismo presenta poca resistencia frente a la desecacin, el calor, la luz o los
reactivos qumicos, de manera que es poco probable su supervivencia despus de dos semanas (25). Sin
embargo, probablemente puede sobrevivir unos pocos meses en condiciones favorables. Burkholderia
mallei puede permanecer viable en el agua corriente durante al menos 1 mes (34). El cloruro de
benzalconio o roccal (1/2.000), hipoclorito sdico (500 ppm como cloro disponible), yodo, cloruro
mercrico en alcohol y el permanganato potsico han demostrado ser muy efectivos para la desinfeccin de
B. mallei (20). Los desinfectantes fenlicos son menos efectivos.

c) Inoculacin en animales de laboratorio

Cuando ha sido necesario se han utilizado cobayas, hamsters y gatos para el diagnstico. Si se considera
inevitable el aislamiento en un animal de laboratorio, el material sospechoso se inocula intraperitonealmente
en un cobaya macho. Como esta tcnica solo tiene una sensibilidad del 20%, se recomienda la inoculacin
de al menos cinco animales (25). El material positivo provocar peritonitis severa localizada y orquitis (la
reaccin de Strauss). El nmero de organismos y su virulencia determina la gravedad de las lesiones.
Cuando la muestra de prueba se encuentra fuertemente contaminada, se emplean pasos adicionales (11).
La reaccin de Strauss no es especfica del muermo ya que otros organismos pueden provocarla. El
examen bacteriolgico de los testculos infectados debera confirmar la especificidad de la respuesta
obtenida.

d) Confirmacin por la reaccin en cadena de la polimerasa y PCR en tiempo real

En los ltimos aos se han desarrollado varias pruebas de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y de
PCR en tiempo real para la identificacin de Burkholderia mallei (13, 32, 36, 38, 39), pero solo una prueba
por PCR y otra por PCR en tiempo real se evaluaron con muestras de un reciente brote de muermo en
caballos (30, 37). Estas dos pruebas se describen con ms detalle aqu. No obstante, su consistencia
tendr que demostrarse en el futuro por estudios entre diversos laboratorios. Se deben de tener en cuenta
las directrices y precauciones sealadas en el captulo 1.1.4 de este Manual.

Preparacin de ADN
Se transfieren colonias aisladas de las placas con agar a 200l de tampn de lisis (5 tampn D [PCR
Optimation Kit, Invitrogen, DeShelp, The Netherlands, diluido 1/5 en agua ultra-pura]; 0,5% Tween 20 [ICI,
American Limited, Merck, Hohenbrunn, Germany]; 2 mg/ml de proteinasa K [Roche Diagnostics, Mannheim,

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Germany]). Tras incubar a 56C durante 1 hora e inactivar durante 10 minutos a 95C, se emplean 2 y 4 l
del lisado clarificado para templado o molde in la prueba de PCR o de PCR en tiempo real,
respectivamente.

Se cortan con un bistur muestras de tejidos de caballo (piel, hgado, bazo, pulmones y conchas)
inactivadas y conservadas en formalina (48 horas, 10% v/v), hasta trozos de 0.5 0,5 cm
(aproximadamente 500 mg). Las muestras se lavan dos veces con agua destilada (10 ml), se incuban
durante toda la noche a 4C en solucin salina estril y se homogenizan usando nitrgeno lquido y un
mortero. El ADN total se prepara a partir de 50 mh de tejido con el OIA amp Tissue KitTM siguiendo las
instrucciones del fabricante (Oiagen, Hilden, Germany). El ADN se eluye con 80 l de dH2O, de los cuales
se usan 4 l como templado.

Prueba PCR (30)

La prueba puede que tenga que adaptarse al instrumento de PCR utilizado con pequeas modificaciones
en las condiciones de ciclo y en la concentracin de reactivos usados.

Los oligonucletidos empleados en la ref. 30 estn diseados con arreglo a las diferencias en las
secuencias fliP de B. mallei ATCC 23344T (nmeros de acceso NC 006350 y NC006351) y B. pseudomallei
K96243 (nmeros de acceso NC 006348, NC 006349). Se usan los cebadores Bma-IS407-flip-f (5-TCA-
GGT-TTG-TAT-GTC-GCT-CGG-3) y Bma-IS407-flip-r (5-CTA-GGT-GAA-GCT-CTG-CGC-GAG-3) para
amplificar un fragmento de 989 pb. La PCR se realiza con 50 l de mezcla preparada (Eppendorf, Hamburg,
Germany) y 15 pmols de cada cebador. Las condiciones de termociclacin son 94C durante 30 segundos;
65C durante 30 segundos y 72C durante 60 segundos. El ciclo se repite 35 veces. Se aade un paso final
de elongacin (72C durante 7 minutos). La visualizacin de los productos se hace por luz UV tras
electroforesis en gel de agarosa (1% p/v en tampn TAE) y tincin con bromuro de etidio. Es necesario
incluir en cada recorrido controles de templado, con agua de grado PCR en vez de templado, y controles
positivos con ADN de B. mallei para detectar contaminaciones por amplificaciones de recorridos previos o
fallos en la amplificacin.

El lmite inferior de detacin es de 10 fg o el equivalente a 2 genomas.

Prueba PCR en tiempo real (37)

La prueba tiene que ser adaptada al instrumento utilizado de PCR en tiempo real con pequeas
modificaciones; por ejemplo, los viales de los ciclos tienen que elegirse segn las recomendaciones de los
fabricantes y la concentracin de los oligonucletidos pueden tener que doblarse o cambiarse el marcaje de
las sondas. Los autores usan un sistema de PCR en tiempo real MX3000TM (Stratagene, Amsterdam, The
Netherlands) y placas de 96 pocillos (ThermoFast 96 ABGeneTM, Rapidozym, Berlin, Germany).

Los oligonucletidos usados en la ref. 37 estn diseados con arreglo a las diferencias en las secuencias
fliP de B. mallei ATCC 23344T (nmeros de acceso NC 006350 y NC006351) y B. pseudomallei K96243
(nmeros de acceso NC 006348, NC 006349). La sonda fuorognica se sintetiza con 6-carboxi-fluorescena
(FAM) en el extremo 5 y con un black hole quencher 1 (BHQ1) en el extremo 3. Los oligonucletidos
empleados fueron Bma-fip-f (5-CCC-ATT-GGC-CCT-ATC-GAA-G-3), Bma-flip-r (5-GCC-CGA-CGA-GCA-
CCT-GAT-T-3) y la sonda Bma-flip (5-6FAM-CAG-GTC-AAC-GAG-CTT-CAC-GCG-GAT-C-BHQ1-3).

La mezcla de reaccin de 25 l contiene 12,5 l de 2 TaqManTM Universal MasterMix (Applied

Biosystems, Foster City, USA), 0,1 l de cada cebador (10 pmol/l), 0,1 l de la sonda (10 pmol/l) y 4 l de
muestra. Las condiciones de termociclacin son 50C durante 2 minutos; 95C durante 10 minutos;
45 (50 ciclos) a 95C durante 25 segundos y 63C durante 1 minuto. Las posibles contaminaciones con
productos de amplificacin de reacciones previas se inactivan con una incubacin inicial usando uracil N-
glicosilasa.

Los autores sugieren incluir un control de inhibicin interna basado en un gen del bacterifago lambda
(Lambda F [5-ATG-CCA-CGT-AAG-CGA-AAC-A-3], Lambda-R [5-GCA-TAA-ACG-AAG-CAG-TGC-AGT-
3], Lam-YAK [5- YAK-ACC-TTA-CCG-AAA-TCG-GTA-CGG-ATA-CCG-C-DB-3]), que puede ser titulado
para dar valores reproducibles del umbral del ciclo. Sin embargo, dependiendo del material de muestra, se
puede usar adicionalmente, o como una alternativa, un gen house-keeping. Es necesario incluir en cada
recorrido controles de templado, con agua de grado PCR en vez de templado, y controles positivos con
ADN de B. mallei para detectar contaminaciones por amplificaciones de recorridos previos o fallos en la
amplificacin

El rango lineal de la prueba abarca concentraciones de 240 pg a 70 fg de ADN bacteriano/reaccin. El nivel

de deteccin minima, definido como la cantidad menor de ADN que fue repetidamente detectable en tres

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recorridos con ocho medidas en cada uno de ellos es 60 fg de ADN o el equivalente a cuatro genomas
(95% de probabilidad). La variabilidad del ensayo interno de la prueba fliP PCR para 35 pg ADN/reaccin es
del 0,68% (basado en valores Ct) y para 875 fg de ADN es de 2,76%, respectivamente.

e) Otros mtodos
En 2004 se secuenci el genoma de la cepa tipo Burkholeria mallei ATCC 23344T (27) y despus el de
otros aislamientos que revelaron una amplia plasticidad genmica. El paso por diferentes especies
hospedadoras o por medios de cultivo puede provocar una considerable alteracin de las secuencias (29).
La prdida de la capacidad de producir LPS y/o el polisacrido de la cpsula debido a una mutacin es un
hecho bien conocido y origina una prdida o reduccin de la virulencia e influencia las pruebas serolgicas
(26). Se han incorporado con xito varias tcnicas moleculares de tipificacin. Tcnicas simples como la
PCR de fragmentos polimrficos de restriccin (35) y la electroforesis en gel en campo pulsantes (5) se
pueden usar para discriminar los aislamientos. La ribotipificacin empleando los enzimas de restriccin PstI
y EcoRI en combinacin con una sonda 18-mer de ADNr de E.coli produjo 17 ribotipos distintos con
25 aislamientos de B. mallei (12). Estas pruebas son todava pruebas internas de laboratorios
especializados ya que es necesaria una coleccin de cepas muy amplia. La tipificacin de secuencias de
mltiples loci (MLST) se puede realizar con ADN purificado de modo que no hay necesidad de un cultivo
excesivo del agente o de mantener una coleccin de cepas. El anlisis basado en webs podra incluso,
potenciar los diagnsticos (10). No se pueden describir caractersticas histopatolgicas especficas para las
lesiones producidas por B. mallei. Para anlisis inmunohistoqumico se pueden emplear sueros
hiperinmunes contra B. mallei obtenidos en conejo.

2. Pruebas serolgicas y de la malena

a) Prueba de la malena (prueba prescrita para el comercio internacional)

El derivado proteico purificado (DPP) de la malena, que se encuentra disponible comercialmente, consiste
en una solucin de fracciones proteicas solubles en agua de B. mallei tratadas con calor. El ensayo
depende de que los caballos infectados sean hipersensibles a la malena. Los casos clnicos avanzados en
caballos y los casos agudos en los burros y las mulas pueden proporcionar resultados no concluyentes que
necesiten el empleo de mtodos adicionales de diagnstico (1).

El ensayo intradermoparpebral
Es el ensayo ms sensible, fiable y especfico para detectar a los perisodctilos o ungulados de pezua no
partida infectados, y ha desplazado mayoritariamente a los ensayos oftlmico y subcutneo (3): se inyectan
intradrmicamente en el prpado inferior 0,1 ml de concentrado DPP de malena, y la prueba se lee a las
24 y 48 horas. La reaccin positiva se caracteriza por una hinchazn edematosa marcada del prpado, y
puede presentarse una secrecin purulenta desde el canthus interno o la conjuntiva. Normalmente, ello
viene acompaado por un aumento en la temperatura. Normalmente, en una respuesta negativa no existe
reaccin, o solo se observa una ligera hinchazn del prpado inferior.

El ensayo oftlmico
Es menos fiable que el ensayo intradermoparpebral. Se depositan unas gotas de malena sobre el ojo en el
canthus. En un animal infectado se hinchan los prpados y, a veces, un lado de la cara, y puede
presentarse una pequea secreccin en el ojo. La reaccin puede ocurrir tambin en el ojo opuesto, aunque
en menor proporcin.

El ensayo subcutneo
Esta prueba interfiere con diagnsticos serolgicos posteriores, por lo que son preferibles los otros dos
ensayos de la malena. Adems, puede que este ensayo no sea aceptable en algunos pases. La
temperatura de los caballos debe encontrarse por debajo de los 38.8C (104F) el da anterior al ensayo, en
el momento de la inoculacin, y 9, 12 y 15 horas despus de la inoculacin. Se trasquila un pedazo de piel
de 10 cm cuadrados del medio del cuello y se desinfecta; se inyectan subcutneamente en el centro de la
piel 2,5 ml de malena diluida. En un ensayo positivo, el caballo desarrolla una pirexia de 40C (120F) o
ms elevada durante las primeras 15 horas, y, en 24 horas, se desarrolla una hinchazn dolorosa con los
bordes elevados en el punto de la inoculacin. En los caballos que no padecen muermo la hinchazn local
transitoria no existe o es mnima. Los animales dudosos pueden reensayarse despus de 14 das
empleando una dosis doble de malena.

b) Prueba de la fijacin del complemento (FC) (prueba prescrita para el comercio internacional)
Aunque nos es tan sensible como la prueba de la malena, la prueba FC constituye un ensayo serolgico
preciso que se ha empleado durante muchos aos pare el diagnstico del muermo (3). Se ha descrito que

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posee un 9095% de exactitud, y los sueros son positivos dentro de la primera semana posterior a la
infeccin y siguen sindolo en caso de exacerbarse el proceso crnico (34). Sin embargo, la especificidad
de la prueba de la FC ha sido recientemente cuestionada (26)

Preparacin del antgeno (16)

i) Se inoculan frascos que contienen infusin de carne ms un 3% de glicerol con un cultivo en fase
exponencial de B. mallei, y se incuban a 37C durante 812 semanas.
ii) Los cultivos se inactivan exponiendo los frascos a corriente de vapor (100C) durante 60 minutos.
iii) El sobrenadante se decanta y se filtra. El filtrado se calienta otra vez mediante exposicin a corriente
de vapor durante 75 minutos en tres das consecutivos, y se clarifica mediante centrifugacin.
iv) El producto clarificado se concentra a un dcimo de su volumen original mediante evaporacin en un
bao de agua o vapor.
v) El antgeno concentrado se envasa en frascos opacos para protegerlo de la luz y se almacena a 4C.
Se ha demostrado que el antgeno es estable durante al menos 10 aos en forma concentrada.
vi) Se preparan lotes de antgeno diluyendo el antgeno concentrado 1/20 con tampn salino estril ms
fenol al 0,5%. El antgeno diluido se dispensa en viales de vidrio opaco y se almacena a 4C. La
dilucin final de trabajo se determina mediante tiulacin en serie. La dilucin final de trabajo para su
empleo en la prueba de la FC se prepara en el momento en que se realiza el ensayo.

El antgeno resultante contiene fundamentalmente lipopolisacrido. Un procedimiento alternativo consiste

en emplear cultivos recientes, creciendo el organismo en tubos inclinados con agar-glicerol y lavndolos
con suero salino. Se calienta una suspensin del cultivo durante 1 hora a 70C y la suspensin bacteriana
tratada con calor se emplea como antgeno. La desventaja de este mtodo de preparacin de antgeno es
que contiene todos los componentes de la clula bacteriana. Debera comprobarse la inocuidad del
antgeno inoculando placas de agar-sangre.

Procedimiento del ensayo (24)

i) El suero se diluye 1/5 en tampn salino con veronal (cido barbitrico) que contiene gelatina al 0,1%
(VBSG) o DFC (diluyente para fijacin del complemento-disponible en forma de tabletas) sin gelatina.
ii) El suero diluido se inactiva durante 30 minutos a 56C. El protocolo de fijacin de complemento del
USDA recomienda una inactivacin de 35 minutos (25). (El suero de otros quidos distintos al caballo
debera inactivarse a 63C durante 30 minutos.)
iii) Se preparan diluciones medias de los sueros en placas de microtitulacin con fondo redondo.
iv) El complemento del cobaya se diluye en el tampn escogido (elegido) y se emplean 5 (u
opcionalmente 4) unidades hemolticas-50% de complemento (HC50).

v) Los sueros, el complemento y el antgeno se mezclan en las placas y se incuban 1 hora a 37C. (Un
procedimiento aceptable es la incubacin durante toda la noche a 4C.)
vi) Se aade una suspensin al 2% de clulas rojas de oveja sensibilizadas y lavadas. El protocolo del
USDA recomienda confirmar las reacciones positivas en un tubo de ensayo con un 3% de eritrocitos
de oveja (24).
vii) Las placas se incuban durante 45 minutos a 37C, y a continuacin se centrifugan durante 5 minutos a
600 g.

Una muestra que produce un 100% de hemlisis a la dilucin 1/5 es negativa, 2575% de hemlisis es
sospechosa, y la ausencia de hemlisis (100% de fijacin) es positiva. Desafortunadamente, pueden
producirse falsos positivos, y B. mallei y B. pseudomallei presentan reaccin cruzada y no pueden
diferenciarse mediante serologa (3, 25). Adems, los caballos sanos pueden dar una reaccin en la FC de
falso positivo durante un tiempo variable despus de un ensayo intradrmico de malena.

c) Enzimoinmunoensayos
Se han descrito enzimoinmunoensayos (ELISAs) tanto en placa como en membrana (blot) para el
serodiagnstico del muermo, pero ninguno de estos protocolos ha podido diferenciar serolgicamente entre
B. mallei y B. pseudomallei. La aproximacin mediante transferencia (blotting) ha supuesto el empleo de
mtodos de transferencia tipo Western en lnea y a partir de muestras separadas electroforticamente (14,
40). Tambin se ha desarrollado un ELISA competitivo que utiliza un anticuerpo monoclonal anti-
lipopolisacrido no caracterizado y ha mostrado un rendimiento similar al de la prueba de la FC (15). El
desarrollo de anticuerpos monoclonales especficos frente a componentes antignicos de B. mallei ofrece el
potencial para la consecucin futura de ELISAs ms especficos que ayudarn a resolver resultados

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cuestionables en caballos importados sometidos a cuarentena (7, 18, 25). De momento, no se ha validado
ninguna de estas pruebas.

d) Otras pruebas serolgicas

Se ha descrito un ELISA de transferencia con avidina-biotina (40), pero todava no se ha utilizado
extensamente ni se ha validado. El antgeno consiste en un cultivo bacteriano inactivado por calor que ha
sido concentrado y purificado. Se deposita una gota de este antgeno en una tira de nitrocelulosa que se
emplea para detectar anticuerpo frente a B. mallei en el suero equino. Empleando tiras con antgeno y
prebloqueadas el ensayo se puede completar en aproximadamente 1 hora. Pueden emplearse suero o
sangre entera para realizar el ensayo, y la hemlisis parcial no produce ningn color de fondo en la zona
cargada con el antgeno sobre la nitrocelulosa. Recientemente, la tecnologa de microarrays de
polisacridos ofrece nuevas y prometedoras estrategias para mejorar la sensibilidad en la serologa (28).

Se ha descrito un ensayo de aglutinacin en placa con rosa bengala (RBT) para el diagnstico del muermo
en caballos y otros animales susceptibles; dicho ensayo solo ha sido validado en Rusia. El antgeno
consiste en una suspensin bacteriana coloreada con rosa de bengala y se emplea en un ensayo de
aglutinacin en placa.

La precisin de los ensayos de aglutinacin y precipitina no es adecuada para su empleo en programas de

control. Los caballos con muermo crnico y los de salud dbil dan lugar a resultados negativos o no
concluyentes.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

No existen vacunas disponibles.

El DPP de malena que se utiliza en los ensayos intradermoparpebral y oftlmico es producido comercialmente
por el el Instituto Central de Investigacin y Control Veterinario, 06020 Etlik, Ankara, Turqua.

El ID-Lelystad ha proporcionado la siguiente informacin sobre los requerimientos para el DPP de malena.

1. Control del inculo

Se emplean tres cepas de Burkholderia mallei para la produccin de DPP de malena, la cepa Bogor (originaria
de Indonesia), la cepa Mukteswar (India) y la cepa Zagreb (Yugoslavia). El material del inculo se mantiene
como un concentrado de cultivos congelados. Las cepas se cultivan en agar glicerol a 37C durante 12 das.
Las cepas pueden pasarse por cobayas para mantener la virulencia y antigenicidad.

2. Mtodo de fabricacin

El medio de Dorset-Henley enriquecido con la adicin de elementos traza se utiliza para la produccin del DPP
de malena. El medio lquido se inocula con una suspensin salina densa de B. mallei crecido en agar glicerol. El
medio de produccin se incuba a 37C durante aproximadamente 10 semanas. Las bacterias se inactivan
mediante una corriente de vapor durante 3 horas en un autoclave. El fluido se pasa a travs de una capa de
algodn para quitar los grumos de bacterias. El fluido turbio resultante se clarifica mediante filtracin a travs de
una membrana, y a nueve partes de filtrado se les aade inmediatamente una parte de cido tricloroactico al
40%. La mezcla se deja en reposo durante la noche, depositndose un precipitado parduzco a grisceo.

El lquido sobrenadante se pipetea y se desecha. El precipitado se centrifuga durante 15 minutos a 2.500 g y la

capa de precipitado se lava tres o ms veces en una solucin de NaCl al 5% pH 3, hasta que el pH es de 2,7. El
precipitado lavado se disuelve agitando con un volumen mnimo de un solvente alcalino. El fluido es marrn
oscuro y debera conseguirse un pH final de 6,7. El precipitado de malena tiene que centrifugarse
cuidadosamente y el sobrenadante se diluye con un volumen igual de un tampn glucosado. El contenido en
protena de este producto se estima mediante el mtodo de Kjeldahl, y se liofiliza una vez dispensado en
ampollas.

3. Control del proceso

Durante el periodo de incubacin se inspeccionan los frascos con frecuencia para observar cualquier signo de
contaminacin, y se desechan los frascos sospechosos. Un crecimiento tpico de cultivos de B. mallei muestra
turbidez, sedimentacin, algn crecimiento en superficie con tendencia al hundimiento, y la formacin de un anillo
llamativo de color ligeramente anaranjado a lo largo del margen sobre la superficie del medio.

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4. Control del lote

Cada lote de DPP de malena se ensaya en cuanto a su esterilidad, inocuidad, presencia de conservantes,
contenido en protena y potencia.

El ensayo de esterilidad se realiza de acuerdo con las instrucciones de la Farmacopea Europea.

El examen de la inocuidad se lleva a cabo en 510 caballos normales y sanos, realizando el ensayo intradermo-
parpebral. La hinchazn resultante debera ser, apenas detectable y transitoria, sin signo alguno de flujo
conjuntival.

Los preparados que contienen fenol como conservante no deberan contener ms de un 0,5% (w/v) de fenol. El
contenido en protena no debera ser menor de 0,95 mg/ml ni mayor de 1,05 mg/ml.

El ensayo de potencia se realiza en cobayas y caballos. Los animales se sensibilizan mediante inoculacin
subcutnea con una suspensin concentrada de B. mallei en aceite de parafina o adyuvante de Freund
incompleto e inactivada por calor. En lugar de los caballos tambin puede utilizarse el ganado vacuno. El lote de
produccin se ensaya in vivo frente a un DPP de malena estndar mediante inyeccin intradrmica de dosis de
0,1 ml, de manera completamente aleatoria.

Se miden las distintas superficies con eritema en los cobayas despus de 24 horas, y el aumento en el grosor de
la piel en los caballos se mide mediante calibradores. Los resultados se valoran estadsticamente, empleando
mtodos estadsticos estndar para ensayos en paralelo.

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NB: Existe un Laboratorio de Referencia de la OIE para el muermo (vase el cuadro en la parte 3 de este Manual
de animales terrestres o consltese la lista actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int.

10 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008