3.

Metodologie computazionali e sperimentali 23

3. Metodologie computazionali e sperimentali

3.1 Premessa e linee guida dei metodi.

In questo capitolo verranno descritte le metodologie di calcolo e sperimentali

mediante le quali sono stati caratterizzati i polimeri. Il punto di partenza quello del
calcolo delle superfici di energia potenziale delle unit strutturali minime in funzione
dei parametri conformazionali (indicate come mappe conformazionali). Poich i
polimeri trattati sono composti da unit dimeriche gi caratterizzate da altri autori [1-
4], le mappe ottenute sono direttamente confrontabili con quelle riportate in
letteratura consentendo una prima valutazione delle funzioni di potenziale e
parametrizzazione adottate (sezione 3.2).
Successivamente, dal momento che il nostro studio riguarda soprattutto carboidrati in
soluzione (o comunque in uno stato conformazionalmente disordinato), sono descritte
le metodologie della statistica conformazionale, che si basano sulla teoria degli stati
isomerici rotazionali. Attraverso queste procedure che verranno descritte nella
sezione 3.3, sono state calcolate le dimensioni medie delle catene dei vari
polisaccaridi studiati in questa tesi: amilosio, destrano, pullulano, cellulosa,
pseudonigerano, mannano e glucomannani a vari rapporti glucosio/mannosio. In
questi calcoli sono state utilizzate due differenti metodologie, quella matriciale
dovuta a Flory [5] e quella basata sulle applicazioni del metodo Monte Carlo (MC) ai
polisaccaridi [6]. Anche se le due metodologie devono portare agli stessi valori delle
3.Metodologie computazionali e sperimentali 24

grandezze medie, il metodo MC permette di ottenere informazioni dirette sulle

funzioni di distribuzioni di queste propriet, nonch la possibilit di visualizzazione
grafica delle conformazioni delle catene polimeriche ("snapshot"). La scelta di una
metodologia rispetto all'altra stata dettata sia dalle informazioni che si desiderano
ottenere che dalla effettiva praticabilit del calcolo. Vale a dire, ad esempio, che per
la statistica conformazionale sui glucomannani si scelto di utilizzare i programmi
MC poich il programma che sfrutta il metodo matriciale non consente, in modo
immediato di fare i calcoli su copolimeri 'random' [7]. E' stato scelto, inoltre di fare la
statistica conformazionale dei polimeri destrano e pullulano utilizzando soltanto il
metodo matriciale poich i programmi che effettuano il calcolo con il metodo MC
non sono ancora stati adattati al calcolo di zuccheri legati mediante giunzione 1-6. La
validit della scelta dell'utilizzo di una sola delle due metodologie in parte
giustificata dal fatto che per l'amilosio sono state utilizzate entrambe le metodologie,
ottenendo risultati paragonabili tra loro quando, ovviamente, vengano utilizzati gli
stessi campi di forza.
Nella sezione 3.4 verr descritta la metodologia utilizzata per le simulazioni di
dinamica molecolare mediante la quale si ottengono informazioni sulla flessibilit
(temporale) degli oligomeri. Per mezzo della dinamica molecolare vengono calcolate
le traiettorie (variazioni delle coordinate e delle velocit atomiche nel tempo di
simulazione) di tutti gli atomi costituenti la molecola. Anche se tali studi sono limitati
necessariamente a oligomeri piccoli, dalle traiettorie cos ottenute si possono ottenere
informazioni dettagliate sulla flessibilit locale delle molecole. Per questi oligomeri
(da dimeri a pentameri) sono state anche calcolate le frequenze di occupazione degli
stati conformazionali accessibili. Tali frequenze, ottenibili anche dalla statistica
conformazionale solo nel caso di dimeri (vedi nota * a pi pagina) sono state messe in
relazione con l'allargamento di banda di spettri CP-MAS 13C-NMR fatti sui polimeri
allo stato solido (stato amorfo o stato vetroso).
_____________________________
Nota *
La maggior parte dei calcoli mediante statistica conformazionale si basa sull'ipotesi degli stati
energeticamente indipendenti, anche se il numero degli elementi strutturali nell'unit "indipendente"
3.Metodologie computazionali e sperimentali 25

Poich allo stato solido gli anelli piranosidici degli zuccheri (oligomeri e polimeri) si
possono considerare essenzialmente rigidi, l'allargamento di banda risulta essere
principalmente dovuto alla distribuzione degli angoli torsionali dei legami glicosidici.
E' da notare che questa informazione non accessibile da misure in soluzione (NMR
o altre spettroscopie) a causa della elevata mobilit molecolare che consente di
ottenere solo informazioni sulle medie (media termodinamica). Al contrario lo stato
vetroso, essendo strutturalmente rigido, conserva quasi tutte le distribuzioni strutturali
presenti originariamente nello stato liquido. E' quindi lo stato ideale nel quale
possibile studiare i gradi di libert conformazionali accessibili alle molecole.
Dalle traiettorie sono stati infine calcolati i tempi di rilassamento 'spin lattice' T1
ottenibili direttamente anche da misure sperimentali NMR in soluzione che danno
informazione sui moti dinamici locali caratteristici degli oligomeri considerati. Nella
sezione 3.5 sono quindi descritte la teoria sulla quale si basa il calcolo dei T1 e le
metodologie sperimentali per le misure dei T1 (per l'oligomero -glc-(1->4)--glc--
(1->6)--glc) e per le misure CP-MAS 13C NMR.

3.2 Mappe conformazionali

Nelle prime applicazioni delle funzioni di potenziali a disaccaridi, come quelle

descritte nel capitolo 1, la procedura di calcolo consisteva semplicemente nel far
ruotare i monomeri costituiti da anelli rigidi intorno agli angoli glicosidici.

_____________________________
non definita a priori. Ci sono in letteratura solo pochi tentativi per trattare sistemi polisaccaridici pi
complessi, in cui residui non primi-vicini sono inclusi nel calcolo con un potenziale medio. Il motivo
essenziale di tale "trascuratezza" (se cos si pu definire) sta soprattutto nella scelta dell'obiettivo finale
del calcolo, dal momento che nella descrizione dello stato conformazionale di un polimero ad alto peso
molecolare ci sono altre approssimazioni ed ipotesi che vanificherebbero l'accuratezza del calcolo
eseguito per il disaccaride. Su tale filosofia si basato lo sviluppo di campi di forza semiempirici che
hanno in maniera soddisfacente descritto le propriet statistiche medie dei polisaccaridi (a cui anche
questa tesi si ispirata) senza pretendere di fornire una accurata informazione dei dettagli molecolari.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 26

Dal calcolo dell'energia per ognuna delle coppie di angoli ,, si costruisce in questo
modo quella che viene comunemente detta "mappa rigida" (cio mappa
conformazionale del residuo rigido).
Questo tipo di mappe conformazionali hanno il vantaggio di essere veloci e facili da
calcolare, e nonostante il fatto di essere frutto di calcoli semi-empirici approssimati
hanno permesso di determinare le dimensioni medie di catene polisaccaridiche in
accordo con i risultati sperimentali.
Spesso le mappe conformazionali rigide calcolate con differenti campi di forza sono
qualitativamente simili tra loro. La ragione di questo si spiega per il fatto che il valore
dell'energia dovuto principalmente alle interazioni di non legame tra gli atomi dei
due anelli che vengono a distanza di contatto per alcuni valori degli angoli e . La
similarit delle varie mappe rigide stata sempre ritenuta importante poich
evidenzia che, negli aspetti essenziali, il modello fornisce risultati riproducibili.
D'altra parte l'osservazione dettagliata del profilo energetico di mappe calcolate in
modo meno approssimato, evidenzia differenze anche notevoli tra le funzioni di
potenziale e le diverse parametrizzazioni.
Come gi stato detto una delle assunzioni basilari nel calcolo della mappa
conformazionale di un residuo rigido quella di considerare l'energia
conformazionale dipendente soltanto dagli angoli torsionali del legame glicosidico
mentre tutti gli altri gradi di libert sono "mediati" nella struttura di partenza. In realt
alcuni di questi parametri possono avere effetto rilevante sui valori dell'energia se, ad
esempio, si utilizzano come parametri di partenza le coordinate di una struttura
cristallina. In tal caso, ogni gruppo idrossilico ha una orientazione particolare e cio
quella che produce l'interazione pi favorevole con gli atomi vicini per la
stabilizzazione della struttura cristallina. Nel calcolo della mappa conformazionale la
rotazione della struttura (rigida) intorno ai legami glicosidici, pu provocare una
sovrapposizione sfavorevole dei gruppi idrossilici; tale sovrapposizione pu essere
evitata ruotando uno o entrambi di questi gruppi in modo da convergere in un minimo
di energia. Quindi ad ogni coppia di angoli e corrispondono molti valori di una
3.Metodologie computazionali e sperimentali 27

energia conformazionale e ci dovuto al modo complesso in cui l'energia totale

dipende da tutte le interazioni tra atomi "mobili" (gruppi idrossilici, ma anche altri
dipoli, con il campo del resto della molecola, possibili legami idrogeno, fluttuazioni
degli angoli diedri dell'anello,.).
Si definisce "mappa rilassata o adiabatica" quella in cui per ogni coppia e della
mappa viene rappresentato il pi basso valore dell'energia. Si pu costruire una
mappa adiabatica ruotando la struttura di partenza nel punto e desiderato,
imponendo poi dei "constraints" in modo che gli angoli glicosidici restino nei valori
stabiliti e minimizzando l'energia della struttura rispetto agli altri parametri
utilizzando un appropriato algoritmo di minimizzazione. Sfortunatamente questo
approccio non sempre identifica il pi basso valore di energia ("minimo assoluto") a
causa della presenza dei minimi relativi multipli ("global minimum search"). Questa
situazione il risultato della tendenza degli algoritmi di minimizzazione che porta la
struttura a permanere generalmente in un minimo locale. Ad esempio, se per andare
da una struttura a bassa energia ad un'altra ad energia inferiore necessaria una
rotazione di 120, per passare da un conformero all'altro sar necessario superare una
barriera di potenziale elevata. Sfortunatamente gli algoritmi di minimizzazione non
permettono in genere di seguire percorsi in cui l'energia aumenta; oscillando
nell'intorno del minimo locale di partenza, non permettono quindi l'esplorazione di
tutto lo spazio conformazionale accessibile.
Cercare di esplorare tutte le possibili conformazioni per un disaccaride, allo scopo di
individuare i valori di energia minima per ogni punto della mappa, porterebbe ad un
calcolo eccessivamente dispendioso, soprattutto se l'obiettivo finale la descrizione
dello stato conformazionale di un polimero. Per tali motivi, molti autori hanno
esplorato un certo numero di mappe rilassate restringendo la ricerca solo ai
conformeri pi probabili, aventi cio pi bassa energia (ricerca degli stati isomerici
rotazionali). Si visto, ad esempio, che in assenza di solvente i gruppi idrossilici
equatoriali tendono ad allinearsi nel piano costituito dall'anello dello zucchero,
puntando tutti nella stessa direzione, oraria oppure antioraria, in modo da formare
interazioni di legami idrogeno con i gruppi idrossilici vicini. Tali stati
3.Metodologie computazionali e sperimentali 28

conformazionali non sono molto probabili in solvente acquoso poich il solvente

compete nella formazione di legami idrogeno, ma questo tipo di arrangiamento stato
osservato in strutture cristalline ed in soluzione di DMSO mediante misure NMR
[8,9]. L'utilizzo di queste osservazioni riduce molto il numero di conformazioni da
minimizzare per ogni punto della mappa. Se si fa un confronto tra mappe rigide e
rilassate, si pu dire che le mappe rigide sono tutte qualitativamente simili nella
regione ad energia elevata (la forma complessiva della regione energeticamente
permessa determinata principalmente dall'assenza di forti interazioni repulsive),
mentre le mappe rilassate sono caratterizzate da barriere di potenziale relativamente
pi modeste. Ad esempio nella mappa del maltosio, le barriere tra i vari minimi
relativi possono scendere da 50 kcal/mol a 6 kcal/mol, sia perch i gruppi ossidrilici
possono ruotare, sia perch le strutture possono flettersi in modo da rimuovere le
tensioni che hanno luogo durante la transizione tra queste regioni. Questo
abbassamento delle barriere energetiche renderebbe possibili le transizioni tra i vari
minimi anche a temperatura ambiente. Sulla superficie rilassata, la regione centrale a
bassa energia, viene caratterizzata da tre minimi locali A, B e C separati da basse
barriere energetiche. La conformazione a pi bassa energia quella indicata con C
che corrisponde alla struttura cristallina del maltosio. Mentre in generale le mappe
rigide per una stessa molecola sono confrontabili tra a loro, le cose cambiano a livello
dei tre minimi ottenuti per la mappa adiabatica al cambiare del campo di forza.
Sfortunatamente le differenze di energia tra le conformazioni nei minimi A e C
ottenute con campi di forza diversi sono ancora abbastanza grandi da assumere una
importanza pratica.
Il calcolo delle propriet medie mediante meccanica molecolare dipende quindi in
modo sostanziale dai modelli utilizzati, e per questo motivo importante utilizzare le
funzioni di potenziale ed i parametri molecolari pi realistici possibili.
Vi per una ulteriore assunzione implicita nei calcoli di analisi conformazionale:
quella che le molecole adottino le conformazioni a pi bassa energia meccanica, con
una distribuzione di probabilit del tipo Boltzmaniano. Sembra ovvio che stati
conformazionali in minimi molto profondi risultino necessariamente stabilizzati
3.Metodologie computazionali e sperimentali 29

rispetto a stati conformazionali di minimi meno profondi anche se pi larghi. In

realt, dal momento che le propriet medie sono pesate dall'energia libera associata,
che include anche il contributo entropico, tale visione di massima risulta spesso
fortemente errata, in quanto non tiene in conto la molteplicit degli stati associabili ad
uno stesso minimo. Spesso le mappe di energia conformazionale di disaccaridi hanno
pi minimi locali in una stessa regione sulla superficie di energia potenziale. Se
questi minimi sono anche simili in energia, essi possono contribuire
significativamente alle propriet medie di equilibrio ed i diversi stati saranno in un
equilibrio dinamico. In altre parole, pu aversi il caso di una superficie di energia con
due conformazioni distinte definite in due buche di potenziale, una bassa in energia
ma molto stretta ed una pi larga e un po' pi alta in energia. La conformazione
corrispondente alla buca di potenziale ad energia pi alta (ma pi ampia) potrebbe
essere pi probabile poich possiede una energia libera pi bassa. In questo caso pu
risultare che propriet sperimentali (come ad esempio il parametro NOE) siano
corrispondenti anche a strutture medie non reali ma virtuali, in quanto non
corrispondono ad una singola specifica conformazione. Questo effetto anche se gi
discusso in letteratura [4] non sembra sia stato opportunamente tenuto in conto. Come
risultato pratico finale, al fine di valorizzare al meglio gli sforzi che devono essere
fatti nei calcoli di meccanica molecolare, se il campo di forza usato nel calcolare la
superficie di energia sufficientemente accurato, i valori medi sperimentali possono
essere relazionati direttamente con quelli calcolati con i metodi descritti nella
successiva sezione.

3.3 Statistica conformazionale e modello degli stati isomerici rotazionali (RIS)-

Metodo matriciale e metodo Monte Carlo

Come stato dimostrato da Flory [10] la funzione di partizione classica sufficiente

a descrivere le propriet termodinamiche di macromolecole statisticamente
disordinate (random coil). Per specificare le conformazioni interne di una
3.Metodologie computazionali e sperimentali 30

macromolecola sono richieste un gran numero di variabili. Nel caso pi schematico,

se le lunghezze e gli angoli di legame assumono valore costante, una catena lineare
costituita da n legami covalenti contiene n-2 legami interni intorno ai quali una
rotazione produce cambiamenti nella conformazione del polimero. L'espressione
della funzione di partizione Z pu essere scritta come prodotto di n-2 integrali

2 2 2
E , ,....,
Z = ....... exp 2 3 n 1
d 2 d3 .....d n1 3. 1
0 0 0
kT

Nel caso in cui le torsioni intorno al singolo legame sono indipendenti, i contributi
all'energia torsionale per ogni singola rotazione sono indipendenti tra loro. L'energia
totale pu essere approssimata alla somma delle singole componenti e Z alla
produttoria delle funzioni di partizioni per il singolo legame.
n 1
E , ,...., = Ei
2 3 n 1 3. 2
i=2

n 1
Z = zi 3. 3
i=2

Ei
2

zi = exp di 3. 4
0 kT

Pi comunemente le torsioni intorno al singolo legame sono interdipendenti. Spesso

si pu assumere che vi sia soltanto interazione tra residui direttamente legati tra loro
(interazioni tra primi vicini). In tal caso la conformazione di ogni legame
dipendente solo da quella del legame che lo precede e si ha che

n 1
E , ...., = E2 + Ei 1,i
2 3 n 1
3. 5
i =3
3.Metodologie computazionali e sperimentali 31

L'approccio degli stati isomerici rotazionali adotta un modello conformazionale

termodinamicamente equivalente in cui si utilizzano solo pochi ipotetici isomeri
discreti, detti rotameri o conformeri, i cui valori angolari sono in pratica quelli delle
conformazioni energeticamente pi favorite. Nel caso in cui la buca di potenziale non
simmetrica il valore scelto quello medio pesato tra gli stati compresi all'interno
della buca stessa. Vengono quindi scelti stati rotazionali discreti per rappresentare il
continuo dei domini nello spazio conformazionale. E' possibile quindi sostituire gli
integrali con le sommatorie con un effetto quasi sempre piccolo sulla maggior parte
delle propriet fisiche dipendenti dalle conformazioni. Allora la relazione

E , ,....,
Z = ....... exp 2 3 n 1
3. 6
32

n 1 kT

viene espressa attraverso la sommatoria di termini del tipo

E ; i
z i = exp 3. 7
kT

in cui indicizza gli stati conformazionali per il legame i. Questa approssimazione

giustificabile soprattutto nel caso in cui vengono considerati stati energetici discreti.
Ognuno degli esponenziali che compaiono nel calcolo di zi rappresenta il peso
statistico del minimo e zi la somma dei pesi statistici associati ai diversi stati
conformazionali. La probabilit di occupazione dello stato per il legame i di una
catena con stati conformazionali indipendenti data da:

E ;i
p ;i = zi1 exp 3. 8
kT
3.Metodologie computazionali e sperimentali 32

La popolazione degli stati isomerici rotazionali data solo da un peso statistico u. Il

peso statistico pu essere correlato alla funzione di stato termodinamica degli isomeri
rotazionali dalla relazione:

exp[( E E ) / kT ]
' o

u ' = '

exp[( E '' Eo ) / kT ]
3. 9

''

che rappresenta il peso statistico dello stato conformazionale ' rispetto a quello a pi
bassa energia ''. Per convenienza viene fissato lo stato a pi bassa energia '' come
stato di riferimento quindi E'' = 0 e u'' = 1. Allora la probabilit di occupazione dei
differenti stati per il legame i data rispettivamente da:

1
p '';i = 3. 10
zi
u '
p ';i = 3. 11
zi
Come esempio di applicazione si illustra il classico e semplice caso del polietilene,
assumendo che ci sia interazione soltanto tra i primi vicini (residuo tipo pentano). Gli
stati conformazionali accessibili, come noto per questo polimero, sono gli stati trans
( = 180), gauche+ ( = 60) e gauche- ( = - 60). I pesi statistici di questi stati
vengono calcolati come indicato sopra. Lo stato trans che quello a pi bassa energia
avr peso statistico 1. Gli altri due stati, ad uguale energia avranno peso statistico .
E' conveniente scrivere i pesi statistici sotto forma vettoriale e per il secondo legame
si ha:

R2 = [1 ] 3. 12
3.Metodologie computazionali e sperimentali 33

in cui il primo elemento, ad esempio, rappresenta il contributo al peso statistico del

legame 2 quando esso si trova nella conformazione trans. Allo stesso modo per uno
qualsiasi dei legami i si pu scrivere:

[
Ri = w.......t ;i w ....... g + ;i
w
....... g ;i
] 3. 13

in cui le sommatorie danno i contributi al peso statistico per una catena dal legame 2
a i nel caso in cui il legame i sia nella configurazione t, g+ e g- rispettivamente. Per
una catena di n legami

1
Z = Rn1 1 3. 14

1

Per calcolare le sommatorie presenti nel vettore Ri utile riportare tutti i contributi al
peso statistico, per il caso considerato, in una matrice 3x3. E' conveniente indicizzare
le righe e le colonne nello stesso modo del vettore riga R2. Le colonne riportano gli
stati del legame i e le righe quelli del legame i-1.
Allora

1
U i = 1 3. 15

1 i

R3 = R2U 3 3. 16

e cos via. Z potr quindi essere calcolata come:

3.Metodologie computazionali e sperimentali 34

n
Z = U 1U 2U 3 .........U n = U i 3. 17
i =1

in cui

1
U 1 = [1 0 0] U n = 1 3. 18

1

Matrici analoghe, di dimensioni dipendenti dal numero degli stati isomerici

rotazionali, possono essere definite per altri sistemi e quindi Z pu essere calcolato in
modo analogo. Da Z vengono estratte le probabilit di occupazione degli specifici
stati isomerici rotazionali. La probabilit che uno dei legami i occupi uno stato
conformazionale data da

Z ;i
p ;i = 3. 19
Z

in cui Z;i rappresenta la somma dei pesi statistici di tutte le conformazioni in cui il
legame i nello stato . Quando si considera solo l'interazione tra primi vicini la
probabilit calcolata nel seguente modo:

p ;i = Z 1U 1U 2 .....U i 1U ' ;iU i +1U n 3. 20

in cui U';i ottenuto dalla matrice U azzerando tutti gli elementi eccetto quello
indicizzato dalla riga e dalla colonna .
Il valor medio di tale probabilit su tutta la catena calcolata come:

1 n1
p = p ;i 3. 21
n 3 i =3
3.Metodologie computazionali e sperimentali 35

e nella forma matriciale:

1 0
p = [U U 0]U n3 3. 22
(n 3)Z 1 2 U n

in cui

U U '
U ;i = 3. 23
0 U i

Le probabilit cos ottenute, attraverso un calcolo detto "matriciale", potrebbero

anche essere calcolate mediante simulazione numerica dalle mappe conformazionali
di segmenti che costituiscono la catena polimerica o da traiettorie di dinamica
molecolare. Il calcolo delle dimensioni di un polimero in base alle informazioni
geometriche ed energetiche viene effettuato in genere attraverso due metodologie di
calcolo, quella matriciale o quella del Monte Carlo. Il primo un metodo analitico e
viene spesso definito "esatto" in quanto non vengono effettuate approssimazioni
matematiche, il secondo metodo basato sulla simulazione numerica e permette di
ottenere oltre alle funzioni di distribuzione delle propriet conformazionali delle
macromolecole anche rappresentazioni pittoriche delle catene generate.

3.3.1 Calcolo delle dimensioni medie imperturbate - metodo matriciale

Viene descritta qui, in modo essenziale, la procedura che calcola le dimensioni medie
<r>o ed <r2>o con il metodo matriciale. Per una catena polimerica formata da n
legami, il vettore testa-coda dato dalla somma dei vettori associati (reali o virtuali)
agli n legami.
r
r = li 3. 24
i
3.Metodologie computazionali e sperimentali 36

in cui li il vettore definito nel sistema di riferimento in cui l'asse x diretto lungo il
legame, l'asse y si trova nel piano contenente i legami i e i-1 e z si trova nel piano
perpendicolare ad esso a completare la terna destrorsa. Per operare la sommatoria pi
facilmente conveniente riportare tutti i vettori nello stesso sistema di riferimento del
legame l1 per mezzo delle matrici di trasformazione. Scriveremo quindi il vettore
testa-coda come:

r r r r r n i 1 r
r = l1 + T1l2 + T1T2l3 + ........ + T1T2 ...Tn1ln = T j li 3. 25
i =1 j = 0

che pu essere espresso anche come prodotto di matrici

r n
r = Ai 3. 26
i =1

in cui le matrici Ai hanno la seguente forma:

r
T l
Ai = 1< i < n 3. 27
0 l i
e
r
ln
A1 = T1 [ r
l1 ] An = 3. 28
1

Per il calcolo della distanza quadratica testa-coda si procede in modo analogo, quindi

n r
( )( )
n r n 1 n rr n r
r 2 = r r = li li = 2 l k l j + l k 2
i =1 i =1 k =1 j = k +1 k =1
3. 29

rT
n 1 n r n r2
r = 2 lk Tk Tk +1 ......T j 1l j + lk
2
3. 30
k =1 j = k +1 k =1
3.Metodologie computazionali e sperimentali 37

che pu essere scritto nella forma matriciale compatta

r 2 = G1G2G3 ......Gn1Gn 3. 31

in cui

rT
1 2l T l2
r
Gi = 0 T l 1< i < n 3. 32
0 0 1
i
e

ln
2

[ r
G1 = 1 2l1 T T l1
2
]
Gn = ln

r
3. 33

1
Come facile comprendere, il vettore testa-coda per una catena polimerica dipende
dagli angoli torsionali intorno ai legami che la compongono.

r r r r r
r = l1 + T1 l2 + T1T2 l3 + ....... + T1T2 .......Tn1 ln 3. 34

La media del prodotto di una serie di matrici di trasformazione non esprimibile

mediante il prodotto delle matrici medie, in particolar modo quando le singole
conformazioni sono interdipendenti tra loro. E' utile quindi introdurre termini di
probabilit nel calcolo matriciale. Scriveremo quindi

r 1
r = (A( 1A2.An) 3. 35
Z

In cui le matrici Ai sono calcolate combinando gli elementi delle matrici Ai sono con
gli elementi delle matrici Ui. Come esempio vengono riportate le matrici per il
polietilene.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 38

At Ag + Ag


Ai = At Ag + Ag
1< i < n 3. 36
At Ag Ag
+
i

An
A1 = [ A1 0 0] An = An 3. 37

An

Mediante la stesso procedimento si calcola la distanza testa-coda quadratica media.

r 1 (
r 2 = (G 1G2.Gn)
3. 38
Z
in cui le matrici Gi sono state ottenute in modo analogo alle matrici Ai. Dal valore
della distanza testa-coda quadratica media si calcola il rapporto caratteristico
dipendente dal grado di polimerizzazione

1
Cn = ((GG11G
G22.G n)n )
.......G 3. 39
nl Z
2

ed il valore estrapolato a grado di polimerizzazione infinito viene stimato nel

seguente modo:

C = 2Cn Cn1 3. 40
3.Metodologie computazionali e sperimentali 39

3.3.2 Calcolo delle dimensioni medie imperturbate - metodo Monte Carlo.

Mediante il metodo detto "Monte Carlo" si simula un processo stocastico, associando

a vari stadi che si susseguono nel processo delle probabilit a priori. Il processo
stocastico implica una casualit degli eventi all'interno di una definizione fissa del
sistema macroscopico. Per ottenere un sistema definito in tal modo vengono generati
dei numeri casuali (random) a cui sono associati gli eventi (stati microscopici) con
probabilit assegnate a priori ai vari possibili eventi. In generale, viene generata una
serie di N numeri random che determina la sequenza di stati conformazionali
(random ma definiti all'interno di una appropriata statistica) di una catena polimerica.
Nel campione complessivo della popolazione di tutte le catene, ognuna delle
conformazioni risulta pesata mediante l'opportuno fattore probabilistico di
Boltzmann.

exp[ Ei / kT ]
pi = 3. 41
exp[ Ek / kT ]
M

k =1

il denominatore la funzione di partizione del sistema costituito da M stati energetici

discreti Ek e pi tale da soddisfare la condizione:
Un insieme di numeri random generato da appropriati algoritmi inseriti oramai in
tutti i linguaggi di programmazione [11] L'insieme costituito da numeri compresi
M
3. 43
p =1
k =1
i

nell'intervallo [0,1]. Ci sono anche altri generatori di numeri random legati alla
fluttuazione stocastica di qualche fenomeno fisico. L'algoritmo matematico si basa su
formule iterative del tipo:

xi = ( N1 xi 1 + N 2 ) mod[( N1 xi 1 + N 2 ), N ] 3. 42
3.Metodologie computazionali e sperimentali 40

( N x + N2 )
mod[( N1 xi1 + N2 ), N ] = ( N1 xi1 + N2 ) N int 1 i1 3. 44
N

0 N1 , N 2 < N 3. 45

dove N1, N2 ed N sono numeri interi ed int[...] la parte intera del rapporto espresso
in parentesi. A partire da numeri interi qualsiasi x0, N1, N2 ed N si genera il numero
necessario di numeri random. Ad esempio per x0=4, N1=5, N2=3 ed N=8 si ottiene la
seguente serie di numeri:

{4, 7, 6, 1, 0, 3, 2, 5, 4, 7, 6, 1,..........}

che si ripete ciclicamente dopo 8 numeri. La periodicit caratteristica delle sequenze

dei numeri pseudo-random ed in genere uguale ad N. Con N molto grande, la
lunghezza del ciclo diventa pi lunga della dimensione dell'insieme di numeri
random che viene spesso usata nella maggioranza delle simulazioni Monte Carlo. I
computer attuali lavorano con microprocessori a m=32 o 64 bit cosicch il numero
intero maggiore che possono rappresentare 2m-1 (rispettivamente 2.15109 e
9.221018) sufficientemente grandi da dare una effettiva casualit alla serie. I due
requisiti che deve avere un campione di numeri random sono:
1) uniformit: gli n numeri random devono essere uniformemente distribuiti
nell'intervallo [0,1] e tale propriet viene stimata attraverso la misura della
frequenza su piccoli intervalli o attraverso i momenti della distribuzione,

1 n
m1 = xi = 0.500
n i =1
1 n
m2 = xi2 = 0.333 3. 46
n i =1
1 n
m3 = xi3 = 0.250
n i =1
3.Metodologie computazionali e sperimentali 41

Ci sono molti altri tests di uniformit, tra i quali ricordiamo quello che analizza le
frequenze dei numeri in intervalli regolari x dellintervallo [0,1]. Dividendo, per
esempio, [0,1] in 10 intervalli pi piccoli, si va a contare i numeri random che
cascano in ciascuno di questi e si valutano le frequenze, fi , numero di xi per ogni
intervallo:
j ( j + 1)
fi di xi : xi con j = 0, 1, 2,....9
10 10
e questa frequenza deve essere costante su tutti gli intervalli per n sufficientemente
grande (the Strong Law of Large Numbers).

2) assenza di correlazione: un test molto semplice di correlazione dei numeri della

serie quello di analizzare coppie (xi , xi+1) e terne (xi , xi+1 , xi+2) nell'insieme di
numeri random e vedere con quale frequenza si distribuiscono, rispettivamente, nel
piano e nello spazio. Per un insieme non-correlato i punti devono risultare
uniformemente distribuiti.
Una delle successioni di numeri random che si generano rappresenta uno dei
microsistemi dellinsieme. Ad ogni numero, come abbiamo gi detto, corrisponde una
probabilit di tipo Boltzmanniano conosciuta a priori. Vediamo lesempio della
molecola di 3-cloro-2-butanolo
H
HO CH 3

H 3C Cl
H
4.9 0.7

4.2 0.6

3.5 0.5

2.8 0.4
probabilit
Energia

2.1 0.3

1.4 0.2

0.7 0.1

0.0 0.0
0 60 120 180 240 300 360
angolo di rotazione
3.Metodologie computazionali e sperimentali 42

E2 E0 E1
CH3 CH3 CH3
H3C Cl Cl CH3

OH OH OH

CH3 Cl

E0, E1 ed E2 sono le energie dei tre conformeri trans (minimi di energia assoluto e
relativi) e assumiamo a titolo di esempio che queste siano uguali rispettivamente a 0,

0.5 e 1.5 Kcalmole-1 e che siano gli unici tre stati accessibili e rappresentativi della
configurazione della molecola (modello degli Stati Isomerici Rotazionali, RIS).
Calcolando le probabilit relative associate a questi stati (a 25C) si ottiene
P0 = 0.68
P1 = 0.25
P2 = 0.07 .
Queste probabilit normalizzate vengono utilizzate per costruire un campione Monte
Carlo di N conformazioni che diano, attraverso lanalisi statistica, le propriet
configurazionali del sistema. Per un dato numero di molecole, N, volume V e
temperatura T, se si generano N numeri random xi, distribuiti uniformemente
nellintervallo [0, 1], gli stati conformazionali Ei vengono estratti a sorte nel senso
che:
- la molecola adotterr la conformazione E0 se 0 x i P0 ;
- la molecola adotterr la conformazione E1 se P0 xi P0+ P1;
- la molecola adotterr la conformazione E2 se P0+ P1 xi P0+ P1 +
P2 =1
3.Metodologie computazionali e sperimentali 43

E chiaro che i numeri random cadranno con maggiore frequenza in quella parte del
segmento [0, 1] pi ampia.
xi

0 0.5 1
P1 P2 P3

In relazione alle probabilit degli stati isomerici, pertanto, sulle medie peseranno di
pi quelle conformazioni ad energia pi bassa.
Quando si simula lo stato disordinato di un polimero di grado di polimerizzazione n,
in soluzione o nel fuso, si devono generare n numeri random per catena; se il
campione di macromolecole formato da m catene, il campione di numeri random
conster di N=mn numeri. Si costruisce la sequenza di legami (reali o virtuali) in
catena confrontando le successioni di numeri random con le probabilit dei vari stati
isomerici che la unit rappresentativa del polimero pu assumere.
Se, ad esempio, si volesse studiare la topologia di catene di poli(3-cloro-2-idrossi-
etilene):
OH OH

Cl Cl Cl

lunit rappresentativa del polimero (in parentesi) potrebbe essere con buonissima
approssimazione proprio la molecola di 3-cloro-2-butanolo vista sopra, cosicch la
descrizione della conformazione del polimero potrebbe essere fatta
nellapprossimazione dellindipendenza degli stati.
La procedura del Monte Carlo dovrebbe produrre, teoricamente, un insieme di catene
infinito, in pratica viene generato un numero molto grande ma finito di catene
sufficientemente rappresentativo del sistema in esame.
Per ogni catena generata si calcolano le caratteristiche macromolecolari quali le
distanze testa coda, i rapporti caratteristici (Cn= r2/n<l>2), le lunghezze di persistenza
3.Metodologie computazionali e sperimentali 44

1 N
p = pi 3. 44
N i =1

(rl1) e le funzioni di correlazioni (l1ln/l1ln). Risulta chiaro, a questo punto, che noti i
valori di queste propriet per ogni singola catena generata, possibile calcolare le
funzioni di distribuzioni delle propriet stesse sull'intero campione. I valori medi
vengono calcolati come medie aritmetiche sul numero di catene in cui p la propriet
calcolata ed N il numero di catene

3.3.3 Calcolo delle dimensioni medie imperturbate per copolimeri

Anche se da un punto di vista formale il calcolo delle dimensioni imperturbate pu

essere esteso a copolimeri senza eccessive complicazioni, tuttavia necessario
ricordare che la definizione stessa di rapporto caratteristico scalata sulla dimensione
del vettore rappresentativo dell'unit monomerica e che quindi nel caso di copolimeri
occorre riformulare la definizione. Tanto pi ci necessario nel caso in cui si usano
approcci di calcolo diverso, come in questa tesi, in cui l'algoritmo opera attraverso un
valore medio "iniziale", che chiameremo l*, inserito nel calcolo della matrice di
trasformazione (metodo matriciale) oppure utilizza i valori reali dei legami per
costruire la popolazione di catene per poi effettuare su queste la media (metodo
Monte Carlo). Una complicazione a parte, che esamineremo successivamente,
costituita dal caso in cui il copolimero di tipo statistico a composizione variabile dei
due co-monomeri.
La definizione di rapporto caratteristico fornisce la corretta interpretazione delle
grandezze implicate nel calcolo, essendo:

1
Cn = Cn =<r2> / n l2 3. 45
nl Z
2
3.Metodologie computazionali e sperimentali 45

Una catena con rotazioni liberamente snodate (FJC) a grado di polimerizzazione

infinito definita da C = 1, cio l2 = <r2>/n. Ne consegue pertanto che la
definizione di l* per un copolimero fornita direttamente dall'espressione riportata.
Nel caso di un copolimero alternato con lunghezze di legame (anche se virtuali) l1 ed
l2 si ha ovviamente che (l*)2 = (l12 + l22)/2. Tale pu essere il caso di un polisaccaride
di tipo (AB)n come l'acido ialuronico.
La situazione pu essere apparentemente pi complicata nel caso in cui si usano
codici che non ammettono variazioni immediate delle procedure di definizione dei
parametri. E' questo il caso della procedura V2_RIS che, nella generalizzazione da
noi utilizzata, considera di fatto come copolimero una struttura glicosidica anche non
copolimerica costituita ad esempio da sequenze di legami virtuali rigidi (il legame
virtuale C4-C1) e legami reali intorno a cui avvengono le rotazioni (i legami O4-C4 e
C1-O4). Un polisaccaride con tale concatenamento (ad esempio amilosio)
assimilato ad un copolimero con l1 = 1.42 , l2 = 2.87 e l3 = 1.39 , con un valore
di (l*)2 = 12.18 , invece di 18.06 (corrispondente al quadrato di 4.25 ). Inoltre il
grado di polimerizzazione "apparente" per il copolimero sarebbe sempre tre volte
maggiore (ci facile da tenere in conto), ma per valori bassi di n il valore delle
distanze testa-coda soffre della limitazione dovuta al calcolo su un numero piccolo di
valori "discreti" e "differenti" delle lunghezze di legame l1, l2 e l3, che fornisce ad
esempio per n = 2 rispettivamente i valori di 3.0087, 3.1543 e 2.6872 per il rapporto
Cn. Sottolineamo che, lungi dal rappresentare un errore di calcolo, tale differenza
dovuta alla differenza di notazione, come illustrato nella figura 3.1.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 46

Figura 3.1 Modello convenzionale: due residui glicosidici, due legami virtuali, due angoli di torsione
Modello 1 (nero): come sopra, ma vengono definiti tre legami per ogni residuo.
Modello 2 (rosso): tre legami per ogni residuo, ma anche tre angoli di torsione
Modello 3 (blu): tre legami per ogni residuo, ma anche tre angoli di torsione

3.4 Dinamica Molecolare.

Calcoli di dinamica molecolare sono diventati di routine per proteine ed acidi nucleici
e negli ultimi tempi sono diventati sempre pi comuni per i carboidrati [12,13,14,15].
Le simulazioni di dinamica hanno il vantaggio di permettere lo studio delle
evoluzioni nel tempo del sistema, incluse le fluttuazioni e le diffusioni ed il calcolo
delle velocit. E' diventato abbastanza comune per le simulazioni di dinamica
molecolare essere applicate in congiunzione con studi NMR per aiutare a
razionalizzare i risultati sperimentali [16,17,18,19].
Un importante aspetto delle nuove funzioni di potenziale che rappresentano
l'energia molecolare in funzione delle coordinate atomiche, da cui si possono
calcolare le derivate. La forza atomica agente su ogni atomo pu essere calcolata
come:

Fi = i V (q ) 3. 46
3.Metodologie computazionali e sperimentali 47

Dove V(q) ancora l'energia potenziale in funzione delle coordinate atomiche q.

Nota la forza l'equazione di Newton pu essere integrata per ricavare le traiettorie

Fi = mi ai 3. 47

seguite da ogni atomo nel tempo partendo da una particolare geometria e da una
velocit iniziale. Implicito in questo approccio l'assunzione che i moti atomici
possano essere trattati per mezzo di leggi classiche che governano il moto di corpi
macroscopici. In principio questi moti sono governati dalla equazione di Schrdinger
dipendente dal tempo. In pratica gli effetti dinamici quantistici sono importanti per
particelle molto piccole, come gli elettroni, i protoni e gli atomi di idrogeno ed elio.
Cos molto del comportamento quantistico di sistemi biologici tipici contenuto nella
funzione di energia empirica che implicitamente invocano l'approssimazione di Born
Oppenheimer secondo la quale il moto degli elettroni sono cos veloci rispetto a
quelli dei nuclei che essi vengono trattati come separabili. Con questa
approssimazione l'unico comportamento quantistico significativo in una tipica
molecola biologica verrebbe esibito dagli atomi di idrogeno, i cui moti devono cos
essere considerati come approssimati in queste simulazioni.
In base a quanto appena detto l'equazione del moto degli atomi pi essere scritta nella
forma seguente:

d 2 ri (t ) Fi
= 3. 48
dt 2 mi
Mentre non ci sono soluzioni analitiche delle equazioni del moto, per sistemi classici
di tre o pi particelle, esistono vari schemi di integrazioni numeriche che possono
propagare queste equazioni del moto nel tempo, ad ogni grado di accuratezza
richiesto, spesso discretizzando il tempo in piccoli steps di solito dell'ordine di 1fs
(10-15s).
Uno degli algoritmi pi utilizzato, ed anche quello utilizzato per il calcoli MD
descritti in questa tesi, l'algoritmo Verlet [20]. Questo algoritmo sfrutta le posizioni
e le accelerazioni al tempo t, e le posizioni dallo step precedente, r(t - t), per
3.Metodologie computazionali e sperimentali 48

calcolare le nuove posizioni al tempo t + t, r(t + t). Espandendo in serie di Taylor

la posizione degli atomi nel tempo si pu scrivere la relazione che lega le posizioni e
le velocit al tempo t + t:

r(t + t) = r(t) + tv(t) +1/2 t2a(t) + ...........

3. 49
r(t - t) = r(t) - tv(t) +1/2 t2a(t) - ...........

la somma di queste due equazioni da:

r(t + t) = 2r(t) - r(t - t) + t2a(t) 3. 50

Le velocit non appaiono esplicitamente ma possono essere calcolate in una grande

variet di modi. Un semplice approccio quello di dividere le differenze tra le
posizioni al tempo t + t e t - t per 2t ottenendo:

v(t) = [r(t + t) - r(t - t)] /2 t 3. 51

Sono state sviluppate una serie di variazioni a questo algoritmo per aumentare
l'accuratezza delle soluzioni dell'equazione del moto, qui per non ne verr data una
descrizione perch lo scopo di illustrare le metodologie utilizzate in questa tesi non lo
richiede. Ci che lega le propriet fisiche del sistema studiato alle traiettorie e alle
velocit degli atomi di cui costituito, campionate in un intervallo di tempo
sufficientemente lungo, si basa sul teorema ergodico. L'ipotesi ergodica garantisce
che dato un periodo di tempo abbastanza lungo, un sistema arriver arbitrariamente in
ogni punto dello spazio delle fasi, ed il tempo speso in ogni regione particolare dello
spazio delle fasi sar governata dalla distribuzione di Boltzman. Tutte le propriet
fisiche osservabili possono cos essere calcolate prendendo il tempo medio
3.Metodologie computazionali e sperimentali 49

appropriato sulle traiettorie seguite dagli atomi di un sistema. La temperatura del

sistema, ad esempio, calcolata dalle traiettorie medie della energia cinetica di tutti
gli atomi.

1 3
mi vi2 = Nk BT 3. 52
2 2

In cui vi la velocit dell'atomo i, N il numero di gradi di libert e le parentesi

indicano la media su tutti gli 'snapshots' dalla integrazione numerica della traiettoria.
La tipica simulazione di dinamica molecolare costituita dai seguenti stadi:
La struttura molecolare di partenza deve essere definita inizialmente per determinare i
valori delle coordinate interne della molecole, l'energia totale in funzione delle
coordinate cartesiane calcolata dai termini individuali presenti nell'equazione del
potenziale. Questa struttura iniziale viene solitamente determinata sperimentalmente,
si opera una minimizzazione dell'energia per rilassare la struttura prima della
simulazione vera e propria, per eliminare sovrapposizioni steriche. Se questa prima
operazione non viene fatta, l'eccesso di forze repulsive potrebbe portare a grandi
distorsioni durante i primi step della simulazione. La struttura minimizzata
rappresenta la molecola ad una temperatura vicina allo zero assoluto. Il riscaldamento
alla temperatura appropriata avviene assegnando prima le velocit in modo random in
accordo alla distribuzione Gaussiana appropriata alla temperatura di partenza, la
simulazione inizia e la temperatura viene gradualmente aumentata assegnando
velocit random maggiori ad ogni atomo a intervalli di tempo predeterminati. Lo
stadio successivo prevede l'equilibrazione, che viene raggiunta permettendo al
sistema di evolvere spontaneamente per un periodo di tempo ed integrando
l'equazione del moto fino a che la struttura media e la temperatura restano stabili. Ci
facilitato riassegnando periodicamente le velocit appropriate alle temperature
desiderate. In genere la procedura va avanti fino a che varie propriet statistiche del
sistema diventano indipendenti dal tempo. Quando il sistema ha raggiunto l'equilibrio
3.Metodologie computazionali e sperimentali 50

inizia la simulazione vera e propria. Durante il corso delle simulazioni di dinamica gli
atomi si muovono e quindi la lista delle interazioni di non legame deve essere
rigenerata e la frequenza con cui viene fatto dipende dalla natura del sistema. Le
simulazioni di dinamica molecolare generano traiettorie che consistono di set di
fotogrammi di coordinate e velocit che rappresentano le traiettorie degli atomi nel
tempo. Dai dati delle traiettorie si possono calcolare le strutture medie molecolari ed
analizzare le fluttuazioni dei parametri geometrici, delle propriet termodinamiche e
di processi dipendenti dal tempo.
Dalle traiettorie cos ottenute possono essere estratte le propriet dell'intero sistema o
di alcune delle sue componenti. In particolare vengono generate le variazioni nel
tempo di posizioni atomiche o di segmenti atomici e tali variazioni possono essere
integrate per ottenere le funzioni di correlazione. Dalle funzioni di correlazione
possono calcolare delle quantit ottenibili anche sperimentalmente, ad esempio i
tempi di rilassamento NMR sono una delle propriet maggiormente calcolate da
simulazioni MD.

3.5 Teoria diffusiva per il calcolo dei tempi di rilassamento 'spin lattice' T1.

Il confronto tra le propriet conformazionali tempo-dipendenti, ottenute da calcolo o

da esperimenti, richiede dal punto di vista teorico un formalismo in grado di utilizzare
sia gli aspetti diffusivi (dinamica) che gli aspetti conformazionali (pesi statistici).
Vari approcci sono stati descritti in letteratura per calcolare parametri dinamici di
sistemi molecolari e macromolecolari. Tra questi vanno certamente citati il "Model
Free Approach" proposto da Lipari e Szabo [21,22] e tutte le altre schematiche
versioni che trattano la dinamica locale attraverso l'oscillazione del legame CH
all'interno di un cono di ampiezza opportuna ("woobling in the cone"). Nessuno di
questi metodi ha mai dato risultati soddisfacenti e l'utilizzo di modellizzazioni o di
approssimazioni spinte ha portato soprattutto nel caso di carboidrati a risultati
3.Metodologie computazionali e sperimentali 51

quantitativamente modesti. Una review sui vari metodi e in particolare sulle

applicazioni a polisaccaridi illustra i limiti dei diversi approcci [23].
Nel Lab. di Chimica delle Macromolecole, in collaborazione con il CNR di Genova,
da alcuni anni in corso un programma di ricerca sullo sviluppo ed applicazione a
polisaccaridi di teorie diffusive (del tipo ORZLD e "Mode-coupling") con lo scopo di
elaborare strategie di calcolo in grado di riprodurre in maniera soddisfacente
parametri dinamici (es. T1) da oligomeri a polimeri con diverse caratteristiche
conformazionali-topologiche.
La teoria diffusiva applicata a soluzioni diluite di macromolecole, tratta il solvente
idrodinamicamente ed adotta modelli molecolari dettagliati per il soluto polimerico in
termini di perle (atomi o gruppi atomici) connessi da legami reali o virtuali che
diffondono in un potenziale atomistico. [24,25]. Nella rappresentazione delle matrici
di correlazione dell'equazione diffusiva (sia per il metodo ORZLD ad
approssimazione zero, che per il metodo "mode-coupling") il potenziale non ha un
ruolo particolare, ma contenuto nella media statistica necessaria alla teoria. [26]. Le
perle sono rappresentate come punti nelle posizioni r, caratterizzate dal loro
coefficente frizionale i = 6ai in cui la viscosit del solvente (0.001 Pa s per
l'acqua a 300 K ). I raggi di Stokes ai sono stati calcolati usando il metodo dell'area
superficiale accessibile sommando le superfici di ogni gruppo costituente come
riportato in letteratura. [27]. Per le molecole relativamente piccole che si stanno
considerando, ogni gruppo idrossile, ogni gruppo C-H ed il gruppo idrossimetilenico,
sono trattati come una singola perla. Gli atomi di ossigeno O5 e O1 sono trattati come
una singola perla in modo da includere nel modello diffusivo la correlazione tra i
legami nell'anello piranosidico e i legami che connettono due monomeri. In questo
paragrafo verr dato solo un riassunto del metodo utilizzato, la trattazione completa
reperibile altrove [28,29]. Dato un numero di legami di coefficiente frizionale i e
coordinate r, i = 1,........, Na, connessi da Nb legami (li, i = 1,.........., Nb), la dinamica
della macromolecola descritta dalla variabile li, governata dall'operatore L, correlato
all'operatore diffusivo di Smoluchowski D.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 52

l
= Ll 3. 53
t
L = [ i Di , j j ( iU / k BT ) Di , j j ]
Na
3. 54
i , j =1

in cui l il vettore con dimensioni 3Nb contenente tutti i legami, D il tensore

diffusivo, U l'energia potenziale della perla, kB la costante di Boltzmann e T la
temperatura. E' da sottolineare che una soluzione esatta dell'equazione di
Smoluchowski possibile solo per sistemi rigidi a geometria gemplice.
Dall'espansione in serie delle probabilit condizionali (che sono le soluzioni
dell'equazione di Smoluchowski) in un set completo di autofunzioni di L, la funzione
di correlazione nel tempo di tutte le variabili dinamiche dipendenti dalle coordinate
con una media nulla f(t), pu essere espressa nella seguente forma:

M
i = Cm ,i m 3. 55
m =1

f (t ) f (0) = f i i f exp( i t ) 3. 56
i

dove i e i sono gli autovalori e le autofunzioni normalizzate dell'operatore L.

Rappresentando i come un set di funzioni di base = { m, m=1, ......, M}
L'equazione agli autovalori pu essre scritta nella forma matriciale

FC = SC 3. 57

in cui la matrice diagonale con gli autovalori m sulla diagonale, C la matrice

degli autovettori dei coefficenti Ci,m, S la matrice

S ij = i j 3. 58
ed F la matrice delle forze di equilibrio

Fij = i L j = ( mi ) Dmn ( ni )
Na
3. 59
m , n =1
3.Metodologie computazionali e sperimentali 53

in cui Dij = Di Hij

Hij = 1ij + iTij (1 - ij)

Tij = (8rij)-1 [1 + rij rij/rij2]

in cui H e T rappresentano la matrice di interazione idrodinamica ed il tensore di

Oseen.

Di = kBT/i

il coefficiente di diffusione per ogni perla ed la viscosit del solvente. Il fattore

rappresenta l'interazione idrodinamica ed un parametro i cui valori sono ristretti
ad intervalli <1.0 tanto da mantenere positivo H mentre un = 1.0 corrisponde a
tutte le forze di interazione correlati alla scelta specifica dei coefficienti di frizione.
Poich

a b = Peq (r )a (r )b(r )dr 3. 60

in cui Peq (r) la funzione di distribuzione di equilibrio dipendente dall'energia

potenziale U. In seguito la media statistica all'equilibrio sar calcolata dalla media nel
tempo lungo le traiettorie MD per l'intero modello atomistico delle molecole date.
Poich le autofunzioni i sono ortonormalizzate, le matrici dei coefficienti C devono
soddisfare l'equazione di normalizzazione

CTSC = 1 3. 61
3.Metodologie computazionali e sperimentali 54

Approssimazioni accurate per la valutazione dei valori delle funzioni di correlazione

si ottengono prendendo le funzioni di base in set di base costruiti con potenza
crescente delle variabili, vettori di legame o loro combinazioni lineari [28,29]. Set di
base di primo e secondo ordine che devono essere prese nella loro forma tensoriale
irriducibile, sono quindi per funzioni di rango due bilineari e tetralineari
rispettivamente, nelle variabili di legame. La relazione tra la velocit di decadimento
della magnetizzazione NMR, sperimentalmente misurata e le funzioni di correlazione
nel tempo sono date da [30,31].

J (0)

R(C z ) 0 d 3d + c 0 6d J ( I S )

6d + 2c d 3d + c
R(C xy ) = 3d 3d J ( S )
3. 62
R(H C ) 3 2 2
z 0 d 0 0 6d J ( I )
J ( + )
I S

dove

1
c= ( S )2 3. 63
15
e

2
1 h 1
d = S I 2

3. 64
20 4 0 c rSI
6

in cui S e I si riferiscono a spin diversi, in questo caso 13C e 1H rispettivamente, il

rapporto giromagnetico, rSI la distanza carbonio protone e d l'anisotropia del
chemical Shift (adimensionale) del nucleo di carbonio considerato (- 40ppm per tutti i
legami CH negli oligomeri considerati). La densit spettrale J() la trasformata di
Fourier della funzione di correlazione nel tempo. Nel caso in cui i due nuclei sono
legati da un legame covalente che sottoposto a moti di stretching allora la media di
3.Metodologie computazionali e sperimentali 55

1/r6 nell'equazione viene estratta dalle traiettorie MD. Le tre velocit di rilassamento
magnetico nucleare riportate nell'equazione (3.65) tratta di tre differenti componenti
di magnetizzazione. I dati NMR che saranno confrontati con i calcoli sono R(Cz)
ottenibili per quasi tutti gli atomi di C in una molecola di zucchero.
In fine

J ( ) = 2 cos(t )TCF (t )dt 3. 65

0

sono le densit spettrali richieste per calcolare le velocit dell'eq(3.65) e le funzioni di

autocorrelazioni nel tempo sono della forma

TCF (t ) = [DM( 2,)0* ((t ))][DM( 2,)0 ((0 ))] = P2 (cos( (t )))
2
3. 66
M = 2

in cui DM,0(2) sono i tensori sferici irriducibili [32], l'orientazione di un dato vettore
C-H, P2 il polinomio di Legendre di ordine 2 e l'angolo che il vettore C-H copre
nel tempo t.
Data l'equazione che correla i parametri R(Cz) ottenuti sperimentalmente alla
funzione di correlazione di rango 2, che descrive il rilassamento dei vettori C-H
possiamo introdurre la descrizione molecolare di questi rilassamenti.
Poich f dellequazione(3.59) la funzione sferica irriducibile di rango 2 di un
vettore molecolare, la proiezione f m sugli elementi della base m sono non nulli
se e solo se m una funzione di rango 2. Come conseguenza gli elementi delle
matrici S ed F sono le medie dei prodotti di tensori sferici irriducibili di rango 2. Le
valutazioni di questi elementi sono fatte semplicemente calcolando le componenti
scalari (invarianti rotazionali) contenute nei prodotti delle funzioni di secondo rango
negli elementi delle matrici [29].
Insomma dalle traiettorie MD si calcolano le invarianti rotazionali degli elementi
delle matrici S ed F (eq 3.61 e 3.62) e delle proiezioni f m, si risolve l'equazione
matriciale 4 e dalle equazioni 2 e 3 si calcolano le funzioni di autocorrelazione del
3.Metodologie computazionali e sperimentali 56

tempo, una per ogni legame C-H monitorato. Le funzioni di autocorrelazione di rango
2 cos calcolate possono essere sottoposte alla trasformata di Fourier per calcolare le
densit spettrali ( Eq 3.68 ). Per trovare i set di base da utilizzare nel calcolo accurato
delle funzioni di correlazione dei tensori nel tempo [29]. Il primo passo consiste nel
risolvere l'equazione diffusiva con una base che lineare nei legami per dare le
dinamiche del primo ordine per una funzione vettoriale.

{li,x} i = 1, ....., Nb

La soluzione di primo ordine ottenuta dalla diagonalizzazione dell'equazione 3.60, da

Nb
mi , x = C j ,i l j , x
j =1

le autofunzioni vettoriali del primo ordine mi,x

Per strutture quasi rigide, ignorare i modi ad alta velocit vuol dire trascurare
contributi molto piccoli per le funzioni di correlazione nel tempo che corrisponde a
termini di decadimento esponenziale veloci correlati a questi modi. Questo evidente
per il primo ordine ma ancora valido per ordini superiori dovuti agli effetti
combinati dei prodotti di termini con rapido decadimento esponenziale. Si pu quindi
selezionare un set di base ridotta generalmente composta da e modi a pi bassa
velocit, con e uguale alla dimensionalit d dello spazio di valore molto pi basso
rispetto a Nb. Per funzioni di rango 2, un set di base di II ordine ridotto pu essere
generato nella propria forma tensoriale irriducibile. Una volta che sono stati scelti i
modi vettoriali di I ordine, questo set di base di II ordine contiene e(e+1)/2 secondo
ed [e(e+1)/2]2 quarto potenziale dei modi. Queste basi danno una buona
approssimazione alle dinamiche di strutture fluttuanti purch vengano considerate al
limite rigido le dinamiche rotazionali esatte.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 57

3.6 Metodologie

3.6.1 Metodologie sperimentali e Strumenti

Sono state fatte delle misure sperimentali di NMR su oligomeri e polimeri del
pullulano, destrano e amilosio. Sono stati inoltre misurati i tempi di rilassamento 'spin
lattice' su un trimero del pullulano -glc-(1->4)--glc--(1->6)--glc sintetizzato da
un altro gruppo di ricerca per sintesi enzimatica [33].
13
Gli spettri NMR C con disaccopiamento protonico sono stati registrati a
temperatura ambiente con uno spettrometro Varian AS 500 (11.7T) che opera a 126.6
MHz. La concentrazione del campione era di 20 mg/mL in deuterio posta in un tubo
di vetro di 5mm di diametro. Lo spettro stato registrato con una risoluzione digitale
di 1.0Hz con tempi di acquisizione di 0.8 s.
13
Gli esperimenti NMR C su stato solido, sono stati fatti a 75.5 MHz con uno
spettrometro Bruker Avance 3000 che opera ad un campo statico di 7.04 T ed
equipaggiato con doppie sonde MAS entrambe di 4mm. La testa MAS della sonda
Bruker stata usata con un rotore di ZrO2 ruotante alla velocit standard di 12.5 kHz.
La frequenza degli impulsi a 90 per il protone e di 2.9 s (86kHz).Gli esperimenti
Single Pulse Excitation(SPE), sono stati eseguiti con un 'recycle delay' di 10 s ed un
tempo di contatto di 2.5 ms. Gli spettri Phase-Modulated Lee-Goldburg (PLMG) a
correlazione eteronuclearim (1H-13C) (HETCOR) sono stati fatti con un periodo LG
di 18.9 s.
E' stato utilizzato un campione commerciale di maltosio (4-O-a- D-Glucopiranosil -
D glucose) monoidrato prodotto dalla SIGMA su cui stato registrato lo spettro
NMR il composto stato successivamente vetrificato per riscaldamento e
raffreddamento veloce. Su questo campione stato registrato un secondo spettro. Per
gli spettri sui polimeri sono stati utilizzati, per il destrano un campione commerciale
Fluka avente peso molecolare Mw = 222000, per il pullulano un campione
commerciale della SIGMA e per l'amilosio un campione comerciale di Dextrin della
SIGMA.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 58

3.6.2 Metodologie di calcolo e codici.

I calcoli effettuati in questo lavoro sono stati eseguiti per mezzo di differenti codici.
La scelta dei quali stata determinata sia dal tipo di calcolo che si andava ad eseguire
che dalla effettiva disponibilit dei codici.
Le mappe conformazionali rigide dei dimeri sono state calcolate con CHARMm, e
con SACCARLAT.f. La dinamica molecolare di oligomeri del pullulano stata
calcolata con CHARMm. La statistica conformazionale stata calcolata per mezzo
dei codici ENERGY.f e V2_RIS.f che si basano sulle due metodologie
rispettivamente Monte Carlo e matriciale. Mentre il metodo matriciale si basa
principalmente sull'approccio rigoroso delle matrici di Flory [5] e fornisce le
soluzioni analitiche che descrivono le caratteristiche delle catene, il metodo Monte
Carlo risulta essere meno efficiente e pi laborioso dal punto di vista dell'ammontare
di calcolo del precedente ma oggi molto utilizzato perch permette di avere
informazioni altrimenti non accessibili come la rappresentazione visiva delle catene
polimeriche (snapshots). Il campione di catene Monte Carlo riflette essenzialmente le
diverse conformazioni assunte da una singola catena in un grande intervallo di tempo
o, in modo del tutto equivalente, tutta la serie di conformazioni che un elevato
numero di catene polimeriche chimicamente identiche ad un dato istante di tempo. In
un certo senso, il calcolo pu essere analizzato come rappresentante le conformazioni
caratteristiche di una singola catena o per dedurre le propriet medie di un campione
di catene sufficientemente grande da rappresentare il sistema considerato
all'equilibrio.

CHARMm
CHARMm (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics) un codice
commerciale che fa calcolo di meccanica e dinamica molecolare. L'unit
fondamentale considerata l'atomo visto come un punto carico, con massa uguale
alla massa dell'atomo che rappresenta, senza propriet direzionali e gradi di libert.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 59

La funzione di potenziale empirica data dalla somma molti termini alcuni possono
avere dei parametri opzionali ed altri possono essere opzionalmente considerati o
meno. La forma la seguente:

E = Eb + EUB + E +E + E + EvdW + Eel + Ehb + ECr + EC

i primi cinque termini rappresentano i termini di energia interna e sono

rispettivamente:
Il termine di stertching tiene conto della deformazione dei legami ed ha la formula Eb
= kb(r-r0)2, in cui kb la costante di forza di stretching ed r-r0 la deformazione del
legame dalla posizione di equilibrio.
Il termine energetico Urey-Bradley tiene conto delle interazioni tra gli atomi a
distanza 1,3 ed assume importanza per la determinazione delle vibrazioni interne. La
formula matematica EUB = kUB (S-S0)2 in cui kUB la costante di forza ed S-S0 la
variazione del valore di equilibrio.
Il termine di bending di angoli di legame tiene conto della deformazione degli angoli
di legame ed ha formula matematica E = k(0)2, k la costante di forza del
bending di legame e 0 la deformazione dall'angolo di equilibrio.
Il termine torsionale, viene definito mediante le specificazione di quattro atomi e la
torsione intesa intorno all'asse che unisce i due atomi centrali. La formula
matematica E = k (1 + cos(n) in cui k la costante di forza, n la
molteplicit e la fase.
Il termine delle torsioni improprie stato aggiunto per mantenere la chiralit o per
mantenere la planarit di alcuni gruppi ma serve anche a migliorare il campo di forza
nei minimi di energia ed importante soprattutto nelle simulazioni di dinamica
molecolare. La formula matematica la seguente: E = k(0)2 in cui k la
costante di forza e la deformazione dall'angolo di equilibrio.
Gli ultimi due termini rappresentano le energie di interazione di non legame.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 60

EvdW il termine di van der Waals ed calcolato mediante la funzione di potenziale

di Lennard Jones EvdW = ij [(Rminij/rij)12 - (Rminij/rij)6] in cui ij rappresenta la
profondit della buca di potenziale ed la media geometrica tra i valori i di ogni
atomo, Rminij e la distanza di minima energia tra gli atomi ed dato dalla media
aritmetica dei valori Rmini per ognuno dei due atomi.
Eel il termine di interazione elettrostatica dato dalla formula Eel = qiqj/rij qi e qj in
cui sono le cariche atomiche la costante dielettrica.
E' possibile aggiungere o meno termini espliciti di interazione di legami idrogeno e
termini di constraints per fissare alcuni segmenti della molecola o diedri in una
posizioni specifica e poter studiare le energie o la mobilita di altre parti.
La procedura di calcolo la seguente:
Si costruiscono dei files per definire le strutture delle molecole e i parametri che
serviranno per il calcolo dell'energia e della dinamica. Il file di topologia un file
contenente informazioni geometriche riguardanti le unit monomerica componenti la
macromolecola e cio le lunghezze di legame, gli angoli. Ad esempio per i
polisaccaridi il file di topologia conterr le informazioni strutturali sui monomeri. E'
presente inoltre una parte riguardante il legame tra le unit monomeriche poich
dovranno essere aggiunti nuovi legami e nuovi angoli per le giunzioni ed altri
dovranno essere eliminati. Il file di parametrizzazione il file in cui vengono
specificati tutti i parametri che sono indicati nella funzione di potenziale quali le
costanti di forza le distanze e gli angoli di equilibrio.
A partire da questi files si fa calcolare al programma, per mezzo di un ulteriore file di
input in cui sono specificati i comandi corrispondenti alle varie istruzioni da eseguire,
le propriet molecolari che si vogliono conoscere, in particolare in questo lavoro di
tesi le energie in funzione delle conformazioni per il calcolo delle mappe
conformazionali dei dimeri e il calcolo di dinamica molecolare su oligomeri.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 61

SACCARLAT.f
SACCARLAT.f un codice scritto in FORTRAN 77, messo a punto per il calcolo
delle mappe conformazionali da diversi gruppi di ricerca [6, 34-40]
A differenza del programma CHARMm che pu effettuare calcoli a differente grado
di approssimazione questo programma opera soltanto un calcolo approssimato. Le
approssimazioni effettuate in questa parte dei calcoli sono le segueti:
Si utilizza il rigid residue model, ossia i residui glicosidici vengono considerati rigidi
e la loro conformazione fissata a quella di minima energia ( conformazione 4C1 ).
Vengono considerati rigidi anche i gruppi ossidrilici ed il gruppo CH2OH. I gruppi
ossidrilici vengono sostituiti da un atomo di ossigeno avente una distribuzione di
carica di un OH ed il CH2OH sostituito da un CH3 secondo quello che viene
definito extended atom model Per quanto riguarda il legame glicosidico le lunghezze
dei due legame vengono considerate costanti, l'angolo di legame viene considerato
come un parametro aggiustabile e per ogni coppia di angoli torsionali e viene
fissato al valore con energia potenziale minore. La funzione di potenziale
conformazionale quindi data da:

V ( , ) = V ( ) + V ( ) + [V r , jk ( , ) + V l , jk ( , ) + V c , jk ( , )]
jk

I primi due termini rappresentano i potenziali torsionali del legame C1-O1 e O1-Cn
rispettivamente, dove n il numero del carbonio dell'anello riducente a cui si lega
l'ossigeno a ponte. Questi termini sono dipendenti dall'aspetto elettronico del legame
chimico e si assume che sia indipendente dalle interazioni di van der Waals e di
Coulomb dei sostituenti di non legame su questi atomi.
Ci si pu aspettare, come nel caso dei polipeptidi, che il contributo all'energia
potenziale conformazionale dovuto alle interazioni di non legame rende trascurabile il
contributo dovuto al potenziale torsionale inerente per la rotazione del legame C-O
[41].
3.Metodologie computazionali e sperimentali 62

Andremo quindi a considerare i contributi all'energia delle interazioni di non legame

tra atomi o gruppi atomici j e k contenuta nei termini restanti: Vr,jk = Ajk/rjk12 il
termine di repulsione di van der Waals , Vl,jk = Bjk/rjk6 il termine attrazione di van
der Waals London; Vc,jk il termine di interazione di coulomb di atomi parzialmente
carichi. La sommatoria fatta su tutti gli atomi la cui distanza reciproca governata
solo dagli angoli e .
Il termine di interazione di coulomb valutato a partire dalle cariche parziali
assegnate ad ogni atomo ed assume la forma:
Vc,jk = 332 j k / rjk
In cui la carica parziale sugli atomi la costante dielettrica che per questi calcoli
stata posta uguale a 4 perch si voluto tenere conto del contributo del solvente e si
visto che questo valore porta ad un buon accordo tra risultati teorici e sperimentali.
rjk la distanza interatomica espressa in angstrong.
Le cariche parziali sono quelle utilizzate nella parametrizzazione di CHARMm .
La costante Bjk che la costante che compare nel termine attrattivo del potenziale di
van der Waals viene valutata usando l'equazione di Slater - Kirkwood

360 j k
B jk =
( j
/ N j ) + ( k / N k )
1/ 2 1/ 2

dove la polarizzabilit atomica ed N il numero effettivo di elettroni di valenza.

La costante che compare nel termine repulsivo del potenziale di van der Waals data
dalla formula:

1
Akj =
B jk (rjk0 ) 6
2
in cui rjk0 la distanza di contatto tra coppie di atomi.
Una funzione di potenziale soddisfacente, in assenza di legami idrogeno, ottenuta
aggiustando il parametro di repulsione in modo da minimizzare il potenziale di van
der Waals , per ogni coppia di atomi o gruppi, alla distanza interatomica :
3.Metodologie computazionali e sperimentali 63

rjk0 = rj0 + rk0 + 0.2

dove il valore 0.2 viene aggiunto per correggere gli effetti dell'attrazione degli altri
atomi nella molecola.
La procedura di calcolo la seguente:
Anche in questo caso, come per CHARMm bisogna scrivere due files quello di
topologia e quello di parametrizzazione. Nel file di topologia sono riportati ancora
angoli e distanze di legame rappresentati da vettori dei residui monosaccaridici
rispetto ad un sistema di riferimento arbitrariamente scelto. Nel file di
parametrizzazione sono riportati i parametri di interazione per tutti i possibili dimeri
che si ripetono nella catena polisaccaridica. Tali parametri serviranno nel calcolo
delle energie conformazionali. A partire da questi input il programma calcola i
termini energetici presenti nella funzione di potenziale al variare degli angoli
torsionali e quindi la mappa conformazionale.

ENERGY.f
Questo codice, in FORTRANN 77 , calcola la statistica conformazionale di catene
polisaccaridiche con il metodo Monte Carlo. La configurazione delle catene viene
definita completamente in termini degli angoli torsionali e del legame
glicosidico, che sono presi positivi per rotazione destrorse. Il fatto di trascurare gli
stretching ed i bending di legame giustificato dal fatto che per catene random la
uguale probabilit che vi sia distorsioni positive e negative dal valore di equilibrio
annulla la loro importanza.[42]
Dalle mappe conformazionali in cui l'energia potenziale rappresentata da coppie
discrete (,) viene calcolata la probabilit normalizzata Pi:

Pi' e V ( i , i ) / RT
Pi = =
P
i
i
'
e
i
V ( i , i ) / RT
3.Metodologie computazionali e sperimentali 64

in cui V(i,i) lenergia potenziale conformazionale per la coppia (i,i) e la

sommatoria viene fatta su tutte le coppie di angoli della mappa (i,i). I valori di P
saranno compresi tra 0 ad 1.
Se si suppone di avere un segmento di lunghezza 1 e lo si divide in n segmenti di
lunghezza decrescente ed ad ogni segmento sia associato alle probabilit calcolate, in
modo da avere segmenti di lunghezza maggiore corrispondenti a valori di probabilit
maggiori. A questo punto vengono generati una serie di numeri casuali il cui valore
va da 0 ad 1, non correlati tra loro. Ogni numero cos generato cadr allinterno di
uno dei segmenti considerati e porter a campionare, nella costruzione della catena
polimerica allo stato associato a tale segmento.
In questo modo un segmento di lunghezza maggiore, corrispondente ad uno stato con
probabilit maggiore, verr campionato pi frequentemente, perch contenente un
numero maggiore di punti, rispetto ad uno con probabilit minore.
Per velocizzare il calcolo, si cerca di ridurre il numero di stati da campionare non
considerando stati ad energia eccessivamente alta, che quindi hanno una bassissima
probabilit di essere rappresentati allinterno della catena polimerica, nelle condizioni
in cui si scelto di operare. Nei calcoli effettuati sono state considerate soltanto le
conformazioni ad energia inferiore a 4 kcal/mole perch la probabilit per stati ad
energia maggiore, praticamente nulla.
Seguendo questo metodo il programma costruisce il numero di catene, del grado di
polimerizzazione scelto in modo da ottenere un calcolo sufficientemente accurato in
tempi ragionevoli. Tale codice permette anche un controllo sulle energie delle catene
polimeriche in modo da limitare il numero di catene aventi energie conformazionale
eccessivamente alte e quindi poco rappresentative. Lenergia conformazionale
associata ad ogni catena calcolata come:

n
V ( , ) = Vi ( , )
i =1

dove la sommatoria fatta su tutti i residui della catena.

3.Metodologie computazionali e sperimentali 65

A questo punto, per ogni catena generata e semplificata come una sequenza di legami
virtuali viene definita un sistema di coordinate destrorso in modo che lasse xi abbia
direzione e verso delli-esimo legame virtuale. Viene definita una matrice Ti 3x3 che
trasforma il vettore definito nel sistema di coordinate i+1 al sistema di coordinate i
[41,43]. Quindi per ogni residuo possiamo definire il vettore li come una matrice
colonna rappresentante il vettore che descrive il legame virtuale i-esimo nel sistema
di riferimento i-esimo [41-43], Oi la matrice riga avente tre elementi nulli e quindi
la matrice Ai definita nel seguente modo:

T l
Ai =
O 1

l
e quindi A1 = (T l) e An +1 =
1

Il vettore la cui origine fissata nellossigeno non riducente del primo residuo con
lossigeno riducente della catena considerata viene calcolato dal seguente prodotto di
matrici:

n
r = Ai
i =1

ed la distanza testa-coda.
Dato un numero sufficiente di catene cos generate, viene calcolata la distanza testa-
coda quadratica media <r2>. Per un polimero in condizioni imperturbate <r2>o
proporzionale al grado di polimerizzazione.
A questo punto il programma calcola le propriet topologiche dipendenti dalla
lunghezza di catena, ossia il rapporto caratteristico, Cn, la lunghezza di persistenza,
Pn, e la funzione di correlazione, Fn, definiti come:
3.Metodologie computazionali e sperimentali 66

r2
Cn = 0

nl 2

l n
Pn = 1 li
l1 i=1 0

in cui n il numero di unit saccaridiche, l la lunghezza media del legame virtuale u

il vettore unitario allineato con il legame virtuale.

Fn = u1 un
0
Queste quantit sono direttamente confrontabili con quantit ottenute
sperimentalmente.
Cn tende ad un valore costante all'aumentare del grado di polimerizzazione. Per un
grado di polimerizzazione tendente ad infinito, le distanze testa coda hanno una
distribuzione gaussiane e Cn eguaglia il valore asintotico C, definito come:

r2 0
C = lim
n
nl 2
Il valore di C dipende dalla rigidit intrinseca dei segmanti che costituiscono la
catena polimerica, ed in particolare alla natura dei legami glicosidici e tanto maggiore
saranno gli impedimenti sterici che limitano gli stati rotazionali accessibili, tanto pi
grande risulter il valore del rapporto caratteristico. La velocit con cui viene
raggiunto l'asintoto dipende dalla rigidit intrinseca della catena. Questa relazione
assume una fondamentale importanza se si considera che qualsiasi perturbazione
conformazionale viene amplificata lungo gli n legami glicosidici tra i monomeri che
costituiscono la catena, quindi il valore di C, cos calcolato costituisce un metodo
eccellente per testare la correttezza delle approssimazioni fatte nel calcolo.
3.Metodologie computazionali e sperimentali 67

V2_RIS.f
Questo codice, in FORTRANN 77, reperibile in rete al sito
[http://gozips.uakron.edu/~mattice/V2_RIS.F.txt ] e riportato nell'appendice C del rif
[44], calcola la statistica conformazionale di catene polimeriche semplici mediante il
metodo degli stati isomerici rotazionali (RIS) a cui viene applicata la tecnica del
calcolo delle matrici generatori.
Il codice legge da un file di input le informazioni necessarie al calcolo:
Il numero di legami per unit ripetitiva, il numero di loop ossia, la lunghezza della
catena aumenta a step di un fattore 2 cio la lunghezza viene raddoppiata ad ogni
step, la lunghezza massima selezionata dal numero di steps (loop) Lmax ed il grado
di polimerizzazione viene definito come X=2**(Lmax-1), il numero di righe e
colonne della matrice U per il legame i e le coordinate del vettore i, la matrice u vera
e propria , i valori angolari degli stati isomerici rotazionali e l'angolo di legame per
ogni stato isomerico rotazionale. Il programma a questo punto calcola la matrice di
trasformazione T e la matrice G . A questo punto per ogni X calcola Z, lnZ,
Z<V**2>, <V**2>, Vav**2 (la media rms di Vi sull'intera catena) e Cx calcola
anche il Cinf e scrive in un output nununit, Xinv, lnZ, VM2, C, Cinf.

Parametrizzazione
I parametri utilizzati per il calcolo della funzione di potenziale sono riportati nella
tabella [41].

Atomo o gruppo rj0 / j / 3 Nj

H 1.20 0.42 0.9
C 1.70 0.93 5
C1 1.70 0.93 5
O 1.50 0.64 7
OH 1.50 0.59 7
CH2OH 1.90 1.77 7
3.Metodologie computazionali e sperimentali 68

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