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AGRARIA LA MOLINA
FACULTAD DE CIENCIAS
ENZIMOLOGA
REPORTE DE PRCTICAS
PROFESORA:
ANA KITAZONO SUGAHARA
INTEGRANTES:
-CHRISTHIAN EGUIZBAL (CALCULOS Y RESULTADOS; DISCUSIONES 100%)
-RENZO RODRGUEZ (MATERIALES Y MTODOS 100%)
-ANGEL ROJAS (CONCLUSIONES 100%)
-ROBERTO ROJAS (INTRODUCCIN 100%)
LIMA PERU
2016
PURIFICACIN PARCIAL DE FOSFATASA CIDA DE HGADO DE PESCADO USANDO
EL MTODO DE LA PRECIPITACIN POR SULFATO DE AMONIO
I. INTRODUCCIN
Las enzimas se encuentran formando mezclas complejas, usualmente en el interior de clulas
que adems poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares,
complejos con otras enzimas, protenas, cidos nucleicos, polisacridos o lpidos. Para
estudiar una en particular, se hace indispensable entonces su proceso de purificacin.
La naturaleza del ensayo depender del tipo de reaccin que cataliza la enzima. A veces
resultar conveniente la medicin de la aparicin de un producto y otras la medicin de la
desaparicin de sustrato. Podemos medir la actividad de una enzima mediante condiciones
tales como temperatura, pH, concentracin; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las
mismas para comparar actividades.
Es necesario definir una unidad enzimtica arbitraria para poder expresar, en forma
cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la
purificacin. La unidad enzimtica se define en forma particular para cada reaccin segn sea
conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formacin de una determinada cantidad
de producto (desaparicin de reactivo) en un tiempo dado.
Alcuota (AL1)
200 L
(S1)
2.2 mL S1 en Beacker
1.4 mL S1 en Tubo
ensayo
1.4 mL S1 + SA en
Tubo ensayo (reposar)
Blanco Muestras
Agua destilada 0.5 mL 0.4 mL
Muestra - 0.1 mL
Reactivo de 2.5 mL 2.5 mL
Biuret
BLANCO 0
SN1 0.043
SN2 0.026
PP1 0.556
PP2 0.643
SN3 0.609
Utilizando la ecuacin de la recta de la prctica anterior determinamos la
concentracin de protenas en cada uno de los tubo muestra:
Mesa 4:
Y = 0.0012X + 0.0021
R = 0.9997
2
PP1:
A= 0.0012C+0.0021 ---------> 0.556 = 0.0012C + 0.0021 ------> C = 461.583 mg%
C = 461.583 mg ----------> 100 mL
13.847 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)
PP2:
A= 0.0012C+0.0021 ---------> 0.643 = 0.0012C + 0.0021 ------> C = 543.083 mg%
C = 543.083 mg ----------> 100 mL
16.292 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)
SN3:
A= 0.0012C+0.0021 ---------> 0.609 = 0.0012C + 0.0021 ------> C = 505.750 mg%
C = 505.750 mg ----------> 100 mL
15.173 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)
Concentracin de protenas
SN2 17.925
PP1 415.41
PP2 488.76
SN3 455.19
SN1 0.214
SN2 0.101
PP1 0.047
PP2 0.217
SN3 0.155
11.793 moles----------------1000 mL
X moles--------------------1.9 mL X = 0.0224 moles
Ahora el proceso de la reaccin duro 2 minutos, por lo tanto, hallando la
unidad enzimtica (UE) en -moles/min:
Actividad Enzimtica de la
fosfatasa cida (U/mL)
SN1 0.221
SN2 0.104
PP1 0.049
PP2 0.224
SN3 0.160
Sin embargo, a partir del segundo fraccionamiento, los parmetros obtenidos del extracto
crudo en relacin con los precipitados y los sobrenadantes no fueron los correctos debido a
que los datos obtenidos no fueron completamente confiables. Esto lo podemos verificar en los
resultados obtenidos al comparar el rendimiento. Hay que admitir que se cometieron errores
durante la parte experimental de la prctica realizada. Uno de los errores que se cometieron
fue el adicionar sulfato de amonio de ms, pues en los clculos realizados se tom un
volumen errneo. Aunque claro, si analizamos los resultados, el rendimiento de la ltima
fraccin iba a salir bajo en las dos fases, por la prdida de enzima ocasionada por la alta
precipitacin en concentraciones altas de la sal. Incluso, el rendimiento del precipitado de la
segunda fraccin es mayor que el sobrenadante de la misma, manteniendo lo expuesto
anteriormente.
V. CONCLUSIONES
Se obtuvieron los datos de actividad enzimtica y protenas totales en cada fraccin (25% y
75%), en las cuales solo la primera fraccin del 25% en el sobrenadante result bueno con un
80% de purificacin, en las dems fracciones se perdi protenas. Es decir, la protena
fosfatasa cida presenta ms carcter hidrofilico que hidrofbico. Debemos evitar cometer
errores para tener valores reales de rendimiento.