Universidade Federal de Santa Catarina Aula Prtica 4

Centro de Cincias Biolgicas Semestre: 2011/1

Departamento de Bioqumica
Disciplina: BQA 7208 - Bioqumica Bsica
Roteiro para aula prtica: Avaliao da atividade da amilase salivar.

INTRODUO:

A atividade enzimtica pode ser avaliada medindo-se a velocidade de consumo do substrato ou a

velocidade de aparecimento do produto. Esta atividade depende de vrios fatores, tais como o tempo de
reao, a concentrao da enzima, a concentrao do substrato, a temperatura, o pH do meio e a presena de
cofatores e/ou inibidores. Para exemplificar estes conceitos, nesta aula prtica ser avaliada a atividade da
amilase salivar. A -amilase encontrada nos animais (sangue, saliva e suco pancretico), plantas, fungos e
bactrias. Esta enzima um endo-amilase e hidrolisa as ligaes glicosdicas do amido, glicognio, poli e
oligossacardeos ao acaso. Como resultado da ao no ordenada da amilase salivar, obtm-se rapidamente
uma mistura complexa de produtos de hidrlise que incluem: amido solvel, maltodextrinas, maltoses, e,
eventualmente, glicose. Na boca, a amilase salivar tem participao na digesto de carboidratos. A amilase
pancretica a maior responsvel pela digesto glicdica no duodeno. Esta enzima tambm normalmente
encontrada no soro e a elevao de sua atividade enzimtica srica pode auxiliar no diagnstico de diversas
patologias pancreticas (obstruo, tumores, pancreatite aguda, etc).
O amido composto pela amilose (no-ramificada) e amilopectina (ramificada). A amilose forma
micelas hidratadas que adsorvem IODO, presente na soluo de lugol, em suas espirais helicoidais,
apresentando colorao azul-violeta.

OBJETIVOS:

1. Avaliar a ao da amilase salivar sobre o seu substrato (amido);

2. Verificar o efeito do pH sobre a atividade da amilase salivar.

PROCEDIMENTOS:

A. ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR

1. Preparao da soluo de saliva

- Um aluno do grupo doa a sua saliva em um Becker.
- Para diluio (1:10), adicionar em um tubo:
0,5 mL de saliva
5 mL de gua destilada
Reservar at o momento de uso

2. Preparao dos tubos

- Tomar 11 tubos de ensaio limpos, nomear um deles de B (Branco) e numerar os restantes de 1 a 10.
- Adicionar a todos os 11 tubos:
2 mL de gua destilada
2 gotas de lugol

3. Preparao da soluo de reao

- Misturar, em um bquer:
5 mL de soluo de amido
2 mL de tampo fosfato (pH 6.8)
2 mL de NaCl 0,9%.
* Retirar 2 gotas e adicionar ao TUBO B (Branco)
 Adicionar 0,5 mL de soluo de saliva soluo de reao e IMEDIATAMENTE:
* Retirar 2 gotas e adicionar ao TUBO 1
* Aps 1 minuto, retirar mais 2 gotas e adicionar ao TUBO 2
* Repetir sucessivamente, em intervalos de 1 minuto, a transferncia de 2 gotas para os
tubos seguintes at o tubo que no se observe mais a colorao com o iodo (ponto
acromtico);
* Adicionar 5 mL de gua destilada a todos os tubos e agitar. Ler as absorbncias num
fotocolormetro a 620-660 nm, zerando o aparelho com o contedo do TUBO B (Branco).

B. EFEITO DO pH SOBRE A ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR

1. Preparao dos tubos

- Marcar 3 tubos de ensaio correspondentes a diferentes pHs (4,0; 6,8 e 9,5) e adicionar a todos:
2 mL de gua destilada
2 gotas de lugol (reagente contendo iodo).

2. Preparao dos tubos contendo tampes de pHs diferentes

- Marcar 3 tubos e adicionar a cada um:
5 mL de AMIDO
2 mL de NaCl
- Adicionar ao primeiro tubo 2 mL de tampo acetato (pH 4,0);
- Adicionar ao segundo tubo 2 mL de tampo fosfato (pH 6,8);
- Adicionar ao terceiro tubo 2 mL de tampo glicina (pH 9,5);
- Manter todos os tubos a temperatura ambiente por 5 minutos.

3. Tubos de reao.
- Adicionar 0,5 mL da enzima (soluo de saliva diluda) em cada um dos tubos contendo amido e tampes
com pHs diferentes e agitar;
- Aps 5 minutos de reao, transferir 2 gotas para os seus respectivos tubos contendo IODO.
- Adicionar a todos os tubos contendo IODO 5 mL de gua destilada.
- Compare as cores entre os diferentes tubos. Qual foi o pH ideal para atividade da amilase?

ROTEIRO PARA O RELATRIO:

- Introduo: Escrever uma breve introduo terica sobre atividade enzimtica e sobre a enzima amilase
salivar
- Materiais e mtodos: Descrever detalhadamente o que foi feito no laboratrio, alm do material utilizado.
- Resultados: Experimento 1: Traar duas curvas num mesmo grfico, colocando os tempos (minutos) na
abscissa e as absorbncias para os tubos contendo IODO na ordenada. Comparar a curva de consumo de
substrato (amido) entre os diferentes grupos. Experimento 2: Comparas as cores deste experimento com as
cores do primeiro experimento. Deduzir e explicar qual o melhor pH (pH timo) para a enzima amilase
salivar.
- Discusso: Discutir os resultados obtidos.
- Bibliografia: Descrever a bibliografia utilizada para o relatrio.