INTRODUCCION

Las casenas son un conjunto heterogneo de protenas por lo que es difcil

fijar una definicin. Sin embargo, todas las protenas englobadas en lo que se
denomina casena tienen una caracterstica comn: precipitan cuando se
acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la casena tambin se le suele denominar
protena insoluble de la leche. Por otra parte, y aunque las protenas que se
denominan casenas son especficas de cada especie, se clasifican en los
siguientes grandes grupos de acuerdo con su movilidad electrofortica: s1-
casena, s2-casena, -casena y -casena (vase la Figura 1). Esta ltima es
de especial inters en la industria quesera, ya que su hidrlisis enzimticas por
la renina genera una nueva protena, denominada para--casena. Cuando est
ltima reacciona con el calcio genera paracasena de calcio. Durante el
proceso de maduracin del queso, y a partir de la para--casena, se forman
unos macropptidos denominados -casenas, responsables de las
caractersticas reolgicas y organolpticas de los quesos. La produccin de
acido lctico a partir de la bacterias transforman la lactosa y se desnaturaliza la
casena cuando el ph llega al "punto isoelctrico" 4.6 El punto isoelctrico es el
pH al que una sustancia anftera tiene carga neta cero. El concepto es
particularmente interesante en los aminocidos y tambin en las protenas. A
este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula.
Las molculas complejas, tales como las protenas, se combinan con los iones
hidrgeno y con otros iones presentes en la disolucin, dando lugar a la carga
neta de la molcula. A la concentracin de iones hidrgeno, o al pH, para el
cual la concentracin del ion hbrido de una protena es mxima y el
movimiento neto de las molculas de soluto en un campo elctrico es
prcticamente nulo, se l denomina punto isoelctrico. Sustancias
isoeletronicas: Son tomos o iones que poseen el mismo nmero de electrones
e igual configuracin electrnica.

http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practi
ca3FQB.pdf

OBJETIVOS

El estudiante identificar el pH isoelctrico de la casena

El objetivo fundamental de esta prctica es la determinacin del punto
isoelctrico de la casena una vez extrada esta mediante procedimiento
qumico de la leche entera liquida.
Realizar la extraccin de la casena de la leche y verificar su naturaleza
proteica.
 MARCO TEORICO

A diferencia de muchas otras protenas, incluso de la leche, las casenas no

precipitan por accin del calor. Por el contrario, precipita por la accin de una
enzima proteasa presente en el estmago de los mamferos llamada renina y
forma un precipitado denominado paracasena. Si la precipitacin se realiza por
la accin de cidos, se le llama casena cida. En la elaboracin de los quesos
tienen lugar ambos tipos de precipitaciones.

Cuando se emplea la enzima tripsina, la casena se hidroliza a una molcula

fosfatada llamado peptona.

Las caractersticas de las casenas de la leche de vaca se resumen en la tabla

2. La secuencia aminoacdica (ver Figura 2) de la casena contiene un nmero
inusual de residuos del aminocido prolina: entre 10 en la s2-casena y 35 en
la -casena. Como resultado, las casenas son relativamente hidrofbicas
(poco soluble en agua) y carecen de estructura secundaria o terciaria bien
definidas. En la leche se encuentra como suspensin de partculas que
asemeja a las micelas de surfactantes (pequeas esferas hidroflicas en el
exterior e hidrofbicas en el interior). Estas micelas de casena se estabilizan
por iones de calcio e interacciones hidrofbicas.

Otro dato interesante, utilizado para separar las casenas del resto de las
protenas lcteas mediante su precipitacin, es que su punto isoelctrico (pI)
promedio es de 4,6. A este pH, las casenas se encuentra en su punto de
menor solubilidad debido a la reduccin de las repulsiones intermoleculares,
por lo que precipitan (vulgarmente se dice que coagulan). Ahora bien, el pI es
diferente para cada una de las fracciones casenicas, ya que vara entre el
4,44-4.97 para la s1-casena y el 5,3-5,8 en la variante gentica B de la -
casena. Adems de usarse directamente en la elaboracin de productos
alimentarios (derivados lcteos y crnicos, panes y productos de repostera,
etc.), la casena se utiliza en la elaboracin de productos no alimentarios:
pegamentos y pinturas, cubiertas protectoras, plsticos (vase la tabla 3). Otros
usos tecnolgicos son la clarificacin de vinos o como ingrediente en
preparados de biologa molecular y microbiologa (medios enriquecidos para el
cultivo microbiano).

En la alimentacin especial, la casena sirve para la elaboracin de preparados

mdicos y concentrados proteicos destinados a la alimentacin de los
deportistas, especialmente despus de su entrenamiento. As, se ha observado
que la digestin de las casenas es ms lenta que la de las lactoprotenas
solubles (tambin denominadas seroprotenas) y, por ello, ms apropiada para
reparar el anabolismo de los aminocidos durante el perodo que sigue a una
comida. http://es.wikipedia.org/wiki/Case%C3%ADna

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIALES Y REACTIVOS

- Diez beaker de 25 ml - Termmetro

- Dos beaker de 50 ml
- Un beaker de 250 ml
- Probeta de 50 ml
- Matraz aforado de 50 ml
- pipeta graduada de 5,0 ml
- pipeta graduada de 1,0 ml
- pipeta graduada de 10,0 ml
- Embudo de vidrio mediano
- Papel de filtro
- Reactivos por grupo:
- Agua destilada
- Acetato sdico 0,1 N
- cido actico 0,01 N
- cido actico 0,1 N
- cido actico 1,0 N
- NaOH 1N
- ter etlico
- Etanol al 70%

MATERIALES Y REACTIVOS DE USO GENERAL:

- Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potencimetro

- Potencimetro (pH-metro)
- Leche entera corriente (1 litro).

Metodologa

A. Aislamiento de la casena:

- Caliente en un beaker de 150 ml de agua destilada a 38C, aada 50ml

de Leche y luego gota a gota y con agitacin, adicione cido actico 1M hasta
que observe que se forma un precipitado (la leche se corta).
- Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de
cristal.
- Lave el precipitado con 20 ml de etanol en el mismo filtro.
- Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.
- Coloque el precipitado en un beaker pequeo previamente pesado,
vuelva a pesar el beaker con el precipitado y luego adicione 5ml/g de ter
etlico.
- Filtre nuevamente.
- Deseche el lquido quedando un precipitado blanco de fcil manipulacin
que es la casena.

B. Preparacin de la solucin de casena:

- Coloque aproximadamente 500 mg de casena en un beaker de 50ml.

- Agregue 40 ml de agua destilada y 10 ml de NaOH 1N; agite hasta lograr una
solucin total de la casena.
- Una vez disuelta la casena, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione
5 ml de cido actico 1N y diluya con agua destilada hasta 100 ml y mezcle
bien.
- La solucin debe ser clara y limpia y si no es as, debe volver a filtrar.

C. Determinacin de pi de la casena:

En diez beaker de 25 ml limpios y secos adicione exactamente los volmenes

de los reactivos segn la siguiente tabla.

TABLA DE DISOLUCIONES

TUBO Acetato 0.1N Actico 0.1N Actico 0.01 N pH

resultante (aprox.)
1 0.5 9.5 - 3.2
2 1 9 - 3.6
3 1.5 8.5 - 3.8
4 2 8 - 4
5 3 7 - 4.2
6 4 6 - 4.5
7 6 4 - 4.7
8 8 2 - 5.1
9 6 - 4 5.5
10 8 - 2 6.1

Medir experimentalmente el ph de todos los vasos, que debe cubrir un rango

Aproximado semejante al terico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la tabla,
que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso creciente.
- aadir 1 ml de disolucin de casena a cada tubo.
- agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos.
- medir la absorbencia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de
colorimetra de 1cm de paso ptico, teniendo la precaucin de agitar bien el
contenido de cada tubo para obtener una solucin / suspensin homognea
antes de verter una parte en la cubeta.
- anotar resultados, representar la absorbencia frente al pH, y determinar el pi
Aproximado de la casena.

RESULTADO

TABLA DE DISOLUCIONES

TUBO Acetato 0.1N Actico 0.1N Actico 0.01 N pH resultante (aprox.)

nm

1 0.5 9.5 - 3.2 3.30 0.209

2 1 9 - 3.6 3.58 0.55

3 1.5 8.5 - 3.8 3.64 0.244

4 2 8 - 4 3.89 0.185

5 3 7 - 4.2 4.06 0.255

6 4 6 - 4.5 4.28 0.274

7 6 4 - 4.7 4.63 0.303

8 8 2 - 5.1 4.87 0.232

9 6 - 4 5.5 5.62 0.338

10 8 - 2 6.1 6.08 0.150

 GRAFICAS

PH ABSORCION (NM)

3,3 0,209

3,58 0,53

3,64 0,244

3,87 0,185

4,06 0,255

4,28 0,274

4,63 0,303

4,87 0,232

5,62 0,338
6,08 0,15

Grafica 1: Relacin De PH Vs Absorcin

 ABSORCION PH
( NM ) (X) (Y)

0,209 3,3
0,53 3,58
0,244 3,64
0,185 3,87
0,255 4,06
0,274 4,28
0,303 4,63

0,232 4,87

0,338 5,62

0,15 6,08

Grafica 2: Relacin De Absorcin Vs PH

 ANALISIS DE RESULTADO

El pH isoelctrico (baja solubilidad, carga neta igual a 0) debe recordarse

cuando se investiga sobre la separacin y purificacin de fracciones proteicas.
Existen varios mtodos para la determinacin experimental del pH isoelctrico
(pHI) de una protena. En esta determinacin el pH donde se presenta la
mnima solubilidad puede ser usado para estimar el pH isoelctrico de la
casena.
La casena est presente en la leche en forma de partculas coloidales o
micelas y son fcilmente separadas por precipitacin isoelctrica. El cuajado y
la acidificacin son una prctica de la tecnologa de lcteos para la preparacin
de productos de leche agria y algunos quesos suaves. La acidificacin natural
se lleva a cabos por inoculacin de la leche con iniciadores por ejemplo,
cultivos de bacterias cidos lcticos.
En la extraccin de la leche se puede considerar unos diferentes tipos de
protenas, como la casena, lacto albumina, lacto globulinas. Todas globulares.
La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se
separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las
fosfoprotenas son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a
una sustancia que contiene cido fosfrico. En la casena la mayora de los
grupos fosfato estn unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina
y treonina. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica
(caseinato clcico). La casena representa cerca del 77% al 82% de las
protenas presentes en la leche y el 2,7% en composicin de la leche lquida.

http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practi
ca3FQB.pdf

CONCLUSION

La casena es una protena exclusiva de la leche que aporta

aminocidos esenciales. Son las protenas de la leche justamente lo que
le da a este alimento su valor nutricional.
No existe leche sin las suficientes protenas: para que un producto sea
realmente leche debe contener un mnimo de 30 gramaos por litro de las
protenas que le son propias. De esos 30 gramos de protenas, al menos
70 por ciento deben ser casena.

As la verdadera leche tiene un mnimo de 30 gramos por litro de sus

protenas, pero la frmula lctea puede tener slo 22 gramos por litro de
protena de la leche, de los cuales 15.4 gramos por litro debe
corresponder a la casena.
 La manipulacin de los componentes de la leche juega un papel
importante a nivel industrial, tal como la casena que es muy utilizado a
nivel industrial para fabricar cosas como pegamento. Pero tambin es de
vital importancia en la dieta humana ya que nos proporciona gran
cantidad de nutrientes y vitaminas.

BIBLIOGRAFIA

http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Pract
ica3FQB.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Case%C3%ADna

http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Pract
ica3FQB.pdf
http://www.fortunecity.com/littleitaly/siena/600/fisiclec.htm

CUESTIONARIO
1. Composicin de la leche y los distintos tipos de leche

R/.. Composicin de leche: La leche animal se componen principalmente de

agua (80-90%) en la que se encuentran disueltas o en suspensin las
protenas, la lactosa (azcar de la leche), los minerales y las vitaminas
hidrosolubles (diagrama 2.1). La grasa de la leche est en emulsin y se
encuentra distribuida en el lquido a manera de glbulos que pueden unirse
unos a otros formando una capa de crema cuando la leche fresca se deja en
reposo.

Tipos de leche: de cabra, yegua, oveja, doncella (pez), burra, materna,

2. Consultar la composicin de las protenas presentes en la leche

R/.. El sistema protenico de la leche

Las casenas (fosfoprotenas) representan el 80% de las protenas de la
leche de vaca; el resto est constituido por Beta-lactoglobulina (alrededor del
10% de las protenas totales), Alfa-lactoalbmina (en torno al 2% de las
protenas totales) y pequeas cantidades de diversas protenas (enzimas,
inmunoglobulinas, etc.)
Cuando se coagulan las casenas, quedan en solucin las otras protenas;
conjuntamente con la lactosa y sales minerales para constituir el llamado
lactosuero.
La fraccin casenicas.
Comprende varios tipos de molculas de las cuales el 50%
aproximadamente es de alfa-casenas, 30% de beta-casena, 15% de k-
casena y 5% de gama-casena. Estos compuestos pueden separarse por
ultra centrifugacin, la fraccin casenicas total se precipita por descenso del
pH de la leche hasta 4,7 aproximadamente.
A pH 7 y aisladamente, la alfa-casena est bajo la forma de pequeos
polmeros, la beta-casena al estado de monmero y la k-casena al estado
de polmeros mayores.
A pH 7 y 37C, el agregado de iones Ca++ no afecta a la k-casena, en
cambio la beta-casena precipita y la alfa-casena coagula. Los complejos de
alfa y k se asocian con la casena para formar micelas.
Durante el cuajado de la leche, el cuajo ataca a la casena k, escindiendo el
enlace peptdico fenilalanina-metionina. La paracasena k as formada ya no
estabiliza ms el complejo con la casena alfa, y en presencia de calcio, los
conjuntos micelares coagulan, formando un gel, la cuajada, que expulsa al
lquido llamado lactosuero, por sinresis.
La velocidad de coagulacin y sinresis aumentan cuanto mayor sean los
contenidos de casenas, calcio y acidez de la leche.
Beta-lactoglobulina
No se encuentra en la leche humana. Es la protena ms abundante en el
lacto suero de la leche de vaca.
La composicin en aminocidos es bien conocida y se sabe que hay por lo
menos 4 variantes genticas, que se distinguen por la sustitucin de ciertos
aminocidos en la cadena proteica.
Incide en los tratamientos tecnolgicos de la leche, en efecto, su
desnaturalizacin por calentamiento reduce el riesgo de coagulacin de la
leche durante la esterilizacin.
Alfa-lactoalbmina
Es una de las protenas del sistema lactosa-sintetiza, presente en las clulas
de las glndulas mamarias.
En conjunto provocan la unin de la glucosa con la galactosa, asegurando la
sntesis de la lactosa.
Es insoluble a pH entre 4 y 5,5, a un lado y a otro lado de esta zona, la
molcula sufre modificaciones de conformacin, rpida o lenta, reversibles o
no, que conducen a diversas formas polimerizadas.

3. PH inicial de la leche
R/El pH inicial de la est en un alrededor de 6.5

4. Cul es la funcin del etanol en la leche

R/ El etanol al igual que otros alcoholes puede actuar en las membranas
biolgicas fundamentalmente de 3 formas 1) alterando la fluidez de las
membranas, lo que indirectamente afectara el funcionamiento de las protenas
como enzimas y canales; 2) produciendo una deshidratacin a nivel de las
membranas; 3) interactuando directamente con las protenas de la membrana.
Los efectos del etanol en las membranas biolgicas podran explicar en parte,
los efectos generalizados del etanol.

5. Que procedimiento existe para extraer el agua de snl precipitada (filtro y

embudo)

R/ Por evaporacin del agua utilizando calor, secando los productos

mecnicamente, como en la produccin de leche en polvo, utilizando
secadoras a rodillo o atomizadores. Secando los productos al sol o al aire libre,
como en el caso de la elaboracin de quesos o la extraccin de la casena de
la leche (protena de la leche).

6. Que mtodos hay para filtrar casena.

El microfiltrado. Aqu se pueden separar componentes pesados de la
leche. La grasa, por ejemplo, puede ser removida usando un tamao de poro
que restringe solamente la crema de la leche, dejando pasar a la leche
descremada. Puede utilizarse tambin un tamao de poro an menor para
permitir la separacin de la casena del suero de la leche. Luego llegamos al
ultrafiltrado, en el cual se retienen todos los componentes grandes de la leche,
protenas y grasas, pero permitiendo pasar lacrosa, agua y minerales. Es aqu
donde, con el agregado de agua, o diafiltracin, se puede lavar an ms
lactosa de la leche. Las siguientes membranas utilizadas en el procesamiento
lcteo son de Nanofiltrado. Estas membranas retienen todos los componentes
exceptuando sales y agua. Por ltimo, tambin se utilizan membranas de
smosis inversa. Esta membrana permite solamente el pasaje de agua,
actuando entonces puramente como concntrate.
El filtrado por membranas cross-flow ha abierto las puertas para una
gran variedad de innovadores productos lcteos. No hace falta mirar atrs
demasiado lejos hacia los das en los que separadores mecnicos eran la nica
va de cosechar un componente de la leche. Hoy, no solo puede separarse la
crema; prcticamente todo componente mayor de la leche puede separarse por
membranas de filtro. La tecnologa de filtrado por membrana ha obtenido
rpidamente prominencia en el procesamiento de ingredientes lcteos. El
Microfiltrado, Ultrafiltrado, Nanofiltrado y la smosis inversa hacen posible la
produccin de productos con propiedades y funcionalidades nicas.

7. Por que el sobrenadante (suero dulce) es de color amarillo.

Las protenas que aparecen en el sobrenadante de la leche despus de la
precipitacin a pH 4.6 se llaman protenas del suero colectivamente. Estos
protenas globulares son ms solubles en agua que las casenas y son objeto
de desnaturalizacin por el calor. Las protenas del suero nativas tienen buen
poder gelificante. La desnaturalizacin aumenta su capacidad de retencin de
agua.

Las principales fracciones son -lactoglobulinas, alfa-lactoalbmina, albmina

srica bovina e inmunoglobulinas (Ig). -Lactoglobulinas: (pm - 18,000) Este
grupo, incluyendo ocho variantes genticas, comprende aproximadamente la
mitad de las protenas del suero totales. Tiene dos enlaces bisulfuro y un grupo
tiol libre. El punto isoelctrico (pH 3.5 a 5.2), los dmeros se asocian ms all
de octameros pero por pH debajo de 3.4, ellos se disocian a monmeros. Alfa-
Lactalbumins: (pm-14,00). Estas protenas contienen ocho grupos cistena,
todos involucraron enlaces disulfuro, y cuatro residuos de triptfano. La
desnaturalizacin trmica y pH <4.0 resultan en la perdida de calcio.

http://www.fortunecity.com/littleitaly/siena/600/fisiclec.htm

8. Cul es el punto isoelctrico de la casena.

El punto Isoelctrico (o pH isoelctrico) de la casena es 4.6. A este pH, la

casena se encuentra en su punto de menos solubilidad, debido a que hay
menos repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. El precipitado es de
color blanco parecido a queso cottage el cual como la mayora de quesos est
compuesto por este.

9. Por que las protenas tienen solubilidad mnima en el pl.

El pH del medio afecta la solubilidad de las protenas, puesto que cuando es

igual al pi de las protenas esta pierde su carga elctrica neta y con ello su
solubilidad, llegndose a precipitar en algunos casos.
El pi de una protena puede determinarse, registrndose experimentalmente
valores de absorbancia de solucin a distinto ph s.
El pi depende de la fuerza inica y del tipo de ion. fi= ci. zi 2 carga
inica.
AISLAMIENTO DE LA CASENA Y DETERMINACIN DEL PUNTO
ISOELECTRICO

WILLIAM CONTRERAS GARAVITO

DANIEL AMELL JIMNEZ
ADER NUEZ ORTEGA
DR. RUBEN JARAMILLO

UNIVERSIDAD DE SUCRE
EDUCACION Y CIENCIA
BIOLOGIA
BIOQUIMICA
OCTUBRE-27-2008