A nova grande promessa

da inovao em frmacos:
RNA interferncia saindo
do laboratrio para a clnica
CARLOS Frederico Martins Menck

Introduo

A
molcula de RNA foi recentemente identificada como um possvel
frmaco capaz de revolucionar a forma com que realizamos terapias de um
elevado nmero de doenas humanas. As atividades biolgicas dessas mo-
lculas, empregadas normalmente na forma de dupla fita, foram descobertas
na dcada de 1990 graas identificao dos mecanismos de interferncia do
RNA e baseiam-se na capacidade de essas molculas reduzirem (interferirem) a
expresso de determinados genes-alvo. O potencial teraputico do RNA dupla fita
enorme, sobretudo em processos genticos que requerem inibio de produtos
de genes. Entre as doenas-alvo, destacam-se as terapias tumoral e de agentes
infecciosos, especialmente vrus, mas vrias outras doenas humanas tambm
podero ser controladas pela ao dessas molculas. O tamanho relativamente
grande das molculas de RNA, sobretudo em comparao com algumas drogas
qumicas, pode representar um dos problemas a serem enfrentados pelas
pesquisas no tema, porm chama a ateno a facilidade com que essas molculas
podem ser projetadas, dependendo apenas da sequncia das bases do gene-alvo.
Vrios protocolos clnicos tm sido testados em humanos nos ltimos anos, e os
resultados so promissores. possvel que em breve esse tipo de frmaco seja
encontrado em farmcias: vale a pena saber o porqu!
O RNA no s um mero mensageiro do DNA
Na dcada de 1980, a comunidade cientfica se espantou com a revelao
de que a molcula de RNA tem atividade cataltica, como as enzimas. Assim,
essas molculas foram chamadas de ribozimas e demonstraram que o RNA pode
desempenhar funes que superam em muito a de simples mensageiro para
sntese de protenas. Mas isso foi s o comeo. Na dcada de 1990, resultados
com plantas transgnicas comearam a gerar dados completamente inesperados:
plantas que superexpressavam genes para produo de pigmentos (e que,
portanto, deveriam gerar flores com mais pigmentos, ou seja, com colorao
violeta-escuro) apresentaram flores brancas, em razo da ausncia de sntese do

estudos avanados 24 (70), 2010 99

pigmento! No caso, houve o inesperado silenciamento do transgene e do gene
endgeno das clulas dessas flores.
O mecanismo molecular que levava ao silenciamento gnico permaneceu
desconhecido por alguns anos, at que, trabalhando com o verme nematoide
Caenorhabditis elegans, os grupos dos pesquisadores americanos Andrew Z.
Fire e Craig C. Mello descobriram que molculas de RNA dupla fita (RNAdf)
poderiam silenciar a expresso de genes (Fire et al., 1998). Os experimentos
realizados para essa descoberta so extremamente simples: ao analisarem o efeito
de silenciamento gnico de molculas de RNA simples fita antissenso e tambm
senso (em relao ao sentido da molcula do RNA mensageiro do gene-alvo),
os pesquisadores descobriram que o uso da molcula dupla fita tinha um efeito
cem vezes maior. Pela capacidade do RNAdf de interferir na expresso gentica,
o mecanismo comeou a ser chamado de RNA interferncia ou simplesmente
RNAi.
O mecanismo de RNA interferncia
funciona em clulas humanas
Esse mecanismo de silenciamento foi demonstrado inicialmente em vermes,
plantas e insetos, mas demorou trs anos para ter sua existncia demonstrada
em clulas humanas (Elbashir et al., 2001). Esses experimentos indicaram
a importncia evolutiva dos mecanismos de RNAi em eucariontes em geral e
acenderam ideias do uso potencial tecnolgico para molculas de RNAdf como
base para silenciamento gnico com fins teraputicos em humanos. Alm disso,
houve a identificao de pequenas molculas de RNAdf (na forma de grampos)
sintetizadas pelas prprias clulas, a partir do seu genoma cuja funo controlar
a expresso de genes celulares. Esses RNA endgenos ficaram conhecidos como
microRNA (miRNA) e demonstram que as funes do RNA na clula vo muito
alm da simples mensagem. Pela descoberta, os doutores Fire e Mello receberam
o Prmio Nobel de Medicina em 2006.
Como funciona a RNA interferncia na clula
Os mecanismos de RNA interferncia j so bem conhecidos. Basicamente,
genes endgenos so transcritos como um RNAm longo contendo vrios miRNA
agrupados. Esses miRNA primrios so conhecidos como pri-miRNA e contm
sequncias de bases palindrmicas, de modo que o emparelhamento entre elas
gera estruturas de RNAdf na forma de grampo. Essas molculas so processadas
ainda no ncleo da clula, sendo clivadas por RNAse (Drosha), formando
estruturas com cerca de 70 bases, conhecidas como pr-microRNA (pr-miRNA).
Essas molculas so exportadas ao citoplasma (pela enzima Exportina-5) e so
novamente processadas por uma RNAse, Dicer, que produz os miRNA maduros
que so duplexes de 19 a 23 pares de base. O complexo Risc (do ingls RNA
induced silecing complex) a plataforma proteica que se associa aos miRNA e
promove a interao de uma das fitas do RNAdf (RNA-guia) com molculas de
RNA mensageiros. Essa interao ocorre por complementaridade na sequncia

100 estudos avanados 24 (70), 2010

do RNA-guia e do RNAm, e normalmente ocorre na regio 3 no traduzida (3-
UTR), resultando no silenciamento do RNAm-alvo, seja por degradao desse,
seja pelo bloqueio da traduo em protenas. No caso de bloqueio de traduo,
a complementaridade no necessita ser completa, o que indica que um nico
miRNA pode regular centenas de genes, e cada gene-alvo pode ser regulado por
mltiplos miRNA, demonstrando a complexidade dessa rede de regulao gnica.
A Figura 1 apresenta um esquema que descreve de forma simplificada como
funciona o mecanismo de RNA interferncia (para uma reviso, ver Liu, 2008).

Figura 1 Ao de RNA interferncia em clulas animais. A) Esquema do mecanismo

de RNA interferncia, indicando as principais protenas/complexos proteicos
envolvidos; B) esquema mostrando como podemos empregar esses mecanismos
para provocar silenciamento de genes de forma dirigida, com duplexes de
RNA (siRNA), ou vetores virais ou no para expresso de shRNA.

estudos avanados 24 (70), 2010 101

 A descoberta do processo de regulao gnica atravs de RNA interferncia
revolucionou tambm a forma como se estuda o papel de genes especficos
na biologia. O uso de molculas de RNAdf exgenas como ferramenta pode
reduzir a expresso de genes especficos (efeito conhecido como knock-down),
de forma que as alteraes causadas por essa estratgia possibilitam avaliar quais
funes esse gene desempenha na clula. Nesses experimentos, a sequncia da
molcula de RNAdf definida pelo pesquisador para interferir no seu gene-
alvo preferido. Essa estratgia tambm pode ser usada diretamente in vivo (em
animais ou mesmo em humanos), e da a possibilidade de desenvolvimento de
frmacos (Tiemann & Rossi, 2009).
Basicamente, duas abordagens distintas podem ser usadas. Na primeira,
vetores genticos, em geral derivados de vrus (como adenovrus, retrovrus ou
vrus adenoassociados), so transduzidos nas clulas, de modo a expressar genes
que so transcritos em molculas de RNAdf na forma de grampo (similares aos
miRNA). Essas molculas so conhecidas como shRNA (do ingls short hairpin
RNA) e tm como alvo o gene que se deseja silenciar. O shRNA clivado pela
protena Drosha e assim processado pela maquinaria de RNA interferncia
celular. Apesar de esse tipo de abordagem requerer a produo de vetores virais,
o que no um processo simples do ponto de vista de produo de frmacos,
ainda assim, como veremos adiante, h algumas estratgias teraputicas que esto
sendo testadas, como protocolos clnicos em humanos, empregando vetores que
expressam shRNA.
Em uma segunda abordagem, pequenas molculas de RNAdf podem ser
introduzidas diretamente nas clulas em cultura, visando degradao especfica
do gene-alvo. Essas molculas so conhecidas como siRNA (small interfering
RNA) e podem ser introduzidas na clula, por vrios tipos de metodologias,
para o silenciamento de seu gene-alvo. Atualmente, vrias empresas de
biotecnologia oferecem molculas de siRNA, para qualquer gene humano
(ou camundongo) que o pesquisador pretenda silenciar. Uma caracterstica
importante o tamanho da duplex que deve ter de 19 a 30 pares de base, uma
vez que tamanhos maiores podem induzir respostas interferon inespecficas em
clulas animais.
Em cultura de clulas, a introduo de molculas de siRNA , em geral,
feita atravs da formao de complexos dessas duplexes com polmeros qumicos
ou lipdeos, normalmente catinicos. O complexo endocitado pelas clulas e as
duplexes de RNA so liberadas no citoplasma, sendo processadas pela maquinaria
de RNA interferncia, promovendo o silenciamento do gene-alvo. A utilizao
de siRNA tem sido largamente empregada em estudos de genmica funcional e
em distintos testes clnicos em razo do silenciamento gnico especfico e robusto
induzido por essas molculas. A fcil manipulao e a existncia de sequncias de
siRNA para qualquer gene do genoma humano tornaram acessvel o uso dessa
ferramenta por diferentes grupos de pesquisa bsica e aplicada.

102 estudos avanados 24 (70), 2010

 Interferindo na expresso gnica in vivo
A descoberta dos mecanismos de RNA interferncia em clulas humanas
relativamente recente, mas, apesar disso, rapidamente verificou-se que o uso
de RNAdf como ferramenta tambm pode ser feito in vivo, diretamente em
animais. Obviamente, a maior parte desses testes pr-clnicos tem sido feita em
camundongos, mas animais maiores, como macacos, tambm tm sido usados,
e os resultados tm sido promissores. Isso estimulou o desenvolvimento de
estudos diretamente em humanos, e vrios protocolos clnicos j esto sendo
testados. O potencial teraputico de silenciamento atravs de RNA tem sido
investigado tendo como alvo vrios tipos de doenas, como cncer, doenas
respiratrias, inflamao, doenas neurolgicas, autoimunes e no combate a
processos infecciosos (Figura 2). Alguns protocolos clnicos em fase I, que testam
a segurana do uso de terapias em humanos, j foram concludos e se verificou
que molculas de siRNA foram introduzidas em pessoas sem que se verificasse
efeito txico. Mais do que isso, em vrios casos identificou-se o funcionamento
dessas duplexes no silenciamento do gene-alvo, como desejado.
O desenvolvimento de terapias baseadas em RNAi tornou-se um campo
de pesquisa atrativo e promissor sobretudo nos casos em que a inibio
de determinadas protenas no teve sucesso pelos mtodos farmacolgicos
tradicionais. Alm disso, como o desenvolvimento de duplexes de RNA s
depende do conhecimento da sequncia do gene-alvo, o desenvolvimento dessas
drogas extremamente simples em relao ao tradicional drug design, no qual
h necessidade de conhecimento da estrutura cristalogrfica da protena-alvo, o
que no garantia de sucesso em determinar os ligantes ativos nessas estruturas.
Apesar de existirem casos nos quais as duplexes podem atuar em alvos diferentes
do previsto (efeito conhecido como off-target), vrios protocolos experimentais
tm demonstrado a especificidade dada pela sequncia dessas molculas, o que
estimula novas pesquisas na rea.
Em geral, os trabalhos empregam as metodologias j bastante investigadas
para introduo de DNA em organismos, em procedimentos de terapia gnica
tradicional. Entretanto, algumas diferenas entre o uso dessas duas abordagens
so claras e devem ser levadas em conta na escolha da metodologia. A molcula
de siRNA muito menor (entre 19 e 30 pares de bases), o que facilita sua
entrega em relao aos vetores genticos dependentes de DNA ou RNA (em
geral alguns milhares de pares de base). Apesar disso, RNA uma molcula muito
mais instvel, sendo degradada in vivo por RNAse. Essa caracterstica exigiu
diversos estudos em modificaes qumicas que aumentam sua estabilidade no
organismo, sem prejudicar a ao dessas molculas com frmacos.
Os testes com animais empregam siRNA ou shRNA atravs de vrias
vias de administrao, o que depende do gene e do tecido-alvo. Por exemplo,
aplicaes intravenosas possibilitam que a duplex seja direcionada especialmente
ao fgado, onde interiorizado nas clulas. Por sua vez, introduo de siRNA

estudos avanados 24 (70), 2010 103

Figura 2 Principais vias utilizadas para silenciamento gnico atravs de ao direta em
protocolos humanos com RNA interferncia.

por injeo intraocular garante um efeito direto nesse rgo, com a vantagem
de o olho ser um compartimento de tamanho limitado, o que possibilita o uso
de poucas molculas, que ainda so efetivas no silenciamento gnico. Tambm
tem tido muito sucesso o emprego de aplicao de duplexes de RNA atravs de
inalao quando o alvo so as vias areas. Alm disso, molculas de siRNA tm
sido aplicadas diretamente na pele, o que possibilita um alcance em vrios pontos
do organismo, ainda que preferencialmente em tecidos mais superficiais. Em
geral, essas aplicaes in vivo utilizam, como em cultura de clulas, complexos
com polmeros ou lipdeos (poliplexos ou lipossomos) que constituem as
nanopartculas que so endocitadas para interiorizao das duplexes nas clulas.
Curiosamente, no entanto, em vrias aplicaes, solues salinas de siRNA so
diretamente usadas e essas ainda so eficientes, promovendo o silenciamento do
gene-alvo no organismo. Entretanto, bastante provvel que, em muitos desses
casos, o uso das nanopartculas melhore a eficincia do frmaco. Nos casos de
shRNA, em geral so empregados vetores genticos derivados de vrus para sua
expresso nas clulas. Como em outros procedimentos de terapia gnica, alguns
dos casos so diretamente aplicados in vivo (por aplicao intravenosa, por
exemplo), mas tambm h casos de aplicao ex vivo, que permite a modificao
de clulas-tronco do prprio organismo com o vetor que expressa o shRNA (e
promove o silenciamento do gene-alvo). Posteriormente, a clula modificada
reintroduzida no organismo, de modo a obter o benefcio teraputico.

104 estudos avanados 24 (70), 2010

 Interferindo no genoma humano com fins teraputicos
Apesar de sabermos que o mecanismo de RNA interferncia existe em clulas
humanas h relativamente pouco tempo (desde 2001), surpreendente como
rapidamente foram iniciados protocolos clnicos em seres humanos empregando
RNAi. Essa rapidez e relativo sucesso em alguns desses protocolos permitem
prever que, em poucos anos, teremos essas molculas sendo comercializadas em
nossas farmcias e/ou aplicadas em nossos hospitais (Tiemann & Rossi, 2009).
Entre as principais indicaes de uso de RNA interferncia, destacam-
se aquelas envolvidas em terapias oftalmolgicas. Isso se deve basicamente
compartimentalizao ocular, que permite a administrao direta com injees
na cavidade vtrea. O compartimento ocular livre de nucleases e molculas de
siRNA so internalizadas nas clulas-alvo. Essas vantagens tm sido exploradas
por drogas teraputicas que usam oligonucleotdeos, j comercializadas
(Vitravene, Novartis e Macugen, Pfizer). Com duplexes de RNA (siRNA), os
testes clnicos tm se concentrado no tratamento de doena macular relacionada
idade (AMD, do ingls age-related macular disease). O desenvolvimento de
vascularizao no fundo do olho, sobretudo em pessoas acima de sessenta anos
de idade, prejudica a viso nesses pacientes com AMD, e o tratamento com siRNA
visa silenciar a expresso de genes relacionados ao desenvolvimento de vasos,
como o receptor de VEGF-I (VEGF vascular endothelial growth factor). Testes
clnicos de fase II/III, empregando 217 pacientes, indicaram uma melhora na
acuidade visual em dois teros desses, demonstrando que essa tecnologia pode
estar prxima de ser aprovada para comercializao. Entretanto, existem alguns
problemas relacionados ao sistema de administrao (injeo intraocular), e,
curiosamente apesar dos resultados positivos, h polmica quanto ao fato de
parte dos efeitos se dever a respostas imunolgicas no especficas, e no ao
silenciamento especfico pela siRNA (Hubschman et al., 2009). Estudos similares
tm sido realizados empregando siRNA contra VEGF-A em pacientes diabticos
com edema macular.
Protocolos clnicos em fase II tambm esto sendo realizados para
combater infeces respiratrias por vrus respiratrio sincicial (RSV). Nesse caso,
molculas de siRNA contra genes virais so administradas atravs de inalao nos
pacientes. Aparentemente os vrus RSV replicam clulas epiteliais superficiais do
pulmo, que, por sua vez, so capazes de endocitar as duplexes de RNA, de modo
que o silenciamento viral eficiente. Testes clnicos com 88 indivduos adultos
sadios demonstraram que as molculas de siRNA foram seguras e houve nveis
significativamente menores de infeco em relao a indivduos que receberam
placebo (De Vincenzo et al., 2010).
O uso de RNA interferncia como antiviral tambm est sendo testado
clinicamente em terapia contra Aids. Nesses estudos, curiosamente, tm-se
usado vetores virais derivados de HIV (agente etiolgico da Aids) para expresso
de shRNA em clulas-tronco de pacientes. Esses vetores, conhecidos como

estudos avanados 24 (70), 2010 105

lentivrus, so capazes de se integrar permanentemente no genoma das clulas,
as quais so ento reimplantadas nos pacientes. Esse processo de transplante
autlogo produz clulas (e principalmente linfcitos T4, alvo do vrus HIV)
resistentes aos vrus, o que permite a recuperao do paciente. Dados tm sido
promissores indicando que, mesmo dezoito meses aps incio da terapia, as
clulas implantadas continuam a expressar o shRNA (Singh & Gaur, 2009).
Alm dos protocolos clnicos citados aqui, a tecnologia de RNA
interferncia ainda est sendo empregada em protocolos clnicos para outras
doenas, como hepatite B, diferentes tipos de tumores (incluindo melanoma),
hipercolesterolemia, injria renal aguda etc. Vrios so os genes-alvo testados
para combate o cncer: oncogenes, mediadores de ciclo celular e apoptose,
genes envolvidos em degradao e estabilidade proteica, angiognese, molculas
relacionadas invaso metasttica e adeso celular. Alm disso, nossa proposta
o uso de siRNA como coadjuvantes nos tratamentos teraputicos com radiao
ionizante e agentes quimioterpicos. Para tanto, estamos testando o silenciamento
de genes-alvo como aqueles que codificam protenas antiapoptticas, de
multirresistncia a drogas e mesmo envolvidas no reparo de DNA. Certamente,
pelo nmero de testes pr-clnicos que esto sendo realizados, a lista de doen-
as-alvo a serem testadas diretamente em humanos, empregando diferentes
estratgias de uso de RNA interferncia, dever ser bastante ampliada.
A corrida do ouro
no desenvolvimento de novas terapias com RNAi
A descoberta dos mecanismos de RNA interferncia, apesar de recente,
provocou uma verdadeira revoluo na forma como estudado o funcionamento
dos genes nas clulas e tambm abriu perspectivas de interveno direta na
ao gnica in vivo. Em vrios casos de doenas humanas, ocorre aumento de
expresso de determinados genes, e o controle desses pelo silenciamento aparece
como uma esperana na obteno de novas formas de terapia. A obteno de
inibidores qumicos continua sendo uma alternativa extremamente interessante
em vrias dessas doenas, porm o mecanismo de RNA interferncia fornece
uma abordagem simples (busca de complementaridade de sequncia) para obter
frmacos, ampliando seu potencial de uso e alcance. Esforos para uso dessa
nova biotecnologia na clnica tm correspondido a um dos mais importantes
exemplos recentes de medicina translacional, na qual o teste de laboratrio
transferido rapidamente para o leito do paciente. Os desafios ainda so grandes,
havendo necessidade de novas estratgias para maximizar a ao das molculas
efetoras dentro das clulas, assim como dos mecanismos de administrao e
entrega da molcula aos rgos-alvo. Vrias so as estratgias propostas, na
teoria, para o direcionamento dessas molculas de modo a garantir uma melhor
especificidade no tecido-alvo, mas h necessidade de testes que possibilitem a
demonstrao de efetividade na prtica.
Os desafios, porm, no parecem assustar as grandes empresas farmacolgicas

106 estudos avanados 24 (70), 2010

do mundo inteiro. Pequenas empresas montadas por pesquisadores esto
sendo adquiridas por empresas multinacionais, que esto investindo bilhes
em pesquisas de desenvolvimento, acreditando que as drogas e estratgias
desenvolvidas com a abordagem de RNA interferncia possam ter sucesso no s
para doenas especficas, como tambm criem modelos para outras doenas. Esses
investimentos tm sido to flagrantes que parecem uma nova corrida do ouro no
uso do conhecimento adquirido com dcadas de estudo do genoma humano,
na elaborao de novos frmacos. Entretanto, a aplicao de terapia baseada
em RNA interferncia deve ser analisada com cautela, visto que ainda requer
intenso trabalho de pesquisa em todo o processo de elaborao de protocolos
teraputicos. O Brasil continua incipiente nesses estudos, de modo que apenas
alguns grupos de pesquisa, nas universidades, tm o domnio da tecnologia para
uso de RNA interferncia. Um nmero ainda menor est envolvido diretamente
no desenvolvimento de tecnologias novas empregando essa abordagem. Se esse
verdadeiro silenciamento intelectual continuar na rea, teremos que pagar caro
pelas patentes e pelo uso dos novos medicamentos que muito provavelmente
nos sero vendidos nas prximas dcadas.

Referncias
DE VINCENZO, J. et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of an
RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, v.107, p.8800-5, 2010.
ELBASHIR, S. M. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in
cultured mammalian cells. Nature, v.41, p.494-8, 2001.
FIRE, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in
Caenorhabditis elegans. Nature, v.391, p.806-11, 1998.
HUBSCHMAN, J. P. et al. Age-related macular degeneration: experimental and emer-
ging treatments. Clin. Ophthalmol., v.3, p.167-74, 2009.
LIU, J. Control of protein synthesis and mRNA degradation by microRNAs. Curr.
Opin. Cell Biol., v.20, p.214-21, 2008.
SINGH, S. K.; GAUR, R. K. Progress towards therapeutic application of RNA interfe-
rence for HIV infection. BioDrugs, v.23, p.269-76, 2009.
TIEMANN, K.; ROSSI, J. J. RNAi-based therapeutics-current status, challenges and
prospects. EMBO Mol. Med., v.1, p.142-51, 2009.

resumo A descoberta de que nossas clulas dispem de um mecanismo de silencia-

mento gnico empregando RNA interferncia ainda muito recente. Apesar disso, em
menos de uma dcada a investigao cientfica j alcanou progresso, suficiente para
muito brevemente nos apropriarmos desse conhecimento com fins teraputicos. Du-
plexes de RNA so potenciais frmacos e h investimentos altos nessa nova abordagem.
Aparentemente, a promessa de terapia gnica parece finalmente atingir sua maturidade
com essas novas ferramentas.

estudos avanados 24 (70), 2010 107

palavras-chave: RNA interferncia, Silenciamento gnico, Cncer, Terapia gnica, In-
feco viral.
abstract The discovery of gene silencing mechanisms in our own cells using RNA
interference is very recent. However, in less than a decade, the scientific investigation
have progressed enough to make us see that, very soon, we will use this knowledge for
therapeutic purposes. RNA duplexes are potential pharmaceutical drugs and there are
high investments in this new strategy. The promising gene therapy seems to finally reach
maturity with these new tools.
keywords: RNA interference, Gene silencing, Cancer, Gene therapy, Viral infection.

Carlos Frederico Martins Menck professor do Departamento de Microbiologia do

Instituto de Cincias Biomdicas (ICB) da Universidade de So Paulo.
@ cfmmenck@usp.br
Recebido em 21.9.2010 e aceito em 27.9.2010.

108 estudos avanados 24 (70), 2010