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ndice
Introduccin..2
Resultados y Discusin3
Conclusiones
Referencias Bibliogrficas.
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Laboratorio de Biologa Molecular 2017-II
Introduccin
Cuando se trabaja con ADN, en la mayora de los casos, es importante realizar una
cuantificacin de la cantidad de ADN que se obtiene. La cuantificacin del ADN se puede llevar
a cabo de diversas maneras, por ejemplo, una de ellas es la estimacin de la intensidad de una
banda en geles de agarosa en el que se ha teido el ADN con algn colorante como el Bromuro
de Etidio, Syber Green o Gel Red, o como en el caso de esta prctica, usando espectrofotometra
de luz ultravioleta.
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Resultados y Discusin
Anlisis espectrofotomtrico de ADN
Se realiz una primera dilucin con relacin 1:5 de los DNA vegetal y DNA animal
obtenidos en la prctica anterior en solucin C, para medir las absorbancias de dichas
diluciones a 260nm, lo cual nos mostr los siguientes resultados:
Tabla1.
Absorbancia a 260nm
de la dilucin 1
DNA animal 0,745
DNA 0,391
vegetal
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Ya obtenida las dos diluciones a una absorbancia cercana a 0.500, se prepar una
batera de tubos los cuales presentaron el siguiente contenido:
Tabla 2.
Muestra B 1 2 3 4
Solucin C (mL) 2.0 -- -- -- --
ADN Argopecten -- 1.0 1.0 -- --
diluido (mL)
ADN Pisum diluido -- -- -- 1.0 1.0
(mL)
Agua destilada (mL) -- 1.0 -- 1.0 --
NaOH (mL) -- -- 1.0 -- 1.0
Tabla 3.
A 260nm A 280nm
ADN Animal H2 O 0,438 0,228
NaOH 0,464 --
ADN Vegetal H2 O 0,212 0,136
NaOH 0,205 --
Con los datos obtenidos se realizaron los siguientes anlisis para poder caracterizar al
DNA:
0.4640.438
[ ]x100- 100 =94.6%
0.438
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0.2050.212
[ ]x100- 100 =-10
0.212
b) Concentracin de la muestra:
1/10 . 0.745A
**1 . 7.45A
1mg/ml .. 27 U de absorbancia
X . 7.45 U de absorbancia
X = 0.276 mg/ml
1/10 . 0.391A
**1 . 3.91A
1mg/ml .. 27 U de absorbancia
X . 3.91 U de absorbancia
X = 0.145mg/ml
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** El producto por dos y cinco se derivan del nmero de diluciones y la dilucin 1:5
realizada al inicio de la prctica.
Tabla 4.
Absorbancia Concentracin
A 260nm (gm/mL)
ADN animal 0.438 0.276
ADN vegetal 0.212 0.145
2. Rendimiento:
Tabla 5.
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C.Grado de pureza:
Tabla 6.
Como nos menciona la gua debemos obtener valores cercanos a 2,de no ser asi esto indica la
presencia de contaminantes en el caso del ADN animal obtenemos un valor bastante cercano a 2.Lo
que indicara un ADN no contaminado pero como observamos en a)estado del ADN nuestro ADN se
animal estara desnaturado pero no estara contaminado.
En el caso del ADN vegetal obtenemos un valor menor a 1.8 lo que nos indicara la presencia de
protenas que son los principales contaminantes del ADN esto se podra deber a que cuando
realizamos la practica quizs no aplicamos la suficiente sustancia B para la correcta deshidratacin de
las protenas o no se retir el precipitado(protenas)correctamente.
DNA animal:
DNA vegetal:
Tabla 7.
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Accin de nucleasas
Tabla 8.
Muestra B 1
Buffer Ph 9.0 (ml ) 3.0 1.4
DNA ( ml ) 1.5
Tabla 9.
Tabla 10.
Tubo B 1 2
Sustrato sinttico 0.5 0.5 0.5
Buffer pH 8.5(mL) 0.5 0.4 0.4
Nucleasa(2mg/mL) - 0.1 0.1
Registramos las siguientes absorbancias a 400 nm enlos dos tiempos de incubacin (se
agreg NaOH cumpliendo dicho tiempo logrando detener la reaccin), obteniendo los
siguientes resultados:
Tabla 11.
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En el tubo 2 la enzima tuvo ms tiempo para actuar por ello hay mayor
presencia de producto eso se demuestra en la coloracin ya que este
presenta una coloracin amarilla ms fuerte y en el tubo uno el amarillo es
ms tenue. Y en la tabla 11 a medida que aumente la prescencia de
producto tambien ser mayor la absorbancia.
Tubo 1:
Tubo 2:
2 mg 1 mL
x mg 0,1 mL
X = 0,2 mg
Tabla 12.
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Discusin de resultados
Estado de DNA
Sin embargo nuestros resultados ( de todos los grupos) no se muestran acorde a la teora, esto puede
ser debido a diversos factores, los cuales mencionaremos a continuacin:
La falta de experiencia de los alumnos en la extraccin del ADN, lo cual pudo ocasionar que no
procedieran de la manera correcta durante el agregado del etanol y el enrollamiento del ADN ,
contaminando de esa manera la muestra. As mismo, estabilidad de la doble hlice del ADN depende
de varios factores como la naturaleza del solvente , las identidades y las concentraciones de los iones
en solucin y el pH. (2)
b. Concentracin de la muestra
Siendo la concentracin para el ADN animal 0.276 mg/ml y para el ADN vegetal 0.144
mg/ml. Tambin se hall el rendimiento del mtodo usado (mediante solventes orgnicos):
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La extraccin de ADN por un kit comercial y el mtodo salting out tuvieron como resultado
una concentracin promedio de 0.268 mg/ml y 0.439 mg/ml respectivamente, mientras el
mtodo orgnico se obtuvo un promedio de 0.285 mg/ml. El mtodo salting out se obtuvo
una buena concentracin respecto a los otros mtodos utilizados, con mejores resultados con
respecto a la extraccin por el mtodo orgnico. Adems, el mtodo de salting out es ms sencillo
y menos txico que el sistema convencional de fenol - cloroformo o la variacin cloroformo - alcohol
isoamlico.2
El rendimiento del mtodo para el ADN animal 1.104 y para el ADN vegetal 0.089.
En este
El
estudio
se
utilizaron
1
Gmez Camargo, D., Baena Del Valle, J., Gmez Alegra, C. and Ramos Moreno, . (2013). Comparison of DNA
extraction methods from formalin-fixed paraffin sections for RCP amplification. Pg.177
2Gmez Camargo, D., Baena Del Valle, J., Gmez Alegra, C. and Ramos Moreno, . (2013). Comparison of DNA
extraction methods from formalin-fixed paraffin sections for RCP amplification. Pg.178
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c.Grado de puerza
Para nuestras muestras, en ambos casos, se puede observar una contaminacin por protenas
relativamente baja para la muestra animal, pero bastante alta para la muestra vegetal.
Comparando estos resultados obtenidos con la concentracin de DNA en la muestra se
comprueba que nuestra muestra de DNA animal posee pocos contaminantes, sin embargo se
encuentra altamente denaturado y que la muestra de DNA vegetal se encuentra denaturado y
altamente contaminado por protenas, este resultado se puede explicar debido errores en el
desarrollo de la extraccin de DNA en la prctica pasada cuando se agreg la solucin de
cloroformo-alcohol isoamlico y no se agit correctamente provocando que los aminocidos de
la protena desnaturalizada formaran puentes de hidrgeno con el DNA y tambin a la presencia
de pequeos contaminantes en los tubos de ensayo usados en la prctica de hoy.
d.Accion de nucleasa
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e. en sustrato sintetico
Para tal fines se usa el mtodo de ensayo de la actividad de esta enzima que emplea como sustrato
un ster de fosfato artificial sinttico , el bis p-nitrofenilfosfato , cuyo hidrolisis da lugar a fosfato y a
p-nitrofenol .Este ltimo compuesto adquiere color amarillo a PH alcalino por lo que se puede
cuantificar a 405 nm (1)
A simple vista se pudo constatar la reaccin de la nucleasas , ya que las condiciones de la muestras
con buffer alcalino no vario mucho con la presencia de iones fosfatos de carcter acido lo cual hizo
posible la coloracin amarillo del producto formado . Hecho que tambin se pudo cuantificar
mediante un anlisis espectrofotomtrico
En el caso de la actividad enzimtica se us NaOH 0.1 n como un tipo de inhibidor ya que altera el
buffer alterando a la misma enzima sin embargo segn otras fuentes la reaccin tambin poda ser
detenida al aadir fosfatos que por el exceso de este producto de la reaccin inhibe la actividad
enzimtica (1)
En la prctica se compar las absorbancias en los tubos 1 y 2 los cuales contenan el mismo volumen
de sustrato sinttico , buffer y nucleasas sin embargo se diferenciaban en el tiempo de incubacin . A
partir de este ultimo dato se esperaba que la absorbancia en el tubo 2 fuese el doble al del tubo 1
debido al doble de tiempo de incubacin ( 6 y 3 minutos ) .Los resultados no fueron los esperados lo
cual se podra deber a que no se midi la absorbancia inmediatamente , repercutiendo un mayor
tiempo de incubacin y por lo tanto ms tiempo de reaccin de la enzima en el tubo 1 .
Respecto a la actividad especfica, el cual no debera variar con el tiempo de incubacin , debera ser
lo mismo al haber una relacin directamente proporcional en el tiempo y la absorbancia . Nuestros
resultados difieren puesto que no se obtuvo la relacin 2:1 esperado en las absorbancias
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Conclusiones
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Referencias Bibliogrficas
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