Tema 17.

1: Cultivos de clulas, Tejidos y rganos:

Nutrientes constituyentes de los medios y la
preparacin, explantes y Crecimiento de cultivos
Los Factores clave para la manipulacin y cultivo
de la clula vegetal, tejidos y rganos:

1. Medios nutritivos:
Medios de Cultivo de Tejidos Vegetales: los
principales componentes, su preparacin y algunas
aplicaciones (Huang y Murashige, 1977) - describe
las categoras de los componentes del medio y la
preparacin de medios de cultivo

Preparacin de las soluciones de stock:

preparacin de la solucin stock y el
almacenamiento y una lista detallada de los
medios publicados. El medio de cultivo tisular son en su mayora de constitucin qumica
definida.

Composicin de Medios nutritivos para cultivos deTejidos Vegetales

Los componentes esenciales de todos (la mayora) de los medios de nutrientes para los
cultivos de tejidos vegetales incluyen nutrientes: inorgnicos (nutrientes minerales) y
orgnicas (fuente de carbono, reguladores de crecimiento):

I. Sales inorgnicas I. / nutrientes minerales

A. Composicin, esencial micro y macronutrientes: Un nutriente que se considere
esencial, si: una. que requiere la planta para completar su ciclo de vida y / o que es
parte de una molcula que es un constituyente esencial una planta o metabolito, un
cofactor, osmolito, etc
Macronutrientes (requiere un contenido en la planta de 0.1% o % por peso en
seco) - C, H, O, P, K, N, S, Ca, Mg
Micronutrientes (requiere ppm/peso en seco) Fe, Mn, Zn, Cu, B, Cl, Mo
Na, Se y Si son esenciales para algunas plantas.
El medio mas clsico es uno basado en hojas de tabaco (MS) callo contenido en cenizas. Y
luego

B. La cantidad y la forma de nutrientes: Formulaciones de sal de medio de cultivo

tisular difieren en la cantidad (White vs MS, basado en el tabaco callo contenido de
cenizas), ver ejemplos de macro y micro nutrientes y la forma (N, Gautheret (NO3-) vs
MS (NO3-y NH4 +)) de un nutriente esencial que se suministra.
Medio MS se formula a partir de las cenizas de callo de tabaco. La mayor
concentracin de sales mejoradas sustancialmente la divisin celular.
C. Optimizacin de formulaciones: Optimizacin de formulaciones de sal - pH, la
estabilidad qumica, las respuestas fisiolgicas Comparar las formulaciones existentes
- variar en forma y cantidad Comparar diluciones de las formulaciones existentes - la
composicin nutricional equilibrada

I. La forma de nitrgeno - por ejemplo,

NH4 + estimula la organognesis y
embriognesis de NO3-callo de
zanahoria, afecta el pH y la iniciacin de
las races (NH4 + - pH , NO3-- pH),
vase el ejemplo:NH4 + y NO3-medio
regulador de pH and Root morfognesis
de Brotes de Rosa

II. Estabilidad del hierro - formas de quelato son ms estables qumicamente en el

medio de formas no quelados. Afecta mucho a los cultivos. Los quelato de hierro es
muy labil y a las dos semanas se
degrada. Cuando este se degrade el
hierro ya no se puede absorber por la
planta. Entices puede haber cultivos
con clorosis. Para evitar eso se utiliza
un componente parecido al quelato de
hierro pero es mas compacto y mas
estable para que el cultivo persista
durante mas tiempo. Este compuesto
se llama secuestrene.

III. Absorcin de K + - inhibida competitivamente por Na + y esta inhibicin se reduce

por Ca2 + K+ Absorption into Excised Barley Roots Is Modulated by [Na+]ext and
[Ca2+]ext

II. Constituyentes orgnicos:

A. Fuente de carbono: los cultivos de tejidos son generalmente heterotrfica,
que requiere una fuente de carbono

La sacarosa, o glucosa + fructosa - 20 a 60 g / L

(sacarosa 58 a 175 mM), sacarosa en el medio
est agotada y se invierte rpidamente por las
clulas poir las invertasas que estn en la pared
de las celula s vegetales que lo que hacen es
descomponer la sacarosa y la transforman en
glucaos ay frutosa que pueden ser usados por las
plantas

vase el ejemplo Intracelular sacarosa

Captacin e Inversin Durante un perodo de
cultivo. La Sacarosa se ha de poner en el medio de cultivo de un tejido vegetal porque
esots meristemos obtenidos a partir de un trozo de raz o tallo, estos si los separamos de la
planta no fotosintetizan con lo cual hay que suministrarle sacarosa porque son cultivos
hetertrofos en cierto modo porque al separarlos de la planta los forzamos a ser
hetertrofos. En otrs se le puede meter galactosa.

Adems el hecho de meter 20 a 60 g/l de fuente de carbono, crea un potencial osmtico

fuerte con lo cual el material que estamos cultivando ha de aguantar mucha potencia
osmtica.
EN LA GRAFICA DE ARRIBA VEMOS : un ejemplo en hojas de
tabaco en un periodo de 167 diasde crecimiento la sacarosa se
consume y la glucosa y frucota aumentan como cosnecunecia
del metaolismo de esos carbohidratos.

km = 1,3 g / l (3,7 mM) para la absorcin de sacarosa por las

clulas, es decir, la tasa de crecimiento celular no es de
carbono limitado.

Lmites de carbono de la biomasa de acumulacin vfbut No

Tasa de Crecimiento: Aumento exponencial peso seco de
las clulas de tabaco crecen en cultivo discontinuo. Los
niveles de sacarosa iniciales fueron 10 (), 20 (), 30 (),
40 (), y 50 () g L-1. Cada punto representa la media de
dos muestras replicadas de un solo matraz. Km para la tasa
de crecimiento es de 1,3 g / l (3,7 mM) de sacarosa
La galactosa y ribosa: utilizado en algunos casos pero no
ptimo para el crecimiento de las clulas vegetales

Las Clulas fotoautotrofas:- 1-2% de CO2 y de alta intensidad

de la luz (100 E m-2 S-1 vs 25 m2 E S-1), tiempo de
duplicacin exponencial 4X ms largas que las clulas
hetertrofas (8 frente a 2 das).

B. Reguladores de crecimiento :principalmente auxina (elongacin celular /

expansin) y citoquinina (divisin celular), las clulas y los tejidos cultivados son
generalmente auxina y citoquinina que requiere (auxotrfico)

1. Las auxinas (las utilizamos para producir embriognesis y

callogenesis)- IAA (indol-3-actico), (auxina natural, sintetizada
principalmente a travs de la va de cido shikmico, precursor
triptfano, formas conjugadas) y la IBA (cido indol-3-butrico),
tambin un derivado de indol - 0,1 a 10,0 mg / L (concentraciones
eficaces) y 2,4-D (cido 2,4-diclorphenoxyacetic), dicamba,
Pichloram (auxinas fenlicos sintticos, herbicidas) y NAA (cido
1-naftalenactico) - 0,001 a 10,0 mg / L, ver ejemplos de naturales (indol) y (fenlicos)
auxinas sintticas
 Actividad relativa - 2,4-D(
como es mas difcil de
metabolizar su efecto es
mas duradero,es mas
estable) NAA IBA
IAA; puede estar
relacionado con la
estabilidad qumica

Estabilidad relativa de
auxinas a la Luz
La auxinas pueden estn presentes desde 0,01 hasta
5mg.
Y als auxinas natiurales son mas
sensibles a la luz, entonces en la
grafica vemos como despus de estar expuesto 12 dias a
la luz un cultivo, el IAA (indolacetico) va bajando
mientras que el 2,4D se mantien constante.

Ilustracin 1: auxinas

Luz = 2000 lux de iluminacin fluorescente; Ensayos de qumica - GLC / espectrofluorimetra

biolgica - Avena coleptilo prueba curvatura Yamakawa et al. (1979) Ag Biol. Chem. 43:879-880

2. Las citoquininas - Grupo R w/N6 adenina, o derivados de fenilurea - 0,03 a 30,0 mg / L

(no se pueden degaradar facilmente puesto que son sintticas)
a) adenina citoquininas derivados - zeatina, 2iP (naturales) w / grupo R a travs
de la va isopreno (pueden existir en vivo como ribosides), tambin quinetina y
benciladenina (sinttico), vase el ejemplo
b) citoquininas derivados de fenilurea - thidiazuron, difenilurea. Elevado efecto
en la multiplicacin del tallo.
c) Metatopolina que se puede utilizar a mayores concentraciones que la
benzyaldenina efectos txicos. Es un derivado de la benzyaldenina

Actividad biolgica relativa - zeatina 2-iP/phenylureas BA kinetina kinetina y BA son

qumicamente ms estables
 3. Las giberelinas - 0,01 a 1,0 mg / l, tpicamente GA3, pero en
algunos casos gibberellins4-7. Ningn otro regulador del
crecimiento se utiliza tpicamente en planta de medio de cultivo
tisular

C. Vitaminas: p 15 a 17 de la solucin madre preparacin folleto

La tiamina-HCl - 0,1 a 1,0 mg / L, slo se conoce la vitamina requerida
Otros - cido nicotnico, piridoxina-HCl, glicina (aminocido en la formulacin de la
vitamina de las blancas)

D. Los aminocidos / amidas - 100 mg / L o mayor

Tirosina - iniciacin rodaje
Glutamina / asparagina / prolina - embriognesis cereales
Cultivos de races - Serina

E. Hexitoles:10 a 100 mg / L o mayor

myo-inositol - aditivo en general
Sorbitol / manitol - estabilizadores osmticos

F. Otros
Purinas / pirimidinas - 50 mg / L o mayor
Los cidos orgnicos (antioxidantes) - 50 mg / L o mayor
Tampones (capacidad a pH fisiolgico). Se usan para evitar que el medio de cultivo
se altere, como por ejemplo que no se alteren la composicin de azucares y que no
vare el pH.
Adsorbentes (PVP, carbn vegetal) - 0,03 a 1,0%

IV. Complejos naturales (100 a 20000 mg / L)

endospermo de coco
Los hidrolizados de protenas
extractos de frutas
etctera

V. Agentes de soporte fsico:

Agentes gelificantes A. - (de 2 a 12 g / L) - agar (grado bacteriolgico o mayor
pureza), agentes gelificantes de polisacridos sintticos
Soportes fsicos: puentes de papel filtro, sistemas de apoyo de la membrana
permeable a los lquidos

VI. Preparacin de Medios

*Basales / constituyentes esenciales de todos (la mayora) los medios de comunicacin
1) Mtodo de preparacin - qumicos de grado reactivo, agua destilada desionizada
Formulaciones premezcladas - completa, o sales o orgnica componentes
 Las soluciones madre - facilita la adicin de pequeas cantidades y la eficiencia de la
preparacin de los medios de comunicacin
Sales - la compatibilidad qumica, por ejemplo, Ca2 + VS PO43-o SO42-, quelatos
de Fe, 100X
Organics - co-disolventes orgnicos como DMSO o etanol o ionizacin de la
molcula por cambio de pH, 10X.

2) pH de Medios nutritivos - pH puede ser de 5,0 a 6,0 en el arranque, pero puede variar
desde 4,0 hasta 6,0 durante el perodo de cultivo y esto se ve afectado por los
componentes en el medio, ver ejemplo influencias de pH en material de plantas o la
estabilidad qumica de los componentes del medio

3) Cantidad de Medium - requisito de carga mnima y tejido ganancia de masa se correlaciona

con el tamao del inculo.

4) La esterilizacin de los medios de comunicacin

1. Esterilizacin trmica - 121 C, 15 lbs/in2, 15 a 20
minutos para el volumen 2L, la mayora de los
componentes de la planta de tejido de medios de
cultivo son relativamente estables al calor;
excepciones notables son azcares reductores
(glucosa y fructosa) y antibiticos;
Azcares reductores - interacciones con
aminocidos / sales
Los aminocidos - inactivacin por la
interaccin con azcares / reaccin de
Maillard
Los reguladores de crecimiento - todos lo suficientemente estable
biolgicamente para la esterilizacin en autoclave, sin embargo, las giberelinas
son qumicamente inestables
2. Membranas de 0,22 o 0,45 m de malla, antibiticos - Filtro de esterilizacin
3. Irradiacin gamma - radioesterilizacin
4. Esterilizacin Gas - xido de etileno
Hay casos en que no se correlacionan estabilidad qumica y la actividad biolgica, vase el
ejemplo

4. Los explantes Cultura

Explante - parte de una planta, rgano o tejido que se inocul en cultivo, eleccin de
explante tpicamente se basa en el tipo de crecimiento o diferenciacin que se desea
1) Eliminacin de contaminantes microbianos
contaminantes de la superficie - principalmente saprofitos microbianas que se
eliminan por la esterilizacin de superficie, ver ejemplo
Contaminantes internos - principalmente patgenos que se eliminan por la
termoterapia (35-40 C) y la cultura de forma gratuita de los organismos o de los
antibiticos explantes
2) El mantenimiento de la asepsia (exento de microorganismos) durante la escisin y la
cultura - los procedimientos se llevan a cabo en la campana de flujo laminar de presin
positiva estriles (0,3 m filtros HEPA)

5. Entornos Crecimiento Cultura:

1) Temperatura - Muy genotipo dependiente
Absoluto - 22-28 C
Constant, diurna
estacional
2) iluminacin
Calidad - races - luz roja y dispara - UV y la luz azul
Intensidad - intensidad de la luz baja,1.000 lux o 20 m E-1-2
El fotoperiodo - 16 horas / todos los das
3) humedad : Demasiado alto - la contaminacin, tambin baja - media
deshidratacin
4) Los gases atmosfricos: Poco se sabe a excepcin de CO2 para las clulas
auttrofas, tejidos, etc gases del espacio de cabeza pueden afectar el crecimiento y
el desarrollo.

Estos factores son determinados experimentalmente para optimizar el crecimiento

y el desarrollo, incluida la regeneracin

Las auxians sisnteticas como el 2,4D: es conveniente poruqe es muy difcil o imposible de
matablizar con lo cual su efecto va a persistir mucho y siu capacidad