L A B-act a 2 00 6 ; 1 8 : 4 3 - 6
Identicacin forense
de uido seminal
Gabriel Mayoral-Andrade,1,2
Eduardo Prez-Campos-Mayoral,2
Luca Martnez-Martnez,3 Pedro Hernndez-Cruz,3
Eduardo Prez-Campos1,3
1. Unidad de Bioqumica e Inmunologa ITO-UNAM, Oaxaca, Mxico.
2. Laboratorio de Patologa Clnica Dr. Eduardo Prez Ortega.
3. Centro de Investigacin en Ciencias Mdicas y Biolgicas,
Facultad de Medicina. UABJO.
INTRODUCCIN
El riesgo mundial de sufrir una violacin es cuatro veces ms
en la mujer que en el hombre. En una encuesta entre es-
tudiantes en Mxico se encontr una prevalencia de 4.3%,
no habiendo diferencias estadsticamente significativas en el
sexo.(1) La edad ms frecuente es entre 16 y 24 aos de edad.
El tipo de victimizacin corresponde en orden de frecuencia a
violacin, abuso sexual, tentativa de violacin, y estupro.(2)
Ms del 70% de personas que han sido violadas, nun-
ca pensaron que pudiera sucederles. Cerca de 75% de todos
los casos de violacin son cometidos por conocidos de la vc-
tima.
En consideracin a lo anterior se hace necesario que los
rganos de procuracin de justicia en el pas tengan herra-
mientas para el estudio cientfico de este tipo de problemas.
Aqu hacemos una revisin de diversas tcnicas empleadas por
la ciencia forense en el estudio del fluido seminal.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA O
MANCHAS DE EVIDENCIA
Las muestras obtenidas de las manchas de evidencia o tra-
zas de evidencia se debern emplear para: examen microsc-
pico con objeto de visualizar espermatozoides, identificar fos-
fatasa cida como prueba presuntiva de presencia de semen,
e identificacin de antgeno prosttico especfico como prue-
ba confirmatoria. Las muestras extradas de la escena del cri-
Correspondencia: Dr. Eduardo Prez-Campos, Centro de Investigacin en
Ciencias Mdicas y Biolgicas. Facultad de Medicina. Universidad Autnoma
Benito Jurez de Oaxaca. Ex-Hacienda de Aguilera s/n, Carretera a San Felipe del
Agua, Oaxaca, 68020, Mxico. Correo-e: perezcampos@prodigy.net.mx
L A B O R AT-ac ta Vo l . 18 N m. 2 2006
especial
ABSTRACT
A review of some methods used to detect seminal uid in rape ca-
ses. Cytological examination of spermatozoa, detection of acid phos-
phatase, and immunoassays for prostate specic antigen (PSA) to
provide forensic evidence among the most important in forensic iden-
tication. Also we mention some techniques DNA-based human iden-
tication.
Keywords. Forensic identication. Seminal uid. Prostate specic
antigen. Acid phosphatase. Short tandem repeats. Rape.
RESUMEN
Presentamos una revisin de los mtodos empleados para detectar
e identicar el uido seminal, como es el examen microscpico, de-
teccin de fosfatasa cida y el antgeno prosttico especco. Adicio-
nalmente comentamos respecto a las tcnicas basadas en el DNA
para la identicacin de individuos.
Palabras clave. Forense. Fluido seminal. Antgeno especco de
prstata. Fosfatasa cida. Espermatozoides. Secuencias cortas repe-
tidas en tndem. Violaciones.
men sirven para efectuar anlisis del DNA de los sospecho-
sos, mediante PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) y
RFLPs (patrones de fragmentos de restriccin).
La recoleccin de la evidencia debe considerar hisopos
vaginales, orales, anales y peinado pbico, adems de mues-
tras del cabello de la cabeza y pubis como controles, mues-
tras de saliva, muestras de sangre, huellas digitales y ropa.
En el caso de ropa u otros materiales, la localizacin de
la mancha de evidencia se puede hacer mediante luz fluo-
rescente. El espectro de excitacin de las muestras de semen
tiene longitudes de onda que van de 350 nm (UV) a 500
nm (azul-verde). Cuando las manchas de evidencia estn
sobre algodn blanco la ptima condicin de observacin es
de 505/555 nm (Ex/Em) y cuando la tela tiene un satinado
rosa la ptima condicin queda en 450/530 nm.(3) Aunque
se ha reportado que el semen es fluorescente a la luz ultravio-
leta emitida por una lmpara de Wood, se ha mostrado que
hay significativa inespecificidad en la fluorescencia debido al
empleo de aceites o cremas.(4)
Por ltimo, se debe sealar que todas las muestras deben
de colectarse en contenedores hermticos, para que no se con-
taminen.
43
 Identicacin microscpica de espermatozoides
Gabriel Mayoral-Andrade y cols
El semen est constituido por espermatozoides y plasma se-
minal. Entre 15 a 30% del volumen del semen proviene de
la prstata, 60-70% de las vesculas seminales y slo 10%
proviene de epiddimo. El espermatozoide tiene una cabeza,
una pieza media y un flagelo. La cabeza est constituida por
el acrosoma y el material gentico, y la pieza media tiene em-
paquetadas las mitocondrias.
Cuando el hombre eyacula, los espermatozoides tienen
un mximo de supervivencia dependiendo de la regin del
cuerpo donde se depositan; la posibilidad de encontrarlos de-
pende fundamentalmente de que se haya o no realizado lim-
pieza. La duracin aproximada en canal endocervical es de
114 h, en fondo de saco vaginal 120 h, rectal 65 h, anal 46
h, y en la boca de 6 h. En el caso de nios, si no se recolec-
ta la evidencia antes de las 24 h es mejor no recolectarla.(5)
El estudio citolgico en busca de espermatozoides es un
estndar de oro aun si otros mtodos son empleados.(6)
Entre los procedimientos que se han utilizado para la
identificacin de espermatozoides en las muestras de fluido
vaginal estn la tincin de hematoxilina-eosina, la tincin
de Christmas tree (rojo rpido nuclear/picroindigocarmi-
na) y fuscina alcalina. Tambin se han empleado variantes de
Giemsa-May-Grumwald, vgr: Diff-Quick, que emplea eosina
G y verde rpido.(7) La tcnica de Papanicolaou no se reco-
mienda como rutina en una tcnica forense.(8) De las tcnicas
anteriores, de preferencia se debe emplear la de hematoxilina-
eosina y la tincin de Christmas tree.(9)
El anlisis de clulas epiteliales glicogenadas (median-
te tincin con cido peridico de Schiff ) en objetos de evi-
dencia ha sido empleado para indicar una insercin vaginal,
este procedimiento se usa particularmente en cadveres.(10)
Fosfatasa cida
La fosfatasa cida es una fosfomonoesterasa no especfica, se-
cretada por la glndula prosttica, est presente en grandes
cantidades en el fluido seminal. Se puede encontrar en otros
fluidos en muy bajas concentraciones. Aunque es muy raro, se
han descrito casos de hombres con muy baja concentracin de
fosfatasa cida y mujeres con alta concentracin de ella.(11)
Su identificacin es de mucha ayuda en casos de viola-
ciones, en ellos, la presencia de semen debe confirmarse en
forma adicional por otro mtodo como: 1) La identificacin
microscpica de espermatozoides, 2) antgeno especfico de
vesculas seminales, y/o 3) la cuantificacin de antgeno pros-
ttico especfico.(12)
La muestra de evidencia de la secrecin vaginal, obte-
nida mediante una sonda o mediante un hisopo humedeci-
do con solucin salina, con el que se limpi la mancha de
evidencia, se deber frotar sobre un papel filtro en donde se
realizar la prueba. Otra forma de procesar la muestra, es pre-
sionando un papel blanco absorbente hmedo, sobre la su-
44
perficie que se sospecha que contiene semen o fluido vaginal.
Considerando que la fosfatasa cida es una protena soluble
al agua, sta se absorbe rpidamente al papel. Ya sobre ste se
hace la reaccin. Es decir, la bsqueda de fosfatasa cida nun-
ca deber hacerse directamente sobre la prueba de la mancha
de evidencia.(13)
El principio de los mtodos se basa en que la fosfatasa
cida, cataliza en medio cido la hidrlisis del alfa-naftil fos-
fato. El alfa-naftol producido, reacciona con una sal de dia-
zonio (Fast Red TR) formando un cromgeno prpura. En
algunos mtodos se les adiciona pentanodiol, para acelerar la
reaccin al actuar como aceptor del fosfato. El tartrato se pue-
de emplear como inhibidor especfico de la denominada frac-
cin prosttica.
Una reaccin positiva significa la presencia de fosfatasa
cida. La positividad para la fosfatasa cida slo puede estar
dada por tejido prosttico, tejido de bazo, de hgado o de ri-
n, es decir el nico lquido que puede ser aplicado o dis-
persado como tal es el lquido proveniente de secrecin genital
prstata-seminales-testculo. Por lo que una prueba positiva
se interpreta como la presencia de semen.
La cuantificacin de fosfatasa cida es un indicador ms
sensible de semen, que la identificacin de espermatozoides
en el fluido vaginal,(14) incluso puede ser un indicador del
tiempo aproximado del coito.(15)
Antgeno prosttico especco
El antgeno prosttico especfico (PSA) es una glicoprotena
de la familia de las serino proteasas, tambin conocido co-
mo antgeno p30.
Idealmente cuando la eyaculacin ocurre, se deben iden-
tificar los espermatozoides en la muestra de la vctima, sin em-
bargo cuando el agresor se ha realizado vasectoma, la mues-
tra puede no contener espermatozoides, en estos casos es de
utilidad identificar fosfatasa cida y el PSA.
El tiempo promedio en que desaparece la fosfatasa ci-
da en muestras vaginales es de 14 h, mientras que el PSA se
puede encontrar todava a las 27 h. La medicin o identifica-
cin del PSA se considera una prueba confirmatoria.
El PSA se encuentra en bajas concentraciones, menor a
1 ng/mL en leche materna, glndulas peri-uretrales, y fluido
amnitico. En orina femenina se han encontrado valores en-
tre 0.12-1.06 ng/mL,(16) e incluso ligeramente mayores, con
un promedio de 3.72 ng/mL.(17) Por otra parte, se ha medi-
do mediante inmunoensayo enzimtico, que el punto de cor-
te del PSA en secrecin transvaginal es de 1.77 mg/mL en
muestras extradas en un rea de 0.5 0.5 cm. de la prenda
de vestir y preparadas en volmenes de 1.5 mL de PSA.(18) A
diferencia de las secreciones antes mencionadas, en semen el
promedio de PSA es de 820 000 ng/mL.(19)
Tomando en cuenta que los niveles en las muestras de
evidencia son mayores de 4 ng/ml de PSA, en los ltimos
L AB O RAT- a cta Vo l. 18 N m . 2 2 0 0 6
aos se han empleado como mtodo alterno la inmunocro-
matografa cualitativa de muestras extradas con HEPES-sa-
lina provenientes de hisopos. Estas mismas muestras pueden
ser adecuadas para la extraccin de DNA.(20)
Al comparar los mtodos citolgicos con la medicin de
fosfatasa cida y la cuantificacin de PSA a dos diferentes
tiempos (0 y 24 h), se ha reportado una sensibilidad para las
tres pruebas, al tiempo 0, de 67.5, 96 y 99.4%, respectiva-
mente, en comparacin con las 48 h, la fosfatasa cida, baja
a 40.3% y el PSA disminuye discretamente a 96%. Adems
el PSA proporciona buenos resultados cuando la muestra pro-
viene de sujetos oligosprmicos o azozprmicos.(7)
Otras molculas
Con objeto de mejorar la especificidad y sensibilidad en la de-
teccin de semen, se ha empleado la cuantificacin de un ant-
geno especfico de vesculas seminales (SVSA), las ventajas son
su especificidad y que permite la deteccin en semen diluido
ms de un milln de veces, sin embargo hay interferencia con
algunas protenas presentes en el fluido vaginal.(21)
Existen algunas otras protenas que se han empleado ini-
cialmente como marcadores tumorales de cncer de prstata,
y que posteriormente se les ha dado una aplicacin forense.
Entre estos marcadores se encuentran la glicoprotena trans-
membranal denominada antgeno de membrana especfico
de prstata (PSMA), el pptido inhibitorio prosttico (PIP),
y el gen P-53.
Por ltimo, se ha reportado que la cuantificacin de zinc
en fluido vaginal es significativa para considerar la presencia
de fluido seminal.(22)
Anlisis molecular del DNA
En el caso concreto del fluido seminal, la obtencin del DNA
para su comparacin con la de los probables inculpados re-
presenta un problema tcnico, debido a que la muestra se en-
cuentra o se puede encontrar con una mezcla de clulas de
epitelio vaginal y de espermatozoides. Para su estudio se re-
quiere una extraccin del DNA partiendo de una lisis diferen-
cial.(23) Este mtodo se basa en las diferencias de empaqueta-
miento del DNA en la cabeza del esperma y en los ncleos de
las clulas del epitelio vaginal, debido a que el DNA del es-
permatozoide tiene puentes cruzados de protamina. Esta difi-
cultad es parcialmente resuelta con otros procedimientos, co-
mo el empleo de filtros con poros de 10 m, lo que da una
purificacin de espermatozoides del 98 al 99%.(24)
Los primeros en analizar un locus polimrfico caracteri-
zado por un nmero de fragmentos de restriccin variable en
el campo de las ciencias forenses fue Jeffreys y cols en 1985,
el mtodo empleado se denomina RFLPs (restriction fragment
length polymorphism).
La bsqueda de polimorfismos en DNA minisatlite con
RFLPs se basa en identificar la longitud de fragmentos de res-
L A B O R AT- ac ta Vo l . 18 N m. 2 2006
triccin, mediante digestin del DNA con enzimas de restric-
cin e hibridizacin con sondas especficas. En este mtodo
Identificacin forense de fluido seminal
se emplean sondas multilocus MLPs denominadas Huellas
de DNA (DNA fingerprints), o de un nico locus SLPs, tam-
bin llamadas Perfiles de DNA (DNA profiling).(25) El pro-
blema de estas tcnicas es que el DNA debe estar ntegro, y
debe haber en cantidad suficiente (cabellos, manchas de san-
gre, semen, etctera). Las clulas deben ser frescas o reciente-
mente muertas y sin daar.
Otra tcnica empleada en el estudio del DNA es el an-
lisis con la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), de
microsatlites STRs. La posibilidad de exclusin individual
de los marcadores empleados por PCR es menor que con las
sondas unilocus. El anlisis de polimorfismos por PCR es
muy amplio. Una ventaja de la reaccin en cadena de la po-
limerasa es que se puede realizar con muy pequeas cantida-
des de la muestra. El anlisis de DNA puede ser estudiado en
un solo locus (singleplex system) o al mismo tiempo ms de un
locus (multiplex system).
Despus de la amplificacin se emplean mtodos para se-
parar el DNA por su tamao, entre stos estn la electrofore-
sis en geles de agarosa y de poliacrilamida. Los geles de aga-
rosa separan molculas de 100 a 10 000 bases y se emplean
comnmente con VNTR (Variable number of tandem repeats),
mientras que los geles de poliacrilamida, que separan bien de
50 a 500 bases, son generalmente empleados para secuencias
cortas repetidas en tndem STRs (short tandem repeats). Otro
procedimiento altamente eficiente para separar las molculas
amplificadas de DNA, es el que utiliza la electroforesis capi-
lar en STRs con nucletidos fluorescentes.(26)
La variacin gentica que se busca es de longitud, em-
pleando STRs o variaciones de secuencia empleando polimor-
fismo en un solo nucletido SNPs (single nucleotide polymor-
phism).
En el anlisis molecular del DNA se utiliza un marca-
dor gentico que tenga un patrn de herencia bien conoci-
do, elevado polimorfismo (con muchas variaciones genticas,
de tal manera que la ms rara de las variantes de este gen no
pueda mantenerse a travs de una mutacin), con alto grado
de heterocigosidad, cuya herencia sea independiente de otros
genes, y con una tasa de mutacin baja. Existen tres tipos de
marcadores nucleares, los microsatlites, los minisatlites y los
de variacin de secuencia. En el DNA mitocondrial existen
slo dos marcadores polimrficos de variacin de secuencia
que corresponden a las regiones HVR1 y HVR2.
Hay marcadores tanto autosmicos dominantes como de
polimorfismos del cromosoma Y, de microsatlites (STRs) y
minisatlites (AMP-FLPs). Tambin hay polimorfismos de se-
cuencia como HLADQA1, y polimorfismos de DNA repeti-
do en tndem (MVR).(25)
Como ejemplo de los marcadores de STRs que se em-
plean en gentica forense estn los siguientes: HUMFES/
FPS, HUMF13A1, HUMTH01 TC11, HUMVWA31A,
45
 HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMACTBP2 SE33, y
D21S11.(27)
Gabriel Mayoral-Andrade y cols
Otros marcadores que han sido frecuentemente emplea-
dos en diversas poblaciones son los microsatlites D8S1179,
D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317,
D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51,
D5S818, FGA, adems de la Amelogenina; el D2S1338 y el
D19S433 proporcionan un alto nivel de discriminacin en
procedimientos forenses.(28,29)
Por ltimo, se recomienda que adicionalmente a los pro-
cedimientos de identificacin de espermatozoides o de fluido
seminal, se deba buscar alguna droga que se le haya adminis-
trado a la vctima. Actualmente se emplean con mayor fre-
cuencia sustancias que producen prdidas de la conciencia o
del control muscular, y que incluso algunas de ellas pueden
llevar a la muerte. Entre las drogas de mayor uso que deben
localizarse estn: etanol, benzodiazepinas, GHB, ketamina,
escopolamina, anfetaminas, cocana, y relajantes muscula-
res.(30)
REFERENCIAS
1. Luciana Ramos-Lira, Gabriela Saldvar-Hernndez, Mara Elena Medina-
Mora, Estela Rojas-Guiot, Jorge Villatoro-Velzquez. Prevalencia de abuso
sexual en estudiantes y su relacin con el consumo de drogas. Salud P-
blica Mx 1998; 40:221-33.
2. Ulloa-Ziarriz T, Rey-Trejo C, Olamendi TP. Papel de los rganos de impar-
ticin de justicia frente a la violencia intrafamiliar. En: Memorias del En-
cuentro Continental sobre Violencia Familiar. Unifem, Mxico, D.F. 1996.
3. Hilton J. Kobus; Edmund Silenieks, Jordana Scharnberg. Improving the
Effectiveness of Fluorescence for the Detection of Semen Stains on Fa-
brics. J Forensic Sci 2002; 47:1-5.
4. Santucci KA, Nelson DG, McQuillen KK, Duffy SJ, Linakis JG. Woods lamp
utility in the identification of semen. Pediatrics 1999; 104:1342-4.
5. Cindy W. Christian, Jane M. Lavelle, Allan R. De Jong, John Loiselle, Lewis
Brenner Mark Joffe. Forensic Evidence Findings in Prepubertal Victims of
Sexual Assault. Pediatrics 2000; 106:100-4.
6. Willott GM, Allard JE. Spermatozoa: their persistence after sexual inter-
course. Forensic Sci Int 1982; 19:135-54.
7. Nadia Khaldi, Alain Miras, Koffi Botti, Larbi Benali, Sophie Gromb. Evalua-
tion of Three Rapid Detection Methods for the Forensic Identification of
Seminal Fluid in Rape Cases. J Forensic Sci 2004; 49:1-5.
8. Randall B, Riis RE. Penile glycogenated epithelial cells as an indicator of
recent vaginal intercourse. Am J Clin Pathol 1985; 84:524-6.
9. Allery JP, Telmon N, Mieusset R, Blanc A, Rouge D. Cytological detection of
spermatozoa: comparison of three staining methods. J Forensic Sci 2001;
46:349-51.
10. Randall B. Glycogenated squamous epithelial cells as a marker of foreign
body penetrationin sexual assault. J Forensic Sci. 1988; 33:511-4.
46
11. Peta Stringer. Forensic sampling and DNA databases: background/is-
sues paper. Victorian Parliament Law Reform Committee. Victoria Foren-
sic Science Centre Forensic Drive. Victoria Aus. 2002.
12. Dale L. Laux Forensic Detection of Semen I. The Acid Phosphatase Test.
[07/11/2003]. Disponible de: http://mafs.net/pdf/laux1.pdf
13. Barnett PD, Blake ET, Super-Mihalovich J, Harmor G, Rawlinson L, Wraxa-
ll B. Discussion of Effects of presumptive test reagents on the ability to
obtain restriction fragment length polymorphism (RFLP) patterns from hu-
man blood and semen stains. J Forensic Sci 1992; 37:369-72.
14. Schumann GB, Badawy S, Peglow A, Henry JB. Prostatic acid phosphata-
se. Current assessment in vaginal fluid of alleged rape victims. Am J Clin
Pathol 1976; 66:944-52.
15. Findley TP. Quantitation of vaginal acid phosphatase and its relationship
to time of coitus. Am J Clin Pathol 1977; 68:238-42.
16. Schmidt S, Frnke M, Lehmann J, Loch T, Stockle M, Weichert-Jacobsen
K. Prostate-Specific antigen in female urine: A prospective study involving
217 women. Urology 2001; 57:717-20.
17. Breul J, Pickl U, Hartung R. Prostate-specific antigen in urine. Eur Urol 1994;
26: 18-21.
18. Simich JP, Morris SL, Klick RL, Rittenhouse-Diakun K. Validation of the use
of a commercially available kit for the identification of prostate specific an-
tigen (PSA) in semen stains. J Forensic Sci 1999; 44:1229-31.
19. Lovgren J, Valtonen-Andre C, Marsal K, Lilja H, Lundwall A. Measurement
of prostate-specific antigen and human glandular kallikrein 2 in different
body fluids. J Androl 1999; 20:348-55.
20. Hochmeister MN, Budowle B, Rudin O, Gehrig C, Borer U, Thali M, Dirn-
hofer R. Evaluation of antigen P-53 -specific antigen (PSA) membrane test
assays for the forensic identification of seminal fluid. J Forensic Sci 1999;
44:1057-60.
21. Chen JT, Hortin GL. Interferences with semen detection by an immunoas-
say for a seminal vesicle-specific antigen. J Forensic Sci 2000; 45:234-5.
22. Hooft P, van de Voorde H. Evaluation of the modified zinc test and the acid
phosphatase test as preliminary screening methods in sexual assault case
material. Forensic Sci Int 1992; 53:135-41.
23. Gill P, Jeffreys AJ, Werrett DJ. Forensic application of DNA fingerprints.
Nature 1985; 318:577-9.
24. Jian Chen, Lawrence Kobilinsky, Dora Wolosin, Robert Shaler, Howard
Baum. A Physical Method for Separating Spermatozoa from Epithelial. J
Forensic Sci 1998; 43:114-8.
25. Cal Teba ML. Anlisis de polimorfismos de ADN microsatlite de cromoso-
ma Y. Estudio de la poblacin de Galicia y aplicaciones forenses. Tesis de
Doctorado. Universidad de Santiago de Compostela. Facultad de Medici-
na. Instituto de Medicina Legal, Santiago de Compostela, Espaa, 2001.
26. National Commission on the Future of DNA Evidence. The Future of Fo-
rensic DNA Testing: Predictions of the Research and Development Wor-
king Group. (NCJ 183697) Department of Justice Office of Justice Progra-
ms. Washington, USA, November, 2000.
27. Morling N. Amplification of short tandem repeat loci using PCR. In: Linco-
ln PJ, Thomson J. Forensic DNA profiling protocols, Methods in Molecu-
lar Biology. Humana Press, USA, 1998.
28. Baiquan Yang, Gang Wang, Yichun Liu, Wensheng Yang. Population data
for the AmpF STR1 Identifiler TM PCR Amplification Kit in China Han in
Jilin Province, China. Forensic Sci Int 2005; 151:293-7.
29. Craig Leibelta, Bruce Budowleb, Patrick Collinsa, Yasser Daoudia, Tamyra
Morettic, Gary Nunna, Dennis Reedera, Rhonda Robya. Identification of a
D8S1179 primer binding site mutation and the validation of a primer de-
signed to recover null alleles. Forensic Sci Int 2003; 133:220-7.
30. LeBeau M., Andollo W, Hearn WL, Baselt, R, Cone E, Finkle B, Fraser D,
Jenkins A, Mayer J, Negrusz A, Poklis A, Raymon L, Robertson M, Saady J,
Recommendations for toxic logical investigations of drug-facilitated sexual
assaults. J Forensic Sci 1999; 44:227-30.
L AB O RAT- a cta Vo l. 18 N m . 2 2 0 0 6