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TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el ttulo de:
MICROBILOGO INDUSTRIAL
APROBADO
_______________________________
ANA KARINA CARRASCAL CAMACHO. MSc
Directora
_________________ __________________
NADENKA MELO ADRIANA PEZ
Jurado Jurado
ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIN TRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
APROBADO
______________________ ____________________
ANGELA UMAA MUOZ JANETH ARIAS PALACIOS
BIOLOGA PhD MICROBILOGA MSc.
Decana Acadmica Director de Carrera
AGRADECIMIENTOS
Lina Mara.
A Dios, por darme la sabidura, fuerza y paciencia en la
culminacin de este trabajo y de esta etapa de mi vida.
A mi mam y mi pap por esa confianza que depositaron en
m, por ser mis amigos y por darme todo su apoyo y amor.
A mi hermano por desearme lo mejor.
A Luis Gabriel Rivera Mora por ese amor y compaa
incondicionales.
A mis familiares y amigos por su inters.
A Lina, por su amistad, por su comprensin y por hacer
posible la finalizacin de este trabajo.
1. INTRODUCCIN ........................................................................................... 3
2. MARCO TERICO ......................................................................................... 5
2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos ................................................ 5
2.1.1 Mtodos de prevencin de enfermedades transmitidas por alimentos . 8
2.2 Tratamiento trmico .................................................................................. 8
2.2.1 Esterilizacin comercial ......................................................................... 9
2.2.2 Pasteurizacin ..................................................................................... 10
2.2.3 Causas de la muerte trmica y mecanismo de termorresistencia ........ 11
2.2.4 Valores D y Z ....................................................................................... 12
2.2.5 Factores que influyen sobre la determinacin de la termorresistencia. 13
2.2.6 Las conservas y el tratamiento trmico................................................ 13
2.2.7 Transmisin del calor en el alimento envasado ................................... 14
2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos ............................ 15
2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas ........... 16
2.3.2 Mtodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales
...................................................................................................................... 18
2.3.2.1 Mtodo de difusin en agar .............................................................. 19
2.3.2.2 Mtodo de dilucin ............................................................................ 19
2.4 Minthostachys mollis ............................................................................... 20
2.5 Listeria monocytogenes .......................................................................... 23
2.5.1 Generalidades ..................................................................................... 23
2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes .............................................. 24
2.6 Bacillus cereus ........................................................................................ 25
2.6.1 Generalidades ..................................................................................... 25
2.6.2 Termoresistencia de Bacillus cereus ................................................... 25
3. JUSTIFICACIN .......................................................................................... 28
4. OBJETIVOS ................................................................................................. 29
4.1 Objetivo general ...................................................................................... 29
4.2 Objetivos especficos .............................................................................. 29
5. MATERIALES Y MTODOS ........................................................................ 30
1
5.1. Obtencin de cepas ............................................................................... 30
5.2 Elaboracin del banco de clulas primario (BCP) ................................... 30
5.3 Curvas de crecimiento ............................................................................ 30
5.4 Evaluacin de la termorresistencia ......................................................... 32
5.4.1 Elaboracin de curvas de inactivacin trmica .................................... 32
5.4.2 Elaboracin de la salsa y evaluacin de termorresistencia en salsa. .. 32
5.5 Obtencin de la planta ............................................................................ 33
5.5.1 Obtencin del aceite esencial de Minthostachys mollis ....................... 33
5.6 Evaluacin de la actividad antimicrobiana. ............................................. 33
5.6.1 Mtodo difusin en agar con disco para bacterias ............................... 33
5.6.1.1. Preparacin del inculo ................................................................... 33
6. RESULTADOS Y DISCUSIN ..................................................................... 35
6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de clulas......................... 35
6.2 Cintica de crecimiento de Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. .. 37
6.3 Elaboracin de la conserva..................................................................... 41
6.4 Evaluacin de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus (en
caldo BHI y sobre alimento) .......................................................................... 43
6.4.1 Inactivacin trmica de L. monocytogenes .......................................... 43
6.4.2 Inactivacin trmica de Bacillus cereus ............................................... 46
6.5 Extraccin del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluacin de la
actividad antimicrobiana ...................................................................................
...................................................................................................................... 51
7. RECOMENDACIONES ................................................................................ 59
8. CONCLUSIONES ......................................................................................... 59
9. REFERENCIAS ............................................................................................ 60
Recursos electrnicos .................................................................................. 71
2
1. INTRODUCCIN
3
la tendencia actual a utilizar sustancias antimicrobianas debido a su conocido
efecto microbicida.
4
2. MARCO TERICO
5
Las enfermedades causadas por el consumo de alimentos contaminados tienen
un amplio impacto en la salud pblica y en la economa en todo el mundo
(Gandhi y Chikindas. 2007). Entre los factores asociados a estos cambios
globales se pueden sealar el crecimiento de la poblacin, la pobreza, la
urbanizacin en los pases subdesarrollados, el comercio internacional de
alimentos para humanos y animales as como tambin la aparicin de nuevos
agentes productores de ETA o nuevas mutantes con una mayor patogenicidad.
Otros factores importantes en cuanto a la manipulacin incorrecta de los
alimentos que contribuyen a los brotes producidos por estos se muestran a
continuacin en la figura 1 (McCabe-Sellers y Beattie. 2004). La temperatura
inadecuada es el principal factor reportado que contribuye a la transmisin de
enfermedades producidas por alimentos (Olsen, et al, 2000).
Figura 1. Factores que contribuyen a los brotes producidos por los alimentos a
partir de 1993 - 1997
Fuente: McCabe-Sellers y Beattie. 2004
6
Por esta y otras razones en pases latinoamericanos, donde estos problemas
se intensifican desde 1989, la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS)
ha estado trabajando con sus Estados Miembros para formar la capacidad
nacional de vigilancia de ETA. Las debilidades todava persisten en muchos
pases en la vigilancia epidemiolgica: notificacin de enfermedades, deteccin
e investigacin de los brotes y el anlisis de datos para la toma de decisiones
en las polticas y programas. Es por consiguiente difcil evaluar
adecuadamente la situacin de las ETA en la regin latinoamericana
(www.aam.org.ar). En el caso particular de Colombia y de la capital del pas,
las enfermedades transmitidas por alimentos constituyen un grave problema de
salud pblica (www.comunidadandina.org), pues se ha demostrado un
incremento en los ltimos aos. Entre 1991 y 1998 se han reportado 21443
casos individuales de ETA. En cuanto al reporte de brotes de las ETA, ha
mostrado un leve incremento desde 1998 hasta el ao 2000. Para 1998 fueron
reportados por el Sistema Alerta Accin un total de 28 brotes de ETA, y para
los siguientes dos aos un total de 35 y 37 brotes, con rangos de variacin de
dos a cuatrocientas personas afectadas (http://www.saludcapital.gov.co). Para
el 2007 se notificaron al sistema nacional de vigilancia 1594 casos de
enfermedades transmitidas por alimentos, lo que representa una disminucin
del 22.65 % con respecto al mismo periodo del ao anterior en el cual se
notificaron 2061 casos. Hasta el tercer periodo epidemiolgico del 2007, se
present el mayor nmero de casos, debido a la ocurrencia de cuatro brotes,
uno en el Municipio de Soledad (Atlntico) que aport 199 casos, otro en el
municipio de Tena (Cundinamarca) que aport 69 casos, otro en Maicao (La
Guajira) que aport 53 casos y otro en el municipio de Chinchin (Caldas) que
aport 48 casos de los 469 notificados en esa semana.
7
con el 4.27 %, Magdalena con el 4.20%, Boyac con el 4.14 % y en menor
porcentaje: Santander, Quindo, Meta, Valle, Huila, Vichada, Arauca, Cesar,
Casanare, Nario, Choc, Cauca, Putumayo, Amazonas, Barranquilla,
Risaralda, Norte de Santander, Cartagena. No notificaron casos de ETA:
Caquet, Guaina, Guaviare, San Andrs, Santa Marta, Tolima y Vaups.
Por lo anterior es necesario que la comunidad en general tenga y maneje
algunos elementos mnimos que le permita prevenir estas enfermedades.
(ttp://www.ins.gov.co).
Se han utilizado diversos procesos que tienen como fin evitar la proliferacin
microbiana en los alimentos, evitando as la aparicin de ETA. Dentro de los
mtodos de control ms utilizados se encuentran el tratamiento trmico
(pasteurizacin, esterilizacin), irradiacin (radiacin UV), almacenamiento a
bajas temperaturas (congelacin, refrigeracin), conservantes qumicos
(nitritos), conservacin por medio de sustancias naturales que poseen actividad
antimicrobiana, tales como los aceites esenciales derivados de plantas, entre
otros (Adams, 1997).
8
solamente una parte del proceso de conservacin, y suele aplicarse en
combinacin con otros procesos. Actualmente, el tratamiento trmico es uno
de los tratamientos que hacen posible la existencia de productos sanos de
larga vida comercial. El tratamiento trmico permite que las conservas se
puedan almacenar a temperatura ambiente garantizando su seguridad (Rees,
1994).
Las formas vegetativas de bacterias, levaduras y hongos se destruyen casi
instantneamente a 100C y normalmente no constituyen ningn problema en
el tratamiento trmico de las conservas, pero las esporas de ciertas especies
bacterianas son extraordinariamente resistentes al calor y para su destruccin
se necesita exponerlas, durante periodos prolongados de tiempo a altas
temperaturas. La velocidad de destruccin es funcin del tiempo y la
temperatura y varia con las diferentes especies; permaneciendo constantes los
dems factores, la destruccin es tanto mas rpida cuanto ms alta sea la
temperatura. Por ello, las condiciones letales para un microorganismo no
pueden expresarse diciendo que muere a tal temperatura, si no que es preciso
sealar un tiempo de exposicin a una temperatura determinada. (Herson,
1980).
9
La esterilizacin, como mtodo de conservacin se aplica con el fin de evitar la
entrada de microorganismos y de oxgeno. El objetivo de la conserva, cuyo
punto principal es la esterilizacin comercial, es destruir todos los
microorganismos patgenos que puedan existir en el producto y prevenir el
desarrollo de aquellos que puedan causar deterioro (Paltrinieri y Figuerola,
1993).
2.2.2 Pasteurizacin
10
2.2.3 Causas de la muerte trmica y mecanismo de termorresistencia
11
Por otro lado Powell y Starng comprobaron que la sal clcica del DPA
constituye hasta 15% del peso seco de la espora, pero no de las formas
vegetativas. Despus de la germinacin se libera esta sustancia con perdida
de termorresistencia. Otras teoras apoyan la explicacin que se basa en la
deshidratacin osmtica del protoplasma por la corteza que lo rodea, que es
expansible e impermeable a los cationes multivalentes. Las condiciones ms
rigurosas exigidas para la destruccin de las esporas por calor seco son
probablemente necesarias para los efectos deshidratantes suplementarios y la
temperatura mayor que la necesaria puede lesionar el DNA de la espora.
(Herson y Hulland, 1980).
2.2.4 Valores D y Z
12
tiempo de reduccin decimal, se puede calcular si la inactivacin trmica de las
pruebas se realiza con diferentes temperaturas (James, 2006). Estos dos
valores ofrecen la base para calcular el tiempo en los procesos del sector
alimenticio. (Rahmana, 2004).
Por otra parte, la disponibilidad del agua tiene tambin un gran impacto en la
transferencia del calor a los microorganismos. La influencia de la actividad de
agua en los microorganismos es compleja, combinando los factores intrnsecos
(el potencial nutritivo, el pH, y los compuestos antimicrobianos como el SO2,
nitratos, y nitritos) y factores extrnsecos (temperatura, oxgeno, tratamientos
qumicos, e irradiacin), que varan en funcin de las clases de alimentos y de
microorganismos. Los estudios han demostrado que la resistencia trmica de
microorganismos aumenta mientras que su contenido en agua disminuye y ese
nivel ptimo de la resistencia ocurre entre aw = 0.20 y 0.50, dependiendo del
microorganismo estudiado (Larochea et al, 2005).
13
conservadas (Sielaff, 2000). Durante el proceso es necesario, conservar las
cualidades organolpticas y nutritivas (Hersom y Hulland, 1980).
14
2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos
Muchas hierbas y especias han sido usadas durante siglos para proporcionar
sabores diferentes a los alimentos y stas pueden presentar tambin actividad
antimicrobiana (Ultee et al, 2002). Los compuestos responsables de esta
actividad son a menudo fracciones del aceite esencial, las cuales consisten
principalmente en compuestos fenlicos (Conner, 1993). Los aceites
esenciales de plantas y sus componentes que presentan actividad
antimicrobiana (Akgul y Kivanc, 1988), tienen gran aplicacin para el control del
crecimiento de patgenos de alimentos por lo que se utilizan como mtodo de
preservacin (Hao et al, 1998). Se ha reportado que la actividad
antimicrobiana se deriva de terpenoides y compuestos fenlicos en los aceites
(Yamazaki et al, 2003).
15
Los aceites esenciales comnmente se concentran en una regin particular
como hojas, corteza o frutos; y cuando esto ocurre en diferentes rganos en la
misma planta, frecuentemente su composicin es diferente (Oussalah et al,
2005). Aunque comnmente se piensa que son derivados de hierbas y
especias, estn presentes hasta cierto punto en muchas plantas con un papel
protector contra el ataque de bacterias, hongos o insectos. stos comprenden
principalmente monoterpenos, hidrocarburos cclicos y su alcohol, aldehdo o
derivados esteres.
Las plantas tienen una capacidad casi ilimitada para sintetizar sustancias
aromticas, siendo la mayora fenoles o sus derivados oxgeno sustitudos.
En general son metabolitos secundarios (es decir, que no tienen un papel
esencial en el metabolismo de las plantas) (Walton et al, 1999), de los cuales
por lo menos el 10% se han aislado. En muchos casos, estas sustancias
sirven a la planta como mecanismos de defensa contra el ataque de
microorganismos, insectos y herbvoros. Algunos como los terpenoides,
proporcionan a la planta sus olores, otros (quinonas y taninos) son
responsables del pigmento de la planta (Murphy, 1999).
16
Dentro de los compuestos presentes en los extractos vegetales que poseen
actividad antimicrobiana, se pueden mencionar el timol, el carvacrol, o el
eugenol; algunos autores como Conner en 1993, reportaron la alta actividad
antimicrobiana de stos compuestos en forma pura.
Por otra parte, el timol es un ismero del carvacrol que se ha visto implicado en
la desintegracin de la membrana externa y en el incremento de la
permeabilidad de la membrana citoplasmtica al ATP en clulas de Escherichia
coli y Salmonella thyphimurium. El timol y el cimol (precursor biosinttico del
timol) son ejemplos de preservativos naturales que han sido reportados por
tener efectos inhibitorios sobre bacterias y hongos (Delgado et al, 2003).
17
Otros son los terpenoides y aceites esenciales, los alcaloides, lecitinas y
polipptidos, entre otros (Murphy, 1999).
18
2.3.2.1 Mtodo de difusin en agar
19
* La concentracin mnima inhibitoria (MIC) o la mxima dilucin inhibitoria
(MID). La restriccin en el crecimiento de los microorganismos (anlisis de la
actividad bacteriosttica y fungisttica) o la concentracin mnima letal (MLC)
(anlisis de la actividad bactericida y fungicida) (Kalemba, 2003).
20
Figura 2. Fotografa de Minthostachys mollis
Fuente: Autores
21
Diferentes estudios de la composicin qumica del aceite esencial de
Minthostachys han reportado los compuestos carvacrol , pulegona, mentona,
isomentona, -pineno y limoneno, mentol en cantidades relativas que varan
desde 9.3% hasta 65.8% (Figura 3)
22
2.5 Listeria monocytogenes
2.5.1 Generalidades
23
2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes
Se sabe que las clulas contienen varios blancos para la accin trmica, pero
ha sido propuesto por Miller, et al (2006) que la resistencia basal de calor de
estos microorganismos podra ser debida a la estabilidad intrnseca de
macromolculas, o sea ribosomas, cidos nucleicos, enzimas y protenas
dentro de la clula y la membrana (Miller et al, 2006).
24
2.6 Bacillus cereus
2.6.1 Generalidades
25
su aislamiento de muchos alimentos crudos y procesados alrededor del mundo
(Claus y Berkeley, 1986).
26
mayor ser el tiempo necesario para llevar a cabo su destruccin (Hersom y
Hulland 1980).
27
3. JUSTIFICACIN
28
4. OBJETIVOS
29
5. MATERIALES Y MTODOS
Se trabaj con las cepas 146, 142, y 196 de Listeria monocytogenes aisladas
previamente de productos crnicos y la cepa de Bacillus cereus que se obtuvo
de una coleccin del cepario de la Pontificia Universidad Javeriana (Correa,
2004).
Durante los 6 meses del estudio se realizaron pruebas de pureza a las cepas
utilizadas; esto se hizo mediante tinciones de Gram.
30
mismo caldo para iniciar la curva de crecimiento, en el transcurso de este
tiempo se tomaron muestras del inculo, las dos primeras horas cada 15
minutos y despus de estas dos horas cada 30 minutos, este procedimiento
seguido de la medicin por duplicado de la absorbancia del inculo a 620 nm,
utilizando caldo BHI estril con glucosa al 0.5% como blanco, al finalizar las 12
horas, se observ que el cultivo alcanz la fase estacionaria (Romn, 2004.,
Rojas, 2007).
31
5.4 Evaluacin de la termorresistencia
32
las mismas temperaturas usadas durante la elaboracin de las curvas ya
mencionadas. Igualmente se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada
de cada tiempo y recuentos en agar TS para B. cereus y TSAYE para L.
monocytogenes. Para esto fue necesario pesar 10 g de salsa e inocularlos en
90 mL de agua peptonada para seguir haciendo las diluciones (Carrascal y col.
2003)
33
glucosa al 0.5% y se llevaron a incubacin durante 12 horas a 37C, 130 rpm.
En el caso de B. cereus, se inocul en 200 mL de caldo BHI adicionado con
almidn al 1% y se llev a incubacin durante 18 horas a 30C, 130rpm.
34
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
FECHA DE PRUEBA
14 de 20 de 17 de 10 de 22 de 8 de
Enero de Febrero Marzo de Abril de Mayo de Junio de
2007 de 2007 2007 2007 2007 2007
CEPA COLORACIN DE GRAM
L. Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
monocytogenes pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo
cdigo 146 positivo positivo positivo positivo positivo positivo
L. Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
monocytogenes pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo
cdigo 142 positivo positivo positivo positivo positivo positivo
L. Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
monocytogenes pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo
cdigo 196 positivo positivo positivo positivo positivo positivo
Bacillus cereus Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
positivo positivo positivo positivo positivo positivo
esporula- esporula- esporula-
do do do
35
Figura 4. Fotografa de coloracin de Gram de L. monocytogenes.
Fuente: Autores
36
utilizado en este caso, criopreservacin con glicerol, fue favorable ya que es un
mtodo que protege a las bacterias durante el almacenamiento en congelacin
(Lynn, 2004). El glicerol acta a nivel de membrana celular limitando el efecto
de la deshidratacin celular, disminuyendo el punto de congelacin de lquidos
biolgicos intra y extracelulares y promoviendo la vitrificacin en lugar de la
formacin de cristales de hielo intracelulares (Rojas, 2007).
37
microorganismos adquieren mayor resistencia; adems en esta fase se han
encontrado ciclos de divisin reductiva, incremento en la estabilidad del ARN y
en la resistencia a condiciones de estrs en bacterias patgenas (Arraz et al,
2002). Segn Robinson et al, 2001, las clulas en fase exponencial son
generalmente ms frgiles y susceptibles a la injuria que en la fase
estacionaria.
38
C u rva crecim ien to Listeria mon ocytogenes
C ep a 142 curva 2
0,8
Abs a 620 nm
0,6
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tie m po (hora s)
C u rv a c re c im ie n to L is te ria m o n o cy to ge n e s
C epa 196
1
0,8
Abs 620 nm
0,6
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
T ie m p o (h o ra s)
0,6
Abs 620 nm
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tie m po (hora s)
39
Por otra parte, B. cereus alcanz su fase estacionaria en un tiempo de 18 horas
como se puede observar en la figura 7. Al comparar los datos obtenidos en el
programa Combase predictor, donde B. cereus en condiciones ideales
alcanza la fase estacionaria en 12 horas, los resultados obtenidos en esta
investigacin difieren por la siguiente razn: el medio utilizado en el programa
es caldo tripticasa de soya, mientras que en este estudio se utiliz caldo BHI
suplementado con almidn, lo que podra explicar el alargamiento de la fase
logartmica; B. cereus posee amilasas que son activadas en presencia de
almidn, y como sucedi en este estudio, la cepa inici una segunda fase (fase
de diauxia), una vez terminado el consumo de glucosa en el medio, pues en
este caso tena dos sustratos alternativos (Fernndez, 1999). Es posible que si
en esta investigacin no se hubiera adicionado almidn al medio, la fase
estacionaria se hubiera obtenido en 12 horas. La razn por la que se adicion
almidn, fue simular las condiciones de las conservas donde se usan
almidones modificados que mantienen la estabilidad reolgica del producto,
pues este microorganismo causa deterioro en las conservas (Hersom y
Hulland, 1980) el cual se evidencia por la aparicin de vetas blancas y acidez
en el producto (Rees y Bettison, 1994).
40
Curva de crecimiento Bacillus cereus
0,6
0,5
Abs 620 nm
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (horas)
41
sabor deben ser propios del producto (Quintero, 2003). Con base en esto, se
seleccion la salsa nmero 10 y se descartaron las otras 10 obtenidas (anexo
3).
Ingrediente Cantidad
Tomate 150 g
Azcar 1g
Cebolla 5g
Ajo 0.5 g
Color 0.2 g
Agua 20 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 4g
Sal 0.1 g
42
6.4 Evaluacin de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus
(en caldo BHI y sobre alimento)
43
Otros factores que probablemente pudieron afectar la termorresistencia en la
conserva, fueron las sustancias antimicrobianas presentes en algunos de los
componentes de la salsa como son la cebolla, el ajo y la sal, pues se ha
reportado que estas sustancias poseen un efecto antimicrobiano. Se sabe que
existen diversos productos de origen botnico los cuales poseen una actividad
antimicrobiana como el ajo, organo, mostaza, canela, albahaca, tomillo,
pimienta, mejorana, chile, achiota, cebolla, cilantro, t, limn y naranja
(Barboza et al, 2004).
Otro factor que pudo verse implicado fue la tasa de calentamiento. Las tasas
de calentamiento rpidas o lentas, influyen en el grado de destruccin de L.
monocytogenes. En estudios realizados sobre muestras de cerdo molido
inoculado, se observ que un calentamiento lento (1.3C/min) permiti que una
44
mayor concentracin de L. monocytogenes sobreviviera, que en un
calentamiento rpido (Doyle, 2001).
10
9
8
7
Log UFC/mL
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
11
10
9
8
Log UFC /mL
7
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Tiempo (minutos)
52C 55C 57C
45
En cuanto a los valores D encontrados para L. monocytogenes en caldo BHI
(tabla 3) se observa que hubo una disminucin de stos a medida que la
temperatura aument, lo cual puede indicar que el proceso de inactivacin tuvo
los resultados esperados ya que con una mayor temperatura de exposicin
como lo es 57C se observa un mayor efecto sobre la viabilidad de la cepa y
por lo tanto se ver inhibido su crecimiento en un menor tiempo, esto puede
compararse con el anlisis estadstico que muestra una diferencia
estadsticamente significativa entre los valores de la temperaturas de 55 y 57
(tablas 4 y 5). De lo anterior, se podra concluir que el tratamiento con el que
ms rpido se destruye un ciclo logartmico en la poblacin de L.
monocytogenes corresponde a 57C durante 3.3 minutos.
46
Tablas 4 y 5. Comparacin de medias por temperaturas en caldo BHI (L.
monocytogenes).
Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 7.543851
Valor critico de t 1.99085
Mnima diferencia significativa 1.4882
Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 7.632015
Valor critico de t 1.99085
Mnima diferencia significativa 1.4969
47
en el caldo BHI entre 55C y las otras dos temperaturas (60 y 70C), esta
diferencia se podra explicar porque los datos para los valores D son tomados
manualmente lo que podra tener un mayor porcentaje de error, por lo cual en
el presente estudio se tuvo en cuenta el resultado obtenido mediante el anlisis
estadstico donde se confirma que es mejor un tratamiento a 60 o 70C, para
una industria de alimentos es de mayor utilidad aplicar 60C porque representa
menor costo. Otro punto clave para discutir estos resultados es que el
tratamiento trmico para B. cereus segn reportes, tiene una mayor efectividad
durante el desarrollo de las esporas porque aumenta la termorresistencia de los
microorganismos. Se han avanzado una serie de teoras en torno a la
diferencia entre las clulas vegetativas y las esporas. Una de esas teoras es
la que implica el papel del cido dipicolnico (DPA). Se ha descrito que la
termorresistencia de la espora se debe a que una gran porcin de su contenido
acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulacin
de la protena celular. La termorresistencia aumenta de forma gradual a
medida que la concentracin de agua del entorno disminuye (deshidratacin
del protoplasto de la espora). La gran resistencia de ciertas esporas en medios
acuosos exige que la cubierta esporular tenga una permeabilidad acuosa muy
baja, lo que es difcil por la permeabilidad de los materiales orgnicos, se ha
demostrado que existen diferencias en termorresistencia asociados al tamao
de la molcula que ejerce el pH cido (Martnez, 2007). (Herson y Hulland,
1980). Adems existen factores en el medio que afectan la resistencia trmica
de las esporas, como el pH, la naturaleza de los acidulantes, la temperatura y
la concentracin de NaCI (Laurent et al, 1999).
48
etanol o cido, lo que puede resultar en un incremento de la termotolerancia.
Igualmente, se ha reportado que en una gran variedad de bacterias, la
respuesta al choque trmico incluye el aumento de una serie de protenas del
choque trmico (HSPs). Estudios realizados por Derr et al, 1999 con B.
subtilis, concluyeron que los genes inducidos por calor son divididos en cuatro
clases diferentes segn sus mecanismos regulatorios; los genes de la clase II
son inducidos por estrs trmico y otras condiciones como sal o etanol.
Tambin se ha visto que la repuesta al choque trmico de las clulas de B.
subtilis preexpuestas a calor suave, producen esporas ms estables al calor
(Periago et al, 2002), esta preexposicin al calor puede corresponder a la
temperatura de incubacin utilizada en el presente estudio antes de la
exposicin a las diferentes temperaturas de evaluacin. Durante el desarrollo
de las esporas aumenta la termorresistencia de los microorganismos y por lo
tanto puede ser mas difcil su destruccin, por esta razn se puede decir que B.
cereus tuvo valores D constantes en las diferentes temperaturas evaluadas 55,
60 y 70 C, pues estas temperaturas no son suficientes para la destruccin de
las esporas, se ha reportado que la temperatura ptima para inactivar las
esporas es aproximadamente 90, 95 y 100 C, (Byrne et al, 2006) y que el
tratamiento trmico mnimo para productos procesados (90 -95 C por 6 10
minutos) usualmente no es suficiente para inactivar a todas las esporas
(Fernndez et al, 2002). En el caso de este estudio no se utilizaron estas
temperaturas tan altas, porque se pensaba combinar el efecto de la
temperatura con el agente antimicrobiano (aceite de M. mollis) y adems las
temperaturas altas hacen que se pierdan ms fcil los componentes por
volatilizacin. Asimismo se observa en la figura 7 que las concentraciones de
clulas iniciales vegetativas son altas, por lo cual se ve un decrecimiento ms
rpido del minuto 1 al 5, lo que explica los bajos valores D en estos primeros
minutos. Por otra parte, despus del minuto 5 se observa una tendencia ms
constante lo que puede hacer pensar que la cepa empieza a esporular en este
momento. Adems, debido a la naturaleza logartmica de la curva de muerte
trmica, cuanto mayor sea el nmero de esporas mayor ser el tiempo
necesario para llevar a cabo su destruccin (Hersom y Hulland, 1980) por esta
49
razn se evaluaron tiempos largos. Por todo lo anterior era recomendable la
evaluacin de la termorresistencia de B. cereus directamente sobre las esporas
sin la presencia de clulas vegetativas para dar una aproximacin mas cercana
a la temperatura ptima de inactivacin.
10
9
8
7
Log UFC/mL
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
55 C 60 C 70 C Tiempo (minutos)
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
50
Tabla 8. Valores D para B. cereus en caldo BHI y conserva
Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 3.464374
Valor critico de t 1.99085
Mnima diferencia significativa 0.975
Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 3.464374
Valor critico de t 1.99085
Mnima diferencia significativa 1.0085
51
6.6 Extraccin del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluacin
de la actividad antimicrobiana.
52
Tabla 14. Actividad antimicrobiana del aceite esencial (zona inhibicin en mm)
S: Cuando la CMI del antimicrobiano para una bacteria se puede conseguir in vivo a dosis teraputicas.
R: Cuando el microorganismo no es inhibido por las concentraciones que normalmente se pueden obtener
en el sito de infeccin.
53
planta, el cual se mostr inactivo y no tuvo inhibicin como se demuestra (tabla
14) pues no hubo presencia de halos en ninguna de las cepas analizadas,
mostrando la resistencia de estos microorganismos al aceite con la
concentracin utilizada para L. monocytogenes y B. cereus (tabla 15).
54
actividad ATPasa en la membrana celular. Tambin se ha encontrado que este
tipo de agentes pueden inhibir la generacin de adenosina trifosfato de
dextrosa y afectar la membrana y que concentraciones de carvacrol de 5 a 10
mM tienen actividad bactericida frente a L. monocytogenes (Gill y Holley, 2006).
55
Erwinia amylovora en concentraciones ms bajas (103 UFC/ml), otros
compuestos como la -pinona en 107 UFC/ml. y para otros componentes no
se ha encontrado. (Kalemba y Kunicka, 2004).
Otra de las posibles razones por las que no se obtuvo un efecto antimicrobiano
del aceite esencial, fue porque el mtodo utilizado para evaluar la actividad no
fue el mejor; pues se ha reportado que el mtodo de difusin en agar es
inadecuado para aceites esenciales, sus componentes voltiles se pueden
evaporar con el solvente de dispersin durante el tiempo de incubacin,
mientras que sus componentes mas solubles no se difunden bien en el agar.
No obstante, es la tcnica ms comn para evaluar actividad antibacteriana y
antifngica de aceites esenciales porque es mas fcil llevarla a cabo y requiere
solo pequeas cantidades del aceite esencial (Kalemba and Kunicka 2003).
56
Adicionalmente, el uso de aceites esenciales en el sector alimenticio es a
menudo limitado debido a que las dosis antimicrobianas eficaces pueden
exceder niveles aceptables (Kalemba y Kunicka, 2004).
Por ltimo, si bien los extractos obtenidos a partir de M. mollis han resultado
eficientes frente a fitopatgenos, en este caso no tienen una actividad
57
antimicrobiana que ameriten seguir con su investigacin para uso en industria
de alimentos.
7. RECOMENDACIONES
58
8. CONCLUSIONES
59
9. REFERENCIAS
60
growth of Listeria monocytogenes at low temperatures. Appl. Environ.
Microbiol. 63 (10), pg 38873894.
61
CANTN, A., LULL, C., PRIMO,J., MIRANDA,M., PRIMO-YFERA,E.
(2001). Isolation, structural assignment and insecticidal activity of (-)-
(1S,2R,3R,4S)-1,2-epoxy-1-methyl-4-(1-methylethyl)-cyclohex-3-yl
acetate, a natural product from Minthostachys tomentosa. Tetrahedron:
Asymmetr,y p 677683
62
DELGADO., B., FERNNDEZ, A., PERIAGO, P. 2003. Effect of thymol
and cymene on Bacillus cereus vegetative cells evaluated through the
use of frequency distributions. Food Microbiology, p 327334
63
GILL, A., HOLLEY, R. 2006. Inhibition of membrane bound ATPases of
Escherichia coli and Listeria monocytogenes by plant oil aromatics.
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KARAPINAR, M., AND AKTUNG, S. E. (1987). Inhibition of foodborne
pathogens by thymol, eugenol, menthol and anethole. International
Journal of Food Microbiology, 4, pg161166.
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solutes used to control water activity of the heating medium. International
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and death in the United States. Emerg. Infect. Dis. 5 (5), 607625.
66
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CANNATELLI., M. PIZZIMENTI., F. CIONI.,P. PROCOPIO., F. AND
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Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms.
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OMER EA, KHATTAB ME, IBRAHIM ME. 1998. First cultivation trial of
Perilla frutescens L. in Egypt. Flavour Fragr J;13:221-5.
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distributions in canned tomato based dip during industrial pasteurization.
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Netherlands. Letters in Applied Microbiology, p 166-170
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68
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702001.163173
69
TORRES, K., POUTOU, R., CARRASCAL, A., SIERRA, S., MERCADO,
M. 2004. Validacin de PCR para deteccin de Listeria monocytogenes
en carnes crudas de carne, res y pollo. Bogot, Colombia, p 414-427.
70
Recursos electrnicos
71
hortalizas a pequea escala en Per <
http://www.fao.org/docrep/x5063S/x5063S03.htm> [Consulta 14 de junio
de 2007].
72
ANEXO 1
73
ANEXO 2
74
ANEXO 3
Salsa nmero 1
Ingrediente Cantidad
Tomate 50 g
Cebolla 6.3 g
Ajo 0.8 g
Color 0.3 g
Agua 100 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 3.5 g
Sal 0.3g
Salsa nmero 2
Ingrediente Cantidad
Tomate 100.9 g
Cebolla 5.3 g
Ajo 0.8 g
Color 0.3 g
Agua 50 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 6.7 g
Sal 0.3 g
Salsa nmero 3
Ingrediente Cantidad
Tomate 100.5 g
Cebolla 5.1 g
Ajo 0.5 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 5.1 g
Sal 0.3g
75
Salsa nmero 4
Ingrediente Cantidad
Tomate 112.3 g
Cebolla 5.1 g
Ajo 0.5 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Sal 0.3g
Salsa nmero 5
Ingrediente Cantidad
Tomate 100.8 g
Azcar 3g
Cebolla 3g
Ajo 0.5 g
Color 0.1 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 6.9 g
Sal 0.3g
Salsa nmero 6
Ingrediente Cantidad
Tomate 100 g
Azcar 4g
Cebolla 3.2 g
Ajo 0.5 g
Color 0.1 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 7.3 g
Sal 0.3g
Salsa nmero 7
Ingrediente Cantidad
Tomate 70 g
Azcar 3g
Cebolla 2g
Ajo 0.2 g
Color 0.1 g
76
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 10 g
Sal 0.3g
Salsa nmero 8
Ingrediente Cantidad
Tomate 150 g
Azcar 4g
Cebolla 2.5 g
Ajo 0.2 g
Color 0.1 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 7g
Sal 0.3g
Salsa nmero 9
Ingrediente Cantidad
Tomate 100 g
Azcar 1g
Cebolla 3g
Ajo 0.4 g
Color 0.1 g
Agua 20 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 9g
Sal 0.3 g
Salsa nmero 11
Ingrediente Cantidad
Tomate 150 g
Cebolla 5g
Ajo 0.5 g
Agua 10 mL
Aceite 2 mL
Sal 0.3 g
77
ANEXO 10
14 55 10 2 5.00
15 55 15 2 4.00
16 55 20 2 4.00
17 55 30 2 3.47
18 55 60 2 2.00
19 55 0 3 8.87
20 55 1 3 7.30
21 55 2 3 7.00
22 55 5 3 6.47
23 55 10 3 6.17
24 55 15 3 5.69
25 55 20 3 5.36
26 55 30 3 3.60
27 55 60 3 2.00
28 60 0 1 6.95
29 60 1 1 7.00
30 60 2 1 4.47
31 60 5 1 2.00
32 60 10 1 2.47
33 60 15 1 2.30
34 60 20 1 2.76
35 60 30 1 2.00
36 60 60 1 2.30
37 60 0 2 6.95
38 60 1 2 5.20
39 60 2 2 4.00
40 60 5 2 3.66
41 60 10 2 3.27
42 60 15 2 2.90
43 60 20 2 2.47
44 60 30 2 2.72
45 60 60 2 2.17
46 60 0 3 6.95
47 60 1 3 6.49
48 60 2 3 4.60
49 60 5 3 3.23
50 60 10 3 2.84
51 60 15 3 2.17
52 60 20 3 2.00
----------------------------------------------------------------------------------------
78
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 127
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
53 60 30 3 2.95
54 60 60 3 2.00
55 70 0 1 6.23
56 70 1 1 5.90
57 70 2 1 4.30
58 70 5 1 3.69
59 70 10 1 3.39
60 70 15 1 2.30
61 70 20 1 2.07
62 70 30 1 1.90
63 70 60 1 1.47
64 70 0 2 6.23
65 70 1 2 5.00
66 70 2 2 4.60
67 70 5 2 3.77
68 70 10 2 3.14
69 70 15 2 3.00
70 70 20 2 2.83
71 70 30 2 2.82
72 70 60 2 2.00
73 70 0 3 6.23
74 70 1 3 5.30
75 70 2 3 4.30
76 70 5 3 3.00
77 70 10 3 3.30
78 70 15 3 3.00
79 70 20 3 3.00
80 70 30 3 1.00
81 70 60 3 1.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 128
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
Class Level Information
TEM 3 55 60 70
TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F
Model 2 59.4546889 29.7273444 9.18
0.0003
79
Error 78 252.5620667 3.2379752
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 130
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
80
ANEXO 11
81
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 132
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
53 60 30 3 1.60
54 60 60 3 0.00
55 70 0 1 6.23
56 70 1 1 6.07
57 70 2 1 5.30
58 70 5 1 4.69
59 70 10 1 4.39
60 70 15 1 3.78
61 70 20 1 3.60
62 70 30 1 2.07
63 70 60 1 2.00
64 70 0 2 6.23
65 70 1 2 5.00
66 70 2 2 4.60
67 70 5 2 3.77
68 70 10 2 3.47
69 70 15 2 3.00
70 70 20 2 2.83
71 70 30 2 1.30
72 70 60 2 1.00
73 70 0 3 6.23
74 70 1 3 5.30
75 70 2 3 4.30
76 70 5 3 3.95
77 70 10 3 3.85
78 70 15 3 3.60
79 70 20 3 2.77
80 70 30 3 2.34
81 70 60 3 1.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 133
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
TEM 3 55 60 70
TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 134
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F
82
R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean
---------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
83
ANEXO 12
84
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 07:11 Thursday, October
14, 2007 2
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
----------------------------------------------------------------------------------------
53 55 30 3 6.00
54 55 60 3 0.00
55 57 0 1 9.84
56 57 1 1 9.00
57 57 2 1 9.00
58 57 5 1 8.69
59 57 10 1 8.00
60 57 15 1 8.32
61 57 20 1 7.49
62 57 30 1 6.00
63 57 60 1 6.00
64 57 0 2 9.84
65 57 1 2 9.69
66 57 2 2 9.69
67 57 5 2 9.47
68 57 10 2 8.77
69 57 15 2 8.60
70 57 20 2 7.20
71 57 30 2 6.00
72 57 60 2 6.00
73 57 0 3 9.84
74 57 1 3 9.30
75 57 2 3 8.95
76 57 5 3 8.60
77 57 10 3 8.30
78 57 15 3 8.23
79 57 20 3 6.77
80 57 30 3 6.00
81 57 60 3 0.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 07:11 Thursday, October
14, 2007 3
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F
85
Corrected Total 80 650.0940469
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
86
ANEXO 13
87
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 132
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
----------------------------------------------------------------------------------------
53 60 30 3 1.60
54 60 60 3 0.00
55 70 0 1 6.23
56 70 1 1 6.07
57 70 2 1 5.30
58 70 5 1 4.69
59 70 10 1 4.39
60 70 15 1 3.78
61 70 20 1 3.60
62 70 30 1 2.07
63 70 60 1 2.00
64 70 0 2 6.23
65 70 1 2 5.00
66 70 2 2 4.60
67 70 5 2 3.77
68 70 10 2 3.47
69 70 15 2 3.00
70 70 20 2 2.83
71 70 30 2 1.30
72 70 60 2 1.00
73 70 0 3 6.23
74 70 1 3 5.30
75 70 2 3 4.30
76 70 5 3 3.95
77 70 10 3 3.85
78 70 15 3 3.60
79 70 20 3 2.77
80 70 30 3 2.34
81 70 60 3 1.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 133
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
TEM 3 55 60 70
TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F
88
----------------------------------------------------------------------------------------
R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
89
ANEXO 8
MEDIOS DE CULTIVO
Polipeptona 20.0
Extracto de levadura 3.0
Almidn 1.0
Cloruro sdico 5.0
Citrato frrico amoniacal 0.5
Esculina 1.0
Cloruro de litio 15
Agar bacteriolgico 13
90